CN113462590A - 一种复合微生物菌剂的制备及其在污染物多环芳烃降解中的应用 - Google Patents

一种复合微生物菌剂的制备及其在污染物多环芳烃降解中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微生物复合菌剂的制备方法及其在土壤及污水有机污染物多环芳烃降解中的应用，属于环境保护中土壤及污水有机污染物处理技术领域。其制备方法为：将培养至对数生长期的白腐真菌和苏云金芽孢杆菌加入到含有腐殖酸和改性稻壳活性炭中固定化制成复合菌剂。采用该方法制备的复合菌剂对土壤及污水中的苯并[a]芘具有良好的降解性能。污水中苯并[a]芘在降解6天后即达到86.32%，土壤中苯并[a]芘在降解30天后达到92.52%。本发明为土壤及污水有机污染物多环芳烃的降解提供了新的参考，且均有良好的利用效果。本发明生产工艺简单，生产原料天然、绿色、无公害，且处理效率高，效果好，是处理土壤及污水中有机污染物多环芳烃的一种有效菌剂。

Description

一种复合微生物菌剂的制备及其在污染物多环芳烃降解中的 应用
技术领域
本发明涉及有机污染物多环芳烃类生物降解技术领域，具体地，涉及微生物苏云金芽孢杆菌、白腐真菌AH-3和改性稻壳活性炭、腐殖酸复合菌剂的制备及其在污染物多环芳烃中的应用。
背景技术
经济不断发展地同时，由生活、工厂、农田等作业活动产生的污染愈发严重。特别是废水和废气中的有机污染物，随着排放量的增加,这些有机污染物的种类更加庞大，结构也越发复杂，它们广泛地存在自然界中,只有少部分能自行降解，大多数需要人为控制与治理，又因其大多具有毒害作用，例如PAHS，如果不及时处理会对我们的健康产生严重的损害，所以对于有机污染物的治理迫在眉睫。
传统治理污染物PAHS（多环芳烃）的方法中，物理法和化学法工程量较大，成本较高，且大多会产生二次污染，降解效果显微。而生物法降解由于运营成本低、适用范围广而逐渐成为当下的研究趋势。经过筛选、驯化得到高效的降解菌进而以多环芳烃为碳源进行高效降解目前研究较多，但是由于微生物的环境适应性不强，如果直接应用，则污染物的毒性对其会有一定的伤害性，使其降解活性降低，缩短了其使用时间，而如果是利用一些可降解的有机或无机载体将微生物固定化，将其限制在特定空间区域内高度富集，可以有效提高其生存活性，并且一些载体在一定程度上可以协助微生物进行降解活动，大大延长作用时间，且不会产生二次污染。采用成本低但负载作用较强的稻壳活性炭为载体，预处理进行改性后与细菌和真菌按一定比例混合制得复合微生物菌剂对环境中水污染和土壤污染的降解效果显著，且不用二次处理，环保高效。
发明内容
本发明针对目前利用微生物单独处理有机污染物多环芳烃效率不高且难以应用于实际生活中的问题进行了改进，采用本实验室提供的白腐真菌AH-3、自筛选的苏云金芽孢杆菌、价格低廉的活性炭载体和褐煤腐殖酸制备了一种复合微生物菌剂，其对特定污染物苯并[a]芘的去除效果显著，是处理土壤及污水中有机污染物多环芳烃的一种有效菌剂。
以下是对本发明菌剂中有效成分的说明。
a.本发明的苏云金芽孢杆菌其形态学特征是：30 ℃恒温培养箱中培养1天后菌落形态为不透明椭圆形、淡橙黄色、边缘不规则。在显微镜下观察苏云金芽孢杆菌呈紫色椭圆形杆状，芽孢为椭圆形。
b.本发明的白腐真菌AH-3其形态学特征是：30 ℃恒温培养箱培养3天后菌落形态为半透明状、白色、边缘不整齐。菌丝白色质密，菌落高约3.0 mm，菌丝较直。
c.本发明的添加剂褐煤腐殖酸的作用是,吸附和促进降解农药、多环芳烃等有机物,减少其在土壤中的富集和毒害作用,减轻土壤污染状况。
d.本发明中用于固定微生物的载体稻壳活性炭，由中国矿业大学化工学院实验室提供，经过进一步改性后使其具备一定的催化特性，并增大其吸附面积，使得最终制备的菌剂发挥更好的作用。
