CN108486006B - 一种油泥石油降解复合酶的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种油泥石油降解复合酶的制备方法与应用，制备方法步骤如下：（1）将醋酸钙不动杆菌菌体进行细胞破碎，离心，取上清液，制得石油降解酶液21#；（2）将石油降解酶液21#与甲酸脱氢酶混合，制得油泥石油降解复合酶。本发明首次将来源于醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌的石油降解酶系与甲酸脱氢酶按比例混合后，发现其可应用于处理高浓度石油污染油泥中的石油降解与修复，不仅不需要进行硅藻土等吸附剂的固定化，而且可在短时间内使油泥中的石油减量，具有高效的石油污染处理能力，并且生产成本低，具有广阔的应用前景。

Description

一种油泥石油降解复合酶的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种油泥石油降解复合酶的制备方法与应用，属于土壤处理技术领域。
背景技术
在石油生产、贮运、炼制加工及使用过程中，由于事故，不正常操作及检修等原因，都会有石油烃类的溢出和排放。例如：油田开发过程中的井喷事故；输油管线和贮油罐的泄漏事故；油槽车和油轮的泄漏事故；油井清蜡和油田地面设备检修；炼油和石油化工生产装置检修等。石油烃类大量溢出，应当尽可能予以回收，但有的情况下回收很困难，即使尽力回收，仍会残留一部分，对环境(土壤、地面和地下水) 造成污染。石油进入土壤后，会破坏土壤结构，分散土粒，使土壤的透水性降低。其富含的反应基能与无机氮、磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用，从而使土壤有效磷、氮的含量减少。特别是其中的多环芳烃，因有致癌、致变、致畸等活性和能通过食物链在动植物体内逐级富集，它在土壤中的累积更具危害。
这些危害中，油泥的处理是最为困难的。油泥是在石油上游的勘探开发、油气集输、污水处理、罐底清洗和下游的石油炼制过程中，因工艺设备、人为操作等原因会产生大量的含有石油烃类的油、泥、水混合物外泄到环境中而产生的含油污泥。油田含油污泥是一种量大而面广的污染源，具有油含量高、重质油组分高等特点。
20世纪80年代以前，治理石油烃污染土壤还仅限于物理和化学方法，即热处理和化学浸出法。热处理法是通过焚烧或煅烧，可净化土壤中大部分有机污染物。但同时亦破坏土壤结构和组分，且价格昂贵而很难实施。化学浸出和水洗也可以获得较好的除油效果。但所用的化学试剂的二次污染问题限制了其应用。理论上，最新的热解技术处理含油污泥，可使石油减量化达80%左右，剩余石油含量仍然很高。由于油泥收集、处理难度大，处理工艺复杂，且属于危险废弃物，其无害化处理一直是一个世界性的难题，中国各油田目前基本没有实现无害化和资源化处理的实例。随着国家对环境保护工作越来越重视，对于石油企业，有效降低环境污染风险和各项费用，显得非常必要。
早在20世纪70年代，为了解决输油管线和储油罐发生故障漏油和溢油时土壤被石油污染的问题，美国埃索研究和工程公司就已经开始寻找清洁的生物解决方法，并且其实验室研究找到一种有效的“细菌播种法，开了生物修复石油污染土壤先河。上世纪80年代以来，污染土壤的生物修复技术越来越引起人们的关注，生物修复技术也取得了很大进步，正在逐渐成熟。
而今，世界各国都开始采用生物的方法来修复石油污染。生物修复是利用生物的生命代谢活动减少土壤环境中有毒有害物的浓度，使污染土壤恢复到健康状态的过程。中国专利文献CN103484447A（申请号201310456751.X）公开了一种石油降解酶制剂的制备方法与应用，制备步骤如下：将降解石油的微生物进行细胞破碎后制备粗酶液，然后粗酶液与载体混合吸附后，经分离、干燥，制得石油降解酶制剂；所述的降解石油的微生物为醋酸钙不动杆菌，菌种保藏号：CGMCC No.3915，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该发明通过将具有降解石油功能的微生物的酶体系通过吸附剂固定后，对受石油污染的土壤进行降解，降解效率显著提高，较微生物降解速度提高30~50倍，稳定性较粗酶液提高15～20倍。上述技术方案虽然可以应用于被石油污染的水体、土壤修复过程中，但由于其应用的石油浓度最高为10g/L，而实际需要处理的污染水体和土壤浓度远远高于该浓度，并且需要吸附剂进行固定化，导致实际应用成本较高，前景不佳。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种油泥石油降解复合酶的制备方法与应用。
本发明技术方案如下：
一种油泥石油降解复合酶的制备方法，步骤如下：
（1）将醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌体进行细胞破碎，离心，取上清液，制得石油降解酶液21#；
（2）将步骤（1）制得的石油降解酶液21#与甲酸脱氢酶按蛋白质的质量比1:（3～5）的比例混合，制得油泥石油降解复合酶。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中，醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）的菌种保藏号为CGMCC No.3915。该菌为已知菌株，不涉及菌种保藏。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中，醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌体按如下方法培养制备：
a、将醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）按质量比1%～2%的接种量转接至LB培养基中，在28～32℃、150 ～180rpm条件下种子培养14～16 h，制得种子液；
