CN106636059A - 一种固定化石油降解酶制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化石油降解酶制剂的制备方法,包括以下步骤:(a)通过模板法合成孔道均一的新型中孔炭;(b)将石油降解酶通过吸附固定于新型中孔炭制得固定化石油降解酶制剂。本发明利用新型中孔炭来固定石油降解酶,新型中孔炭材料较大的比表面积和丰富的孔道结构有利于固定酶的传质作用,与酶的催化作用协同大大提高了石油污染的降解效率,通过抽滤回收提高了酶的重复利用率,具有良好的环境效益。
Description
技术领域
本发明属于石油泄漏应急处理领域,特别涉及一种新型中孔炭固定化的石油降解酶制剂的制备方法。
背景技术
近年来,重大石油污染事故频发,尤其是运输过程中的事故溢油。石油污染是水体环境第二大类污染源,对水体生态环境及水生动植物健康产生极大影响。研究表明,当水体中石油浓度超过1.0 mg/L时,会造成浮游藻类大量死亡。鉴于石油污染对水体环境及水生动植物的损害,因此,如何快速高效地解决水体石油污染问题十分必要。目前,国内外针对石油泄漏的主要解决方法包括物理法、化学法及微生物法。与物理法及化学法相比,微生物法因具有运行稳定、操作简便、不易产生二次污染等特点,而倍受研究者青睐。
生物法包括微生物降解和酶降解,与微生物修复相比,直接利用从微生物细胞内提取石油降解酶直接降解受污染水体中的石油,可大大提高降解效率,缩短修复周期。酶修复具有微生物修复所不能比拟的诸多优势,如不存在代谢抑制剂、能应用于苛刻的环境条件、不存在与土著微生物的竞争等。但是游离酶因稳定性差、难以回收、易混入样品和不易循环利用等缺点使其应用受到限制,通过一定方法将游离酶固定于载体后,能够克服游离酶的缺点。虽然对其进行了一系列的物理化学处理,但是其仍具有相对较高酶活性,固定化酶具有可反复利用、易于分离、稳定性高、具有一定程度的机械强度及更便于使用推广等优点,具有广阔的应用前景。对酶的固定化技术一般分为吸附法、交联法、共价键结合法、包埋法、定向固定等,其中物理吸附法相比其余几种技术具有操作简便、条件温和、不会引起酶的变异失活等特点。早期固定化酶应用的无机载体主要分为有膨润土、氧化铝、玻璃和海藻石等,这些材料由于受到孔径、比表面积、颗粒粒度等因素的限制,结合酶的能力颇低。活性炭作为水处理实践过程中常用的吸附材料,具有强吸附性能,易于回收等优点。但是其无序、闭合的孔道结构限制其对大分子化合物的吸附。石油降解酶一般均为大分子化合物,因此,制备一种具有开放、有序的中孔炭吸附材料十分必要。目前,关于利用中孔炭固定石油降解酶在石油泄漏事故中的应用还未见文献报道。
发明内容
为了克服现有技术中的不足,本发明提供了
为了解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:
一种固定化石油降解酶制剂的制备方法 ,其特征在于,包括以下步骤:(a)通过模板法合成孔道均一的新型中孔炭材料;(b)将石油降解酶通过吸附固定于新型中孔炭制得石油泄漏降解酶制剂。
作为优选,所述新型中孔炭的合成方法为:将模板浸渍在含有碳源的溶液中,搅拌均匀,经高温碳化后采用氢氟酸去除模板制得新型中孔炭。
作为优选,所述模板为SBA-15分子筛,所述碳源为蔗糖。
作为优选,所述新型中孔炭的具体制备方法为:先将SBA-15分子筛模板烘干,将烘干后的SBA-15分子筛模板浸渍在蔗糖、浓硫酸和去离子水的混合溶液中,搅拌均匀后在80~120℃下加热2~4小时以蒸干水分,再升温至150~170℃下聚合5~8小时得到褐色固体,研磨至粉状,加入蔗糖、浓硫酸和去离子水重复上述步骤进行第二次沉积,经二次沉积的聚合物转入石英管式炉中在高纯氮气气氛下加热800~850℃碳化5~6小时,研磨后用质量分数4~6%的氢氟酸洗涤去除模板,最后用乙醇及大量蒸馏水洗涤,烘干即可。