由以上主要成分制备复合微生物菌剂，主要制备方案如下。
将筛选出的苏云金芽孢杆菌接种至LB种子培养基，培养至对数期后，从中吸取25-30 mL接入新的LB发酵培养基内，再次培养至对数期后，加入已灭菌共3-4 g的腐殖酸和改性稻壳活性炭（质量比1:1）共同培养12-24 h后进行抽滤、洗涤、烘干；白腐真菌制作与上述所述方法一致，不同的是培养基为PDA。将以上两种单独的菌剂混合，即制得复合微生物菌剂。
针对本发明的菌剂，主要有以下有益效果。
（1）本发明的复合微生物菌剂，选择稻壳活性炭作为微生物的载体，经济环保，改性后对芽孢杆菌的吸附明显增加。而真菌由于直径较大，几乎可以全部被吸附，所以测量时不考虑改性活性炭对真菌的吸附影响。具体操作如下：将培养到稳定期的芽孢杆菌菌液（100-150 mL）与2-3 g改性活性炭混合培养，置于摇床中(温度28 ℃、转速180 rpm)培养，每隔1 h取出一定的混合液体，将其放置于简单过滤装置上过滤得到澄清的菌液，在600 nm处测定菌液的吸光度，持续测量直至光度值趋于平稳（以不加菌液，其他情况相同为空白对照），做出相应的吸附曲线；同时测量不改性活性炭对芽孢杆菌的吸附变化曲线。通过对比可发现改性后的活性炭可大大增加对芽孢杆菌的吸附能力，在9 h左右吸附值趋于平衡。
（2）在模拟处理污水处理上，将复合微生物菌剂0.5-0.8 g加入到含15 mg/L苯并[a]芘丙酮溶液的无机盐培养基中，连续处理6天，与用游离的混合菌（白腐真菌和苏云金芽孢杆菌湿重比1:1）处理比较，发现去除效果显著，降解能力达到86.32 %。
（3）在模拟土壤污染处理上，取过筛后的100-150 g的土壤，灭菌冷却后加入苯并[a]芘的丙酮溶液，使其初始浓度达到40-50 mg/kg,待丙酮挥发后，再加入8-10 g复合微生物菌剂，混合均匀，于25 ℃室温放置，定期加入去离子水，保持土壤含水量在25-30 %(质量分数)，分别在5、10、15、20、25、30 (d)取样，测定其降解率，与用游离的混合菌（白腐真菌和苏云金芽孢杆菌湿重比1:1）处理比较，可直观发现降解效果明显，最终能达到92.52 %。
附图说明
图1为白腐真菌AH-3的基因鉴定序列号。
图2为苏云金芽孢杆菌的基因鉴定序列号。
图3为改性前后稻壳活性炭对苏云金芽孢杆菌的吸附值随时间的变化图。
图4为复合微生物菌剂对降解模拟水污染中苯并[a]芘的去除率随时间的的变化图。
图5为复合微生物菌剂对降解模拟土壤污染中苯并[a]芘的残留量随时间的变化图。
具体实施方式
以下具体实施例是关于该发明的实际研究与应用，用于说明该发明的实用性、优越性，但是该发明并不局限于此。
本发明采用的白腐真菌AH-3保藏于中国矿业大学化工学院生物工程实验室。另一高效降解菌苏云金芽孢杆菌筛选自被多环芳烃污染的土壤。其序列号分别如图1、如图2所示。
实施例1。
微生物复合菌剂的制备。
首先，本发明选用稻壳活性炭作为微生物的载体，腐殖酸作为添加剂。
其次，本发明的稻壳活性炭需要进一步改性，以提高其对微生物的吸附特性，具体方法如下。
（1）将需要改性的活性炭用蒸馏水冲洗至中性，然后抽滤，110 ℃烘干，称重，再以1-2 g活性炭加入4-5 mL（10 %）双氧水的量加入相应的双氧水，同时添加质量为活性炭质量2-3 %的氧化镁。
（2）30 ℃，180 rpm摇瓶20-24 h后取出，抽滤，110 ℃烘干。
（3）将以上得到的活性炭用去离子水溶于锥形瓶中，同时添加质量为活性炭质量2-3 %的K2HPO4和KH2PO4，30 ℃，180 rpm摇瓶20-24 h后取出，抽滤，110 ℃烘干，得到需要的改性活性炭。
最后，本发明的复合微生物菌剂制备方法具体步骤如下。
（1）根据各自生长曲线，确定芽孢杆菌在培养12-20 h达到对数生长期，此时的OD值为1-1.8，白腐真菌AH-3在培养3-4天时状态最好。