b、将步骤a制得的种子液按质量比4%～5%的接种量转接至LB培养基中，在28～32℃、150 ～180 rpm条件下扩大培养14～16 h，制得菌液；
c、将步骤b制得的菌液经离心，收集沉淀，制得醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌体。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中的细胞破碎，步骤如下：
将醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌体按质量体积比1:（15～25）的比例与pH 7.5的磷酸缓冲液混合均匀，单位g/ml；在320 W的超声波条件下、采用间歇超声波处理方式进行细胞破碎17 min，每次超声波破碎时间2s，间歇时间2s。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中，离心条件为：5000 r/min离心2 min。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中，甲酸脱氢酶为甲酸脱氢酶CbFDH，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中，甲酸脱氢酶CbFDH的制备步骤如下：
（i）构建基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh；
（ii）将步骤（i）构建的基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh按质量1%～2%的接种量转接至种子培养基中，在28～32℃、150 ～180rpm条件下种子培养10～12 h，制得大肠杆菌种子液；
（iii）将步骤（ii）所述大肠杆菌种子液按质量4%～5%的接种量转接至发酵培养基，在28～32℃、150 ～180rpm条件下培养16～18 h，收集基因工程菌株大肠杆菌E.coliBL21-fdh菌体，经细胞破碎，离心，收集上清液，制得甲酸脱氢酶CbFDH。
根据本发明进一步优选的，所述步骤（i）中，基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh的构建方法如下：
扩增来源于博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）的甲酸脱氢酶基因fdh，连接至大肠杆菌表达载体pET28a(+)，构建获得携带fdh基因的重组表达载体pET28a(+)-fdh，转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，挑取转化子，筛选获得表达甲酸脱氢酶的重组大肠杆菌E.coliBL21-fdh。
根据本发明进一步优选的，所述步骤（ii）中，所述种子培养基组分如下：
蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，氨苄青霉素（ampicillin）100μg/mL。
根据本发明进一步优选的，所述步骤（iii）中，所述发酵培养基组分如下：
蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，Na2HPO4·12H2O 9 g/L，KH2PO4 6.8 g/L，(NH4)2SO4 3.3 g/L，葡萄糖 0.5 g/L，乳糖 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl2 0.02 g/L，甘油按体积百分比计0.5 %。
根据本发明进一步优选的，所述步骤（iii）中，所述细胞破碎，步骤如下：
将基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh菌体按质量体积比1:（15～25）的比例与pH 7.5的磷酸缓冲液混合均匀，单位g/ml；在195 W的超声波条件下、采用间歇超声波处理方式进行细胞破碎6 min，每次超声波破碎时间3s，间歇时间5s。
根据本发明进一步优选的，所述步骤（iii）中，离心条件为：3000 r/min离心2min。
根据本发明优选的，所述步骤（2）中，石油降解酶液21#与甲酸脱氢酶的混合质量比为1:4。
一种上述制备方法获得的油泥石油降解复合酶。
上述油泥石油降解复合酶在恢复石油污染油泥中的应用。
上述应用，步骤如下：
（I）将油泥石油降解复合酶与甲酸钠溶液混合，蛋白与甲酸钠的质量比为1：（4～6），制得甲酸钠浓度为150～180mmol/L的油泥石油降解复合酶处理液；
（II）将油泥与步骤（I）制得的油泥石油降解复合酶处理液按照质量体积比1：（16～24）的比例混合，单位g/ml，在25～35℃条件下搅拌处理6～24h，即可。
根据本发明优选的，所述步骤（I）中，蛋白与甲酸钠的质量比为1：5。
根据本发明优选的，所述步骤（I）中，所述油泥石油降解复合酶处理液中，甲酸钠浓度为167mmol/L。
根据本发明优选的，所述步骤（II）中，油泥与油泥石油降解复合酶处理液按照质量体积比1：20的比例混合。
有益效果
1、本发明首次将来源于醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌的石油降解酶系与甲酸脱氢酶按比例混合后，发现其可应用于处理高浓度石油污染油泥中的石油降解与修复，不仅不需要进行硅藻土等吸附剂的固定化，而且可在短时间内使油泥中的石油减量，具有高效的石油污染处理能力，并且生产成本低，具有广阔的应用前景；
2、发明人发现当甲酸脱氢酶为甲酸脱氢酶CbFDH（氨基酸序列为SEQ ID NO.1）时，石油降解酶系对高浓度石油污染油泥的修复效率会进一步提升，同时发明人惊奇的发现，当采用特定培养基培养重组菌获取甲酸脱氢酶CbFDH时，甲酸脱氢酶CbFDH的稳定性等方面特性会有显著提升。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源：
醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.3915；
博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 2.2378；
质粒pET28a(+)购自山东沃恩生物科技有限公司；
大肠杆菌BL21(DE3)普通市售产品。
实施例1
醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌体按如下方法培养制备：
a、将醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）按质量比2%的接种量转接至LB培养基中，在30℃、160rpm条件下种子培养15 h，制得种子液；
b、将步骤a制得的种子液按质量比4%～5%的接种量转接至LB培养基中，在30℃、160 rpm条件下扩大培养15h，制得菌液；
c、将步骤b制得的菌液经离心，收集沉淀，制得醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌体。
实施例2
甲酸脱氢酶CbFDH的制备步骤如下：
（i）构建基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh；构建方法如下：
扩增获得来源于博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）的甲酸脱氢酶基因fdh，基因序列如SEQ ID NO.2所示，上游扩增引物序列如SEQ ID NO.3所示，将扩增后的甲酸脱氢酶基因fdh连接至大肠杆菌表达载体pET28a(+)，构建获得携带fdh基因的重组表达载体pET28a(+)-fdh，转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，挑取转化子，筛选获得表达甲酸脱氢酶的重组大肠杆菌E.coli BL21-fdh；具体步骤条件参见大肠杆菌表达载体pET28a(+)的使用说明书；
（ii）将步骤（i）构建的基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh按质量2%的接种量转接至种子培养基中，在30℃、160rpm条件下种子培养12 h，制得大肠杆菌种子液；
所述种子培养基组分如下：
蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，氨苄青霉素（ampicillin）100μg/mL。
（iii）将步骤（ii）所述大肠杆菌种子液按质量4%的接种量转接至发酵培养基，在30℃、160rpm条件下培养16 h，收集基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh菌体，经细胞破碎，3000 r/min离心2 min，收集上清液，制得甲酸脱氢酶CbFDH；经检测，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述发酵培养基组分如下：
蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，Na2HPO4·12H2O 9 g/L，KH2PO4 6.8 g/L，(NH4)2SO4 3.3 g/L，葡萄糖 0.5 g/L，乳糖 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl2 0.02 g/L，甘油按体积百分比计0.5 %。
所述细胞破碎，步骤如下：
将基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh菌体按质量体积比1:20的比例与pH7.5的磷酸缓冲液混合均匀，单位g/ml；在195 W的超声波条件下、采用间歇超声波处理方式进行细胞破碎6 min，每次超声波破碎时间3s，间歇时间5s。
实施例3
一种油泥石油降解复合酶的制备方法，步骤如下：
（1）将实施例1制备的醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌体进行细胞破碎，5000 r/min离心2 min，取上清液，制得石油降解酶液21#；
所述细胞破碎，步骤如下：
将醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌体按质量体积比1:20的比例与pH 7.5的磷酸缓冲液混合均匀，单位g/ml；在320 W的超声波条件下、采用间歇超声波处理方式进行细胞破碎17 min，每次超声波破碎时间2s，间歇时间2s；
（2）将步骤（1）制得的石油降解酶液21#与甲酸脱氢酶按蛋白质的质量比1:4的比例混合，制得油泥石油降解复合酶。
实施例4
如实施例3所述的油泥石油降解复合酶的制备方法，不同之处在于，甲酸脱氢酶制备过程中采用的发酵培养基，组份如下：
LB液体培养基（蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L），培养2～3h后，添加IPTG溶液至终浓度0.5 mmol/L进行诱导。
实施例5
如实施例3所述的油泥石油降解复合酶的制备方法，不同之处在于，石油降解酶液21#与甲酸脱氢酶按蛋白质的质量比为1:3。
实施例6
如实施例3所述的油泥石油降解复合酶的制备方法，不同之处在于，石油降解酶液21#与甲酸脱氢酶按蛋白质的质量比为1:5。
对比例1
如实施例3所述的油泥石油降解复合酶的制备方法，不同之处在于，石油降解酶液21#与甲酸脱氢酶按蛋白质的质量比为2:3。
对比例2
如实施例3所述的油泥石油降解复合酶的制备方法，不同之处在于，石油降解酶液21#与甲酸脱氢酶按蛋白质的质量比为1:1。
对比例3
如实施例3所述的油泥石油降解复合酶的制备方法，不同之处在于，石油降解酶液21#与甲酸脱氢酶按蛋白质的质量比为2:1。
对比例4