作为优选, SBA-15分子筛模板与蔗糖的质量比为1:1~1:1.7,蔗糖、浓硫酸和去离子水的混合溶液混合溶液中pH值为0.3~1,蔗糖的浓度为0.48~1.0 mol/L。
作为优选,所述新型中孔炭其孔径为4.0~30 nm,孔容为 0.20~2.00 cm3/g,比表面积为 900~3000 m2/g。
作为优选,步骤(b)具体为:首先将驯化富集的石油降解微生物经细胞破碎得到粗酶液,将新型中孔炭与粗酶液搅拌固定得到混合液,随后将混合液抽滤并用缓冲液洗涤,真空冷冻干燥之后得到固定化石油降解制剂。
作为优选,新型中孔炭与粗酶液搅拌固定的反应条件为在4℃下搅拌4~8h,搅拌转速为 50~ 400rpm。
作为优选,所述新型中孔炭与粗酶液的质量比为1:1~3。
作为优选,所述粗酶液的pH为6~8,初始浓度为1~2 mg/ml。
本发明的有益效果是:
本发明以新型中孔炭为吸附剂,吸附固定石油降解酶制备成石油泄漏修复酶制剂,吸附降解去除水中的石油污染时,表现出显著优于传统修复方法的卓越性能,无二次污染、降解效率高,易于重复利用。此外,本发明操作简单,处理效果显著。因此,本发明用于去除石油泄漏等突发事故中石油污染的水体,具有良好的经济和环境效益。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述。
实施例 1
一种固定化石油降解酶制剂的制备方法及使用方法,包括以下步骤:
A. 制备新型中孔炭:将1 g SBA-15浸渍在含1.25 g蔗糖、0.14 g浓硫酸的5 g水溶液中,搅拌均匀后在100℃下加热6小时以蒸干水分;然后在160℃下聚合6小时得到褐色固体,研磨至粉状。为了得到更好的聚合和炭化效果,随后按照上述步骤进行第二次沉积,其中蔗糖、浓硫酸和水的质量分别为0.8 g、0.09 g和5 g。将二次沉积的聚合物在氮气保护下850℃碳化5小时,研磨后用质量分数5 %的氢氟酸洗涤去除模板,最后用乙醇及大量蒸馏水洗涤,100℃烘干即可。得到的新型中孔炭的孔径为30 nm,孔容为 1.98 cm3/g,比表面积为2996 m2/g;
B. 制备新型中孔炭固定化的石油降解酶:称取100 mg合成的新型中孔炭材料,将其加入到pH=7.4、初始浓度为1.6 mg/ml、体积为100mL的经低温细胞破碎后得到的石油降解酶粗酶液中,冰浴条件下,搅拌转速为300rpm,搅拌混合6 h后,将固定好的石油降解酶进行离心,并用pH=7.4缓冲液洗涤两到三次,最后再用去离子水清洗一次后抽滤,经真空冷冻干燥制得固定化石油降解酶制剂;
C. 降解石油 :将1 g上述固定化石油降解酶制剂加入2000 mL 浓度为5g/L的石油废水中,控制温度在 25℃,降解10 h,然后分离回新型中孔炭固定化的石油降解酶。经测定,石油降解率达到80 %。
实施例 2
一种固定化石油降解酶制剂的制备方法及使用方法,包括以下步骤:
A. 制备新型中孔炭:将1 g SBA-15浸渍在含1.15 g蔗糖、0.10g浓硫酸的6 g水溶液中,搅拌均匀后在100℃下加热3小时以蒸干水分;然后在160℃下聚合6小时得到褐色固体,研磨至粉状。为了得到更好的聚合和炭化效果,随后按照上述步骤进行第二次沉积,其中蔗糖、浓硫酸和水的质量分别为0.7 g、0.05 g和4.5 g。将二次沉积的聚合物在氮气保护下850℃碳化5小时,研磨后用质量分数5 %的氢氟酸洗涤去除模板,最后用乙醇及大量蒸馏水洗涤,100℃烘干即可。得到的新型中孔炭的孔径为10 nm,孔容为 1.26 cm3/g,比表面积为1438 m2/g;
B. 制备新型中孔炭固定化的石油降解酶:称取100 mg合成的新型中孔炭材料,将其加入到pH=7.0、初始浓度为1.2 mg/ml、体积为150mL的经低温细胞破碎后得到的石油降解酶粗酶液中,冰浴条件下,搅拌转速为200rpm,搅拌混合4 h后,将固定好的石油降解酶进行离心,并用pH=7.0缓冲液洗涤两到三次,最后再用去离子水清洗一次后抽滤,经真空冷冻干燥制得固定化石油降解酶制剂;