（2）将白腐真菌AH-3和驯化的芽孢杆菌分别培养至PDA和LB培养基至对数期。分别取各自对数生长期的菌液20-25 mL接入新的100-120 mL发酵培养基中，同时加入已灭菌混合均匀的1.5-2 g改性活性炭和1.5-2 g腐殖酸。于28 ℃、180 rpm摇床培养20-24 h，抽滤，用去离子水和无机盐培养基反复洗涤2-3次，26 ℃烘箱烘干得到两种菌剂后将其均匀混合，用无菌口袋封装好，常温保存。
实施例2。
稻壳活性炭改性前后对苏云金芽孢杆菌的吸附变化曲线，具体方法如下。
（1）利用接种棒挑取生长良好的苏云金芽孢杆菌菌株至装有100-120 mLLB液体培养基的锥形瓶中，培养至对数期，再从中吸取3-4 ml的培养液至新的液体培养基中，培养至对数生长期。
（2）分别称取改性活性炭、未改性活性炭各3-4 g，投入到装有100-120 mL的相同情况下培养至对数生长期的菌液中，轻轻摇晃，混合均匀，再置于摇床中(温度28 ℃、转速180 rpm)培养。同时，以不接菌液而其他条件相同的培养液为空白对照。
（3）每隔1 h取2个平行样，每个5-6 mL。每次取样后在超净工作台里利用简单过滤装置过滤活性炭得到澄清菌液，使用紫外分光光度计在波长600 nm处测定光度值,直到吸附趋于平衡，做出相应改性与不改性活性炭的吸附曲线，如图3所示。
结果表明未改性的活性炭对苏云金芽孢杆菌的吸附随时间变化十分微小，吸附曲线趋于平滑，而改性后的稻壳活性炭则有较大的作用，大约在9 h左右达到吸附平衡，可以推测改性后活性炭的表面空隙增大，吸附能力也大幅度提高，此改性方法具有一定的意义。
实施例3。
模拟被苯并[a]芘的污水，利用实施例1制备的复合微生物菌剂对污水进行治理与修复，具体方法如下。
（1）采用紫外分光光度计法绘制苯并[a]芘的去除率曲线，首先绘制苯并芘的标准曲线，配置浓度分别为1、2、3、4、5 mg/L的苯并[a]芘-二氯甲烷溶液，在294 nm处分别测其吸光值，得到苯并[a]芘的标准曲线为y=0.3349x+0.0283 R2=0.9982，y为吸光度值，x为苯并[a]芘浓度。
[（2）无机盐培养基里预先接入含苯并[a]芘15 mg/L的丙酮（乙腈）溶液，可将丙酮挥发。分两组实验，一组加入游离的菌剂，一组加入生物菌剂，分别取以上类别0.5-1 g的量，其中游离菌（真菌和细菌湿重比为1:1），加入到已含有15 mg/L苯并[a]芘的25 mL无机盐培养基中。以不加苯并芘但分别加游离菌、菌剂的无机盐培养基做对照。
（3）每组共有六个一致的样液，并设置两组平行样，放置于30 ℃、150 rpm的摇瓶培养箱中连续6天培养并取样，采用紫外分光光度计测定锥形瓶内剩余的多环芳烃含量。
（4）对要测定的样液进行预处理：将样液放进超声波清洗机内进行超声震荡，30℃，40 KHZ，10 min，再进行抽滤，甁壁和滤纸上的活性炭反复用去离子水冲洗。再将过滤出的样液装入干净的100mL锥形瓶中。
（5）向过滤得到的样液中加入25 mL二氯甲烷，15 ℃、40 KHZ、20 min条件下再次进行超声震荡萃取。最后转至分液漏斗，分离出有机相，将有机相装入带瓶塞的锥形瓶，再用无水硫酸镁（3-5 g，分次加，每加一次，振荡一会，看是否有明显结块，当加下去没有明显结块，存在大量颗粒即可停止）进行脱水。利用紫外分光光光度计在294 nm处对脱水后的样液进行光度值的测定。
（6）采用下式计算水污染中苯并a芘去除率。
去除率（D）：（C0-C）/C0。
式中：C0为空白对照苯并[a]芘的浓度，mg/L；C为降解液中苯并[a]芘的浓度，mg/L。
通过作图可知，与混合的游离菌液处理比较，该方法制作的菌剂可以有效提高对多环芳烃苯并[a]芘的去除效果，6天内混合游离菌液的降解效果仅达到57.28 %，而该菌剂处理后可达到86.32 %，提升了近30 %，如图4所示。
