CN109926448B - 一种固化重金属的粪产碱杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种固化重金属的粪产碱杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis），已于保藏在中国微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.16874。本发明还公开了利用上述粪产碱杆菌CGMCC No.16874生产脲酶，并且利用尿素作为底物生成碳酸根离子，固化重金属离子，能够在含有高浓度的重金属土壤环境中生长，转化重金属成化合物。本发明方法与其他化学方法修复重金属污染土壤相比，经济层面具有费用低、效率高，本身对环境影响小；设备层面具备对技术及设备要求低等优势；较其他化学法修复法而言，具备修复周期短、见效快和耗力小的优势，可大规模用来修复重金属污染土壤，保护生态环境。

Description

一种固化重金属的粪产碱杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种固化重金属的粪产碱杆菌及其在修复重金属土壤中的应用。

背景技术

随着当今社会的发展、工业的进步，经济发展的速度越来越快，同时对环境的污染也日益加剧。有些污染物中含有多种重金属，这些重金属可以通过很多的途径进入到土壤，土壤上生长的各种作物又会通过食物链循环，最终通过各种食物进入人体，从而危害人类的身体健康。因此，如何治理土壤重金属污染成为当务之急。

治理土壤重金属的办法有物理化学方法和生物法。物理化学方法包括：化学固化，土壤淋洗和非毒性化改良剂法等。虽能达到一定的效果，但因为其成本昂贵，操作复杂，而且还会破坏土壤结构以及土著微生物，也可能造成二次污染而难以推广，对于大区域低浓度有害的重金属污染更难以处理，所以都没有成为理想的修复措施。

近年来，重金属污染生物修复技术逐渐兴起。生物修复技术是利用土壤中天然微生物资源，或人为地投加菌株，利用微生物的金属修复机理：生物吸附、酸解作用、细胞代谢、氧化还原和植物吸收等。目前国内外对治理土壤中重金属污染的酸解作用途径主要固化作用和活化作用。一般利用微生物菌株，在生物酶化作用下将底物尿素分解产生的碳酸根，矿化固结土壤中的有效态的重金属，使其由活化态转变为稳定态，转变为较稳定的碳酸盐，减少土壤中重金属的迁移率。目前，用于微生物修复土壤的菌株有恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、酵母菌(Yeast)、短波单胞菌(Pseudomonas)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。现有技术中的菌株主要针对Pb^2+/、Zn²⁺、Cu^2+/重金属离子进行修复，但对于重金属Cd²⁺、As³离子的修复没有报道，主要是由于菌株适应性差、产脲酶低、生长过缓等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可固化重金属的粪产碱杆菌，以及这种粪产碱杆菌在修复土壤保护环境中的应用。该菌株能够生产脲酶，并且在尿素的底物作用下，能够高效的固定土壤环境中的重金属，并且具有对环境影响小，修复费用低且对技术设备要求都低等特点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种固化重金属的粪产碱杆菌，所述菌株的分类命名为粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)FC-33093，已于2018年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.16874。

本发明所述菌株是从如下方法得到：从南京市工业区周边采集的重金属污染的土壤样品中分离出四株粪产碱细菌在37℃培养48h后，测定生物量和脲酶活性，得到一株活性最强活力最旺盛的菌株，命名为Y-1，作为优势菌株。

将Y-1进行培养，并且按照稀释涂布法稀释至10⁷/mL，取菌液0.1mL均匀涂于无菌的空平板中，待风干后进行N+离子束注入，N+离子束注入剂量为(80、125、170、215、260)×2.6×1013N+/cm²，N+离子束注入能量为15keV。辐照结束后用1mL无菌水洗涤细胞，按10倍稀释法稀释后涂入平板培养基，37℃倒置培养48h，待挑取单菌落，摇瓶检测，筛选出其中脲酶活性最强及酶活耐受pH能力最强的那一株菌株，命名为粪产碱杆菌FC-33093。

所述的粪产碱杆菌FC-33093培养条件为：碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糊精、β-环糊精等材料；氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵等材料；生长的最适温度范围为30～45℃，pH为6.5～8.5，培养过程中可添加磷酸二氢铵、氯化钙、硫酸镁等。