C. 降解石油 :将1 g上述固定化石油降解酶制剂加入2500 mL 浓度为5g/L的石油废水中,控制温度在 25℃,降解8 h,然后分离回新型中孔炭固定化的石油降解酶。经测定,石油降解率达到70 %。
实施例 3
一种固定化石油降解酶制剂的制备方法及使用方法,包括以下步骤:
A. 制备新型中孔炭:将1 g SBA-15浸渍在含1.50 g蔗糖、0.20 g浓硫酸的5 g水溶液中,搅拌均匀后在100℃下加热3小时以蒸干水分;然后在160℃下聚合6小时得到褐色固体,研磨至粉状。为了得到更好的聚合和炭化效果,随后按照上述步骤进行第二次沉积,其中蔗糖、浓硫酸和水的质量分别为1.0 g、0.1 g和5 g。将二次沉积的聚合物在氮气保护下850℃碳化5小时,研磨后用质量分数5 %的氢氟酸洗涤去除模板,最后用乙醇及大量蒸馏水洗涤,100℃烘干即可。得到的新型中孔炭的孔径为20 nm,孔容为 1.58 cm3/g,比表面积为 1925m2/g;
B. 制备新型中孔炭固定化的石油降解酶:称取100 mg合成的新型中孔炭材料,将其加入到pH=7.4、初始浓度为1.5 mg/ml、体积为80 mL的经低温细胞破碎后得到的石油降解酶粗酶液中,冰浴条件下,搅拌转速为100rpm,搅拌混合8 h后,将固定好的石油降解酶进行离心,并用pH=7.4缓冲液洗涤两到三次,最后再用去离子水清洗一次后抽滤,经真空冷冻干燥制得固定化石油降解酶制剂;
C. 降解石油 :将1 g上述固定化石油降解酶制剂加入3000 mL 浓度为5g/L的石油废水中,控制温度在 25℃,降解12 h,然后分离回新型中孔炭固定化的石油降解酶。经测定,石油降解率达到75 %。
实施例 4
一种固定化石油降解酶制剂的制备方法及使用方法,包括以下步骤:
A. 制备新型中孔炭:将1 g SBA-15浸渍在含1.0 g蔗糖、0.06 g浓硫酸的6 g水溶液中,搅拌均匀后在80℃下加热2小时以蒸干水分;然后在150℃下聚合5小时得到褐色固体,研磨至粉状。为了得到更好的聚合和炭化效果,随后按照上述步骤进行第二次沉积,其中蔗糖、浓硫酸和水的质量分别为0.8 g、0.09 g和5 g。将二次沉积的聚合物在氮气保护下800℃碳化5小时,研磨后用质量分数4 %的氢氟酸洗涤去除模板,最后用乙醇及大量蒸馏水洗涤,100℃烘干即可。得到的新型中孔炭的孔径为4 nm,孔容为 0.20 cm3/g,比表面积为900 m2/g;
B. 制备新型中孔炭固定化的石油降解酶:称取100 mg合成的新型中孔炭材料,将其加入到pH=6、初始浓度为1 mg/ml、体积为300mL的经低温细胞破碎后得到的石油降解酶粗酶液中,冰浴条件下,搅拌转速为400rpm,搅拌混合4 h后,将固定好的石油降解酶进行离心,并用pH=7.4缓冲液洗涤两到三次,最后再用去离子水清洗一次后抽滤,经真空冷冻干燥制得固定化石油降解酶制剂;
C. 降解石油 :将1 g上述固定化石油降解酶制剂加入2000 mL 浓度为5g/L的石油废水中,控制温度在 25℃,降解10 h,然后分离回新型中孔炭固定化的石油降解酶。经测定,石油降解率达到70%。
实施例5
一种固定化石油降解酶制剂的制备方法及使用方法,包括以下步骤:
A. 制备新型中孔炭:将1 g SBA-15浸渍在含1.70 g蔗糖、0.25g浓硫酸的5g水溶液中,搅拌均匀后在120℃下加热4小时以蒸干水分;然后在170℃下聚合8小时得到褐色固体,研磨至粉状。为了得到更好的聚合和炭化效果,随后按照上述步骤进行第二次沉积,其中蔗糖、浓硫酸和水的质量分别为1.0 g、0.1 g和5 g。将二次沉积的聚合物在氮气保护下850℃碳化6小时,研磨后用质量分数6%的氢氟酸洗涤去除模板,最后用乙醇及大量蒸馏水洗涤,100℃烘干即可。得到的新型中孔炭的孔径为16 nm,孔容为 1.59 cm3/g,比表面积为 1954m2/g;