实施例4。
模拟被苯并[a]芘污染的土壤，利用实施例1制备的复合微生物菌剂对土壤进行处理，具体方法如下。
（1）取学校里的清洁土壤，剔除石块、树叶等杂质，过10目筛（2 mm），称取100-120g过筛后的土壤分装于150 mL培养瓶进行灭菌。
（2）冷却后加入苯并[a]芘的丙酮溶液，使苯并[a]芘的初始浓度达到40-50 mg/kg,在通风橱内放置过夜，待丙酮挥发。
（3）向培养瓶中加入8-10 g复合微生物菌剂，混合均匀，于25 ℃室温放置，定期加入去离子水，保持土壤含水量在25-30 %(质量分数)，以相同质量的混合游离菌（白腐真菌AH-3和苏云金芽孢杆菌）为对照分别在0、5、10、15、20、25、30 (d)取样，测定其降解率。以不加菌剂而其他条件相同为空白对照组。
（4）将均匀取样的每份3-4 g的土壤放入装有30 mL二氯甲烷的锥形瓶中，放置于25 ℃、150 rpm的摇瓶培养箱萃取30 min。再放于30 ℃，45 KHZ的超声清洗机里萃取20-30min，最后进行抽滤，甁壁和滤纸上的土壤反复用去离子水冲洗。滤出的有机相和水相转至分液漏斗，分离出有机相，将有机相装入带瓶塞的锥形瓶，用无水硫酸镁进行脱水，对脱水后的样液进行光度值的测定。同时以相同质量的混合游离菌（真菌和细菌质量比1:1）做对照。
（5）用以下方法对土壤中残留的苯并[a]芘进行计算，并制作两种情况下模拟土壤中苯并a芘的降解-时间图。
t=cv/m。
式中：t为图样中苯并[a]芘残留的含量，单位为mg/kg；c为从标准曲线中查得苯并[a]芘的浓度，单位为mg/L；V为待测样液的体积，单位为mL。
M为样品质量，单位为g。
结果表明菌剂在三十天内对苯并[a]芘的降解率明显高于混合游离菌，在第三十天时降解率达到91.37 %，而混合游离菌只达到65.45 %，并且在二十天左右降解效率开始呈下降趋，如图5所示。

Claims (8)

1.一种复合微生物菌剂的制备及其在环境有机污染物多环芳烃降解中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，菌剂是由细菌和真菌构成的混合体系，其中细菌苏金云芽孢杆菌是由本实验从多环芳烃污染的土壤中筛选而来，白腐真菌AH-3由本实验室提供，保藏于中国矿业大学化工学院生物工程实验室。
3.一种治理和修复土壤有机污染物多环芳烃的复合微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂的载体为稻壳活性炭，经双氧水、氧化镁、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾试剂改性后使用。
4.根据权利要求3所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂除了包含微生物苏云金芽孢杆菌、白腐真菌AH-3、稻壳活性炭，还包含腐殖酸。
5.根据权利4所述的材料，一种复合微生物菌剂的制备方法应包含如下，将白腐真菌AH-3和驯化后的芽孢杆菌分别接种于种子培养基培养至对数期，从各自培养基中吸取出一部分培养液放入新的发酵培养基中，吸取出的体积为下一发酵培养液体积的20-25%。
6.培养一段时间后加入已灭菌共3-4g的腐殖酸和改性稻壳活性炭（质量比1:1），进行微生物固定化12-24h，最后过滤自然风干后均匀混合即制得复合微生物菌剂。
7.根据权利要求5所述的制备方法，固定化后的稻壳活性炭载体上苏云金芽孢杆菌的数量至少是6-8×108个/g，两菌株的质量比为0.5-1。
8.根据权利要求3～6所述的方法制得的菌剂在降解废水和土壤中污染物多环芳烃和的应用上，其特征在于，所述多环芳烃为苯并[a]芘。
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