所述的粪产碱杆菌菌株的主要形态特征和生理生化性质为：

粪产碱杆菌菌落边缘不规则，菌落细小。在显微镜下呈现短杆状，或弧线形，无荚膜，成对或列状排列；革兰氏染色为阴性。其中某些菌株能产生特征性的水果味并使血平板成绿色。

所述的粪产碱杆菌能够发酵生产脲酶，脲酶活性强且能耐受高pH环境，例如该酶在pH＝8条件下，酶活最高可达0.53±0.02ug/h/10⁴cell。

所述的粪产碱杆菌在固化重金属中的应用。

所述粪产碱杆菌在修复被重金属污染的土壤中的应用。

将粪产碱杆菌菌株FC-33093活化，在30～45℃下发酵培养24～72h，然后将发酵液中添加40～160g/L的尿素加入到待修复的被重金属污染的土壤中进行固化修复，通过发酵液中发酵得到的脲酶，脲酶将加入的尿素分解产生的碳酸根，矿化固结土壤中的有效态的重金属，使其由活化态转变为稳定态，转变为较稳定的碳酸盐，减少土壤中重金属的迁移率，对污染土壤中游离的重金属离子进行固化，从而达到降解效果。本发明的菌株适用于所有的含有的重金属离子土壤的修复。

具体包括如下步骤：

1)种子培养：从活化的平板上挑取满满一环菌接入液态种子培养基，30～45℃培养24～72h。

2)其中步骤1)中液态种子培养基为碳源10～48g/L，氮源10～36g/L，无机盐为1～9g/L，pH6.5～8.5。所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糊精、β-环糊精中的至少一种。所述的氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵中的至少一种。所述的无机盐为磷酸盐、钾盐、钙盐、镁盐中的任意一种或者几种的组合，其中，种子液培养基的装液量为100mL/500mL。待种子液生长好，按照接种量为5％转接至发酵培养基中进行培养。

最佳发酵生产方式：在37℃下发酵36h，在发酵过程中，通气比为3.0v/vm、搅拌250rpm。

所述的发酵培养基为：碳源10～48g/L，氮源10～36g/L，无机盐为1～9g/L，pH6.5～8.5。所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糊精、β-环糊精中的至少一种；所述的氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵中的至少一种；所述无机盐为磷酸盐、钾盐、钙盐、镁盐中的任意一种或者几种的组合。

所述的发酵培养基优选为：葡萄糖20g/L，酵母粉18g/L，磷酸二氢铵4.2g/L，氯化钙3.1g/L，尿素10g/L，无水硫酸镁3.5g/L，其余为水，pH＝7.8。

本发明粪产碱杆菌菌株FC-33093是基于生物矿化原理，利用粪产碱杆菌菌株FC-33093发酵得到的脲酶，将尿素分解成碳酸根离子，固结重金属离子，使其由可提取态转变为较稳定的碳酸盐矿物态，达到修复污染土壤的目的。采用该技术修复重金属污染土壤不仅能够将滞留的重金属污染物快速降解，或降低重金属毒性，减少污染现场污染物的浓度，同时还具有费用低、对环境影响小、效率高、对技术及设备要求较低等优点。

有益效果：本发明与现有技术相比具有一下优势：

1)与化学修复重金属污染的土壤的方法具有费用低、效率高，本身对环境影响小，对技术及设备要求低等优势；

2)其他植物类生物修复法也具有周期短、见效快和耗力小的优势，同时降低环境污染。

3)与其他菌种相比，本发明的粪产碱杆菌具备高产脲酶的能力，能够在高浓度的重金属土壤中，以尿素为底物，进行土壤快速修复。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)FC-33093的诱变筛选

从南京市工业区周边采集的重金属污染的土壤样品中分离出四株粪产碱细菌，在37℃培养48h后，测定生物量和脲酶活性，得到一株活性最强、活力最旺盛的菌株，命名为Y-1，作为优势菌株。将Y-1进行培养，并且按照稀释涂布法稀释至10⁷/mL，取菌液0.1mL均匀涂于无菌的空平板中，待风干后进行N+离子束注入，N+离子束注入剂量为(80、125、170、215、260)×2.6×1013N+/cm²，N+离子束注入能量为15keV。辐照结束后用1mL无菌水洗涤细胞，按10倍稀释法稀释后涂入平板培养基(平板培养基配方：胰蛋白胨15g/L、大豆蛋白胨5g/L、氯化钠5g/L)，37℃倒置培养48h，待挑取单菌落，摇瓶检测，筛选出其中脲酶活性最强及酶活耐受pH能力最强的那一株菌株，命名为粪产碱杆菌FC-33093。其中，脲酶活性最强为0.34ug/h/10⁴cell，比原始菌株(0.12ug/h/10⁴cell)提高了1.83倍，能在pH为8的条件上产酶最佳。