B. 制备新型中孔炭固定化的石油降解酶:称取100 mg合成的新型中孔炭材料,将其加入到pH=8、初始浓度为2 mg/ml、体积为80 mL的经低温细胞破碎后得到的石油降解酶粗酶液中,冰浴条件下,搅拌转速为 50rpm,搅拌混合8 h后,将固定好的石油降解酶进行离心,并用pH=7.4缓冲液洗涤两到三次,最后再用去离子水清洗一次后抽滤,经真空冷冻干燥制得固定化石油降解酶制剂;
C. 降解石油 :将1 g上述固定化石油降解酶制剂加入3000 mL 浓度为5g/L的石油废水中,控制温度在 25℃,降解12 h,然后分离回新型中孔炭固定化的石油降解酶。经测定,石油降解率达到75 %。
对比例 1
以游离的石油降解酶作为对比,对上述制得的固定化石油降解酶制剂和游离的石油降解酶进行温度的适应范围进行对比试验。
温度的适应范围:分别在不同温度条件下测定游离偶氮还原酶和固定化的偶氮还原酶的酶活力,如表1所示,由表1可知,游离酶在0~50℃,酶相对活性较高(70%以上),温度超过50℃时,蛋白质迅速变性,酶活显著降低,酶的催化能力下降;与之对比,固定化酶在0~50℃温度下,酶的相对活性较游离酶有所提升,且在60℃时,仍然保持相对较高的酶活。说明固定化酶与游离酶相比,更能适应温度复杂的现实环境。(表中温度的单位是℃,相对活性以%表示)
表1不同温度条件下游离石油降解酶和固定化石油降解酶制剂的相对活性
对比例 2
研究不同石油添加量条件下固定化石油降解酶对石油的降解效率。
将100 mg上述固定化酶制剂分别加入浓度分别为1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L 和10 g/L的石油污水中,室温下降解10 h,然后分离回收固定化酶制剂。测定上清液中石油浓度的变化,进而计算石油降解酶制剂对不同初始浓度石油的降解效率。
如表 2 所示,由表可知,固定化酶在石油添加量为1 g/L时对石油的降解效率最高超过92 %,当石油添加量为10 g/L时,降解率降至45 %左右。表明石油添加量较低时,新型中孔炭固定化的石油降解酶制剂对石油的降解率较高。
表 2不同石油初始浓度条件下固定化石油降解酶制剂的降解率
对比例 3
研究不同温度条件下新型中孔炭固定化石油降解酶对石油的降解效率。
将100 mg上述固定化酶制剂加入浓度为5 g/L的石油污水中。并分别于20℃、30℃、35℃、40℃下降解10 h,然后分离回收新型中孔炭固定化石油降解酶制剂,通过测定剩余石油含量来计算石油降解率。
如表3所示,由表可知,固定化酶在20℃~40℃的温度范围内,降解率变化不大,均能达到70%以上。其中30℃条件下酶活性最强,降解率最大。温度过低,酶活性未完全激活,温度过高,部分酶失去活性。
表 3不同温度条件下固定化石油降解酶的降解率
对比例 4
研究不同反应时间条件下新型中孔炭固定化石油降解酶对石油的降解效率。
将100 mg上述固定化酶制剂加入浓度为5 g/L的石油污水中。在30℃条件下分别并分别振荡3 h,6 h,10 h,24 h后回收固定化酶制剂,然后分离回收新型中孔炭固定化石油降解酶制剂,通过测定剩余石油含量来计算石油降解率。
如表4所示,经测定,固定化酶对石油的降解效率跟时间成正比关系,即降解时间越长,石油降解效率越高,但随时间的延长,降解率趋于平衡,当降解时间到10 h时,石油降解基本完成。待进行到10 h时再测,降解率并未有较大变化。
表 4 不同降解时间条件下新型中孔炭固定化石油降解酶的降解率
对比例5
研究固定酶的重复使用对固定化石油降解酶制剂降解效率的影响。