按中国专利文献CN103484447A（申请号201310456751.X）中实施例3的记载制备酶制剂。
实验例1 石油降解率实验
准确称量含油率10%的油泥2 g（石油含量200 mg），加入干燥三角瓶中，分别将按照实施例1、实施例4～6及对比例1～4制备的酶制剂20ml与甲酸钠混合，酶制剂中的蛋白与甲酸钠的质量比为1：5，用dH2O补至40 mL，制得油泥石油降解复合酶处理液，此时甲酸钠溶液浓度均为167mmol/L，分别标记为实验组1～8，同时取40 mL的dH2O作为CK组。
将实验组1～8与CK组在30℃、150 rpm条件下酶解反应12 h，加入二氯甲烷终止反应；采用重量法测定油泥石油降解率，具体步骤如下：
向油泥的酶降解体系中加入40 mL二氯甲烷，充分混匀后全部转移至分液漏斗中，并加入10～20g氯化钠，用15ml二氯甲烷洗涤酶降解反应容器并转入分液漏斗，充分振摇3min，静置分层，将水相放入原三角瓶中，有机相转入100 ml锥形瓶中。用二氯甲烷重复萃取酶解油泥样品两次，每次用量15 ml，合并三次萃取液于锥形瓶中。向二氯甲烷萃取液中加入适量无水硫酸钠（至不再结块为止），加盖后，放置0.5 h以上，以便脱水。用预先以二氯甲烷洗涤过的定性滤纸过滤，收集滤液于100 ml锥形瓶中。用二氯甲烷重复萃取酶解油泥样品两次，每次用量15 ml，合并三次萃取液于锥形瓶中。利用旋转蒸发装置，蒸出二氯甲烷，自然烘干后，称量，计算石油降解率：
降解率（%）=（对照组油重-酶解实验组油重)×100% / 对照组油重
经检测，不同实验组的相关实验结果如表1所示：
表1 不同21#石油降解酶/CbFDH配比条件下油泥砂的石油降解率
实验组号 实验组1 实验组2 实验组3 实验组4 实验组5 实验组6 实验组7 实验组8 CK组
石油降解率（%） 35.1 35.6 32.0 39.7 29.9 26.6 10.3 10.7 —
数据分析
由上述数据可以看出，实验组1～4（实施例1、实施例4～6）的石油降解率显著高于实验组5～7（对比例1～3），由此可以看出，石油降解酶与甲酸脱氢酶二者的比例关系会显著影响石油降解率的。通过实验组1～4（实施例1、实施例4～6）与实验组8（对比例4）的数据可以看出，本发明的复合酶制剂较现有已知的酶制剂在降解含油率高的油泥时，具有更加显著的降解效果。
实验例2 酶制剂稳定性实验
实验过程如实验例1所述，不同之处在于，制得油泥石油降解复合酶处理液后，室温保存5天后，进行后续油泥降解实验。经检测，石油降解率如表2所示：
表2 油泥石油降解复合酶处理液室温保存5天后石油降解率
实验组号 实验组1 实验组2 实验组3 实验组4 实验组5 实验组6 实验组7 实验组8 CK组
石油降解率（%） 35.3 — 31.7 42.1 28.6 25.9 8.3 6.5 —
数据分析
由上述数据可以看出，实验组1、实验组3和实验组4（实施例1、实施例5和实施例6）的石油降解率与表1中的对应实验数据变化不大，而实验组2（实施例4）由于制备甲酸脱氢酶时采用的培养基不同，导致酶制剂失去降解活性，由此可以看出本发明中所述的发酵培养基具有提供甲酸脱氢酶稳定性的作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省科学院生态研究所
<120> 一种油泥石油降解复合酶的制备方法与应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 364
<212> PRT
<213> Candida boidinii
<400> 1
Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp
1 5 10 15
Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn
20 25 30
Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu
35 40 45
Gly Gly Asn Ser Val Leu Asp Gln His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile
50 55 60
Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Ile Asp
65 70 75 80
Lys Ala Lys Lys Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp
85 90 95
His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val
100 105 110
Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val
115 120 125
Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln
130 135 140
Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr
145 150 155 160
Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly
165 170 175
Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Val Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu
180 185 190
Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Asp Ala Glu Glu Lys Val Gly
195 200 205
Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile
210 215 220
Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn
225 230 235 240
Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr
245 250 255
Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro
275 280 285
Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala
290 295 300
Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln
305 310 315 320
Thr Arg Tyr Ala Gln Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr
325 330 335
Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu
340 345 350
Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys
355 360
<210> 2
<211> 1095
<212> DNA
<213> Candida boidinii
<400> 2
atgaagatcg ttttagtctt atatgatgct ggtaaacacg ctgccgatga agaaaaatta 60
tacggttgta ctgaaaacaa attaggtatt gccaattggt tgaaagatca aggacatgaa 120
ttaatcacca cgtctgataa agaaggcgga aacagtgtgt tggatcaaca tataccagat 180
gccgatatta tcattacaac tcctttccat cctgcttata tcactaagga aagaatcgac 240
aaggctaaaa aattgaaatt agttgttgtc gctggtgtcg gttctgatca tattgatttg 300
gattatatca accaaaccgg taagaaaatc tccgttttgg aagttaccgg ttctaatgtt 360
gtctctgttg cagaacacgt tgtcatgacc atgcttgtct tggttagaaa ttttgttcca 420
gctcacgaac aaatcattaa ccacgattgg gaggttgctg ctatcgctaa ggatgcttac 480
gatatcgaag gtaaaactat cgccaccatt ggtgccggta gaattggtta cagagtcttg 540
gaaagattag tcccattcaa tcctaaagaa ttattatact acgattatca agctttacca 600
aaagatgctg aagaaaaagt tggtgctaga agggttgaaa atattgaaga attggttgcc 660
caagctgata tagttacagt taatgctcca ttacacgctg gtacaaaagg tttaattaac 720
aaggaattat tgtctaaatt caagaaaggt gcttggttag tcaatactgc aagaggtgcc 780
atttgtgttg ccgaagatgt tgctgcagct ttagaatctg gtcaattaag aggttatggt 840
ggtgatgttt ggttcccaca accagctcca aaagatcacc catggagaga tatgagaaac 900
aaatatggtg ctggtaacgc catgactcct cattactctg gtactacttt agatgctcaa 960
actagatacg ctcaaggtac taaaaatatc ttggagtcat tctttactgg taagtttgat 1020
tacagaccac aagatatcat cttattaaac ggtgaatacg ttaccaaagc ttacggtaaa 1080
cacgataaga aataa 1095
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccggatccat gaagatygty ttagtyytwt atg 33
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccgtcgactt atttcttatc gtgtttaccg 30

Claims (15)

1.一种油泥石油降解复合酶的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌体进行细胞破碎，离心，取上清液，制得石油降解酶液21#；
所述的醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）的菌种保藏号为CGMCCNo.3915；
（2）将步骤（1）制得的石油降解酶液21#与甲酸脱氢酶按蛋白质的质量比1:（3～5）的比例混合，制得油泥石油降解复合酶；
所述甲酸脱氢酶为甲酸脱氢酶CbFDH，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述甲酸脱氢酶CbFDH的制备步骤如下：
（i）构建基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh；