将5 g上述固定化石油降解酶制剂加入配置好的石油废水中,初始浓度为50mg/L,pH值为6.5,控制温度在30℃,以150 rpm的转速在恒温培养中振荡持续6 h,用分光光度计测量剩余石油的浓度,然后通过抽滤分离回收固定化酶,将回收的固定化酶制剂重新加入新的上述溶液中,同样的反应过程测定剩余石油浓度,如此循环往复,测定新型中孔炭固定化的石油降解酶制剂的重复使用性。经测定,重复使用反应进行5次后,固定化石油降解酶制剂对石油的降解率仍高达60%左右,表明该固定化酶制剂具有一定的操作稳定性,可以重复使用。
通过以上实施例1~5及对比例1~5可以看出,利用新型中孔炭固定化的石油降解酶,对温度有较强的适应性,较短时间内对浓度不大于10g/L的石油污水降解效果能达到较高水平,且新型中孔炭固定化石油酶制剂的重复使用率较高。利用固定化酶降解石油,具有操作过程简便、降解效率显著等优点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段,还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种固定化石油降解酶制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(a)通过模板法合成孔道均一的新型中孔炭;(b)将石油降解酶通过吸附固定于新型中孔炭制得固定化石油降解酶制剂。
2.如权利要1所述固定化石油降解酶制剂的制备方法,其特征在于,所述新型中孔炭的合成方法为:将模板浸渍在含有碳源的溶液中,搅拌均匀,经高温碳化后采用氢氟酸去除模板制得新型中孔炭。
3.如权利要求2所述固定化石油降解酶制剂的制备方法,其特征在于,所述模板为SBA-15分子筛,所述碳源为蔗糖。
4.如权利要求3所述固定化石油降解酶制剂的制备方法,其特征在于,所述新型中孔炭的具体制备方法为:先将SBA-15分子筛模板烘干,将烘干后的SBA-15分子筛模板浸渍在蔗糖、浓硫酸和去离子水的混合溶液中,搅拌均匀后在80~120℃下加热2~4小时蒸干水分,再升温至150~170℃下聚合5~8小时得到褐色固体,研磨至粉状,加入蔗糖、浓硫酸和去离子水重复上述步骤进行第二次沉积,经二次沉积的聚合物转入石英管式炉中在高纯氮气气氛下加热至800~850℃碳化5~6小时,研磨后用质量分数4~6 %的氢氟酸洗涤去除模板,最后用乙醇及大量蒸馏水洗涤,烘干。
5.如权利要4所述固定化石油降解酶制剂的制备方法,其特征在于, SBA-15分子筛模板与蔗糖的质量比为1:1~1:1.7,蔗糖、浓硫酸和去离子水的混合溶液混合溶液中pH值为0.3~1,蔗糖的浓度为0.48~1.0 mol/L。
6.如权利要1至5任意一项所述固定化石油降解酶制剂的制备方法,其特征在于,所述新型中孔炭的孔径为4.0~30 nm,孔容为 0.20~2.00 cm3/g,比表面积为 900~3000 m2/g。
7.如权利要1所述固定化石油降解酶制剂的制备方法,其特征在于,步骤(b)具体为:首先将驯化富集的石油降解微生物经细胞破碎得到粗酶液,将新型中孔炭与粗酶液搅拌固定得到混合液,随后将混合液抽滤并用缓冲液洗涤,真空冷冻干燥之后得到固定化石油降解酶制剂。
8.如权利要求7所述固定化石油降解酶制剂的制备方法,其特征在于,新型中孔炭与粗酶液搅拌固定的反应条件为:在4℃下搅拌4~8h,搅拌转速为 50~ 400rpm。
9.如权利要求7所述固定化石油降解酶制剂的制备方法,其特征在于,所述新型中孔炭与粗酶液的质量比为1:1~3。
10.如权利要求7所述固定化石油降解酶制剂的制备方法,所述粗酶液的pH为6~8,初始浓度为1~2 mg/ml。
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2017
- 2017-01-09 CN CN201710013147.8A patent/CN106636059A/zh active Pending
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