（ii）将步骤（i）构建的基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh按质量1%～2%的接种量转接至种子培养基中，在28～32℃、150 ～180rpm条件下种子培养10～12 h，制得大肠杆菌种子液；
（iii）将步骤（ii）所述大肠杆菌种子液按质量4%～5%的接种量转接至发酵培养基，在28～32℃、150 ～180rpm条件下培养16～18 h，收集基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh菌体，经细胞破碎，离心，收集上清液，制得甲酸脱氢酶CbFDH；
所述步骤（iii）中，所述发酵培养基组分如下：
蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，Na2HPO4·12H2O 9 g/L，KH2PO4 6.8 g/L，(NH4)2SO43.3 g/L，葡萄糖 0.5 g/L，乳糖 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl2 0.02 g/L，甘油按体积百分比计0.5 %。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌体按如下方法培养制备：
a、将醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）按质量比1%～2%的接种量转接至LB培养基中，在28～32℃、150 ～180rpm条件下种子培养14～16 h，制得种子液；
b、将步骤a制得的种子液按质量比4%～5%的接种量转接至LB培养基中，在28～32℃、150 ～180 rpm条件下扩大培养14～16 h，制得菌液；
c、将步骤b制得的菌液经离心，收集沉淀，制得醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌体。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，离心条件为：5000 r/min离心2 min。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的细胞破碎，步骤如下：
将醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）菌体按质量体积比1:（15～25）的比例与pH 7.5的磷酸缓冲液混合均匀，单位g/ml；在320 W的超声波条件下、采用间歇超声波处理方式进行细胞破碎17 min，每次超声波破碎时间2s，间歇时间2s。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（i）中，基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh的构建方法如下：
扩增来源于博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）的甲酸脱氢酶基因fdh，连接至大肠杆菌表达载体pET28a(+)，构建获得携带fdh基因的重组表达载体pET28a(+)-fdh，转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，挑取转化子，筛选获得表达甲酸脱氢酶的重组大肠杆菌E.coliBL21-fdh。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（ii）中，所述种子培养基组分如下：
蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，氨苄青霉素 100 μg/mL。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（iii）中，所述细胞破碎，步骤如下：
将基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21-fdh菌体按质量体积比1:（15～25）的比例与pH7.5的磷酸缓冲液混合均匀，单位g/ml；在195 W的超声波条件下、采用间歇超声波处理方式进行细胞破碎6 min，每次超声波破碎时间3s，间歇时间5s。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（iii）中，离心条件为：3000 r/min离心2 min。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，石油降解酶液21#与甲酸脱氢酶的混合质量比为1:4。
10.一种权利要求1所述制备方法获得的油泥石油降解复合酶。
11.权利要求10所述油泥石油降解复合酶在恢复石油污染油泥中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，步骤如下：
（I）将油泥石油降解复合酶与甲酸钠溶液混合，蛋白与甲酸钠的质量比为1：（4～6），制得甲酸钠浓度为150～180mmol/L的油泥石油降解复合酶处理液；
（II）将油泥与步骤（I）制得的油泥石油降解复合酶处理液按照质量体积比1：（16～24）的比例混合，单位g/ml，在25～35℃条件下搅拌处理6～24h，即可。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述步骤（I）中，蛋白与甲酸钠的质量比为1：5。
14.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述步骤（I）中，所述油泥石油降解复合酶处理液中，甲酸钠浓度为167mmol/L。
15.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述步骤（II）中，油泥与油泥石油降解复合酶处理液按照质量体积比1：20的比例混合。
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