表1菌株pH耐受能力的确定

实施例2粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)FC-33093的培养及生理学特征

培养条件为：葡萄糖15g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢铵2.3g/L，无水硫酸镁3.5g/L，其余为水，pH＝7.8。500mL摇瓶装液量为100mL，110℃灭菌温度15min。在37℃、170rpm培养24-48h。

所述的粪产碱杆菌菌株的主要形态特征和生理生化性质为：

粪产碱杆菌菌落边缘不规则，菌落细小。在显微镜下呈现短杆状，或弧线形，无荚膜，成对或列状排列；革兰氏染色为阴性。

实施例3固化重金属的粪产碱杆菌的发酵生产脲酶及其对重金属离子固化效果的影响

平板培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母膏15g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH自然。

种子培养基：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母膏15g/L，氯化钠10g/L

发酵培养基1：葡萄糖15g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢铵3.5g/L，无水硫酸镁2.1g/L，其余为水，pH＝7.8。500mL摇瓶装液量为100mL，110℃灭菌温度15min。

发酵培养基2：葡萄糖20g/L，酵母粉18g/L，磷酸二氢铵4.2g/L，氯化钙3.1g/L，尿素10g/L，无水硫酸镁3.5g/L，其余为水，pH＝7.8。500mL摇瓶装液量为100mL，110℃灭菌温度15min。

将初始菌株进行平板活化，生长24h后，从37℃活化的平板上挑取满满一环菌接入液态种子培养基，放入37℃、170r/min摇床培养24h，然后将种子液按照接种量3％接入分别接入发酵培养基1和发酵培养基2中进行发酵培养，在37℃、转速170r/min下培养24h。得到以下结论：在37℃、170r/min培养24h的条件下，在同样测定方法的条件下，测得发酵培养基2条件下粪产碱杆菌FC-33093的酶活最高为0.53±0.02ug/h/10⁴cell。本发明是利用菌株先发酵，发酵液中得到脲酶，然后再加入尿素，脲酶分解尿素从而固定重金属。将其发酵前后的培养基进行对金属离子固化实验的对比实验结果如下表3。

表2脲酶活性的比较

表3对金属离子的固化效果对比的影响

实施例4发酵粪产碱杆菌菌液利用底物尿素产脲酶固化重金属

取培养好的粪产碱杆菌FC-33093的发酵菌液，菌体浓度为1g/L，添加1mL的尿素溶液，加入尿素后充分振荡混匀，在加入尿素反应2h后加入不同浓度的四种Pb²⁺、Cd²⁺、As³⁺、Zn²⁺金属离子溶液，充分混匀，放置24h后，离心测上清中金属离子的含量，从而得到加入四种Pb²⁺、Cd²⁺、As³⁺、Zn²⁺金属离子的最佳浓度是1g/L、0.01g/L、0.1g/L、1g/L。

表4铅(Pb²⁺)离子浓度的固化实验

表5镉(Cd²⁺)离子浓度的固化实验

表6砷(As³⁺)离子浓度的固化实验

表7锌(Zn²⁺)离子浓度的固化实验

取粪产碱杆菌的发酵菌液各20支，分别添加20g/L、60g/L、100g/L、140g/L、180g/L的尿素1ml，加入尿素后充分振荡混匀，放置20min，然后根据上述四个表格分别加入四种不同金属离子溶液：1g/LPb²⁺溶液、0.01g/LCd²⁺溶液、0.1g/LAs³⁺溶液、1g/LZn²⁺溶液，充分混匀，放置24h后，离心测上清中金属离子的含量，从而得到添加尿素的最佳量是100g/L，此添加量对重金属离子具有最佳的矿化效果。

表8最佳尿素添加量的确定

实施例5粪产碱杆菌FC-33093固化重金属的土壤实验

分别称取五种土壤各20g于小碗中(碗底平铺4层纱布)，向其中加入尿素溶液，使其中的终浓度为100g/L，然后向其中加入发酵菌液，菌体浓度为1g/L，放置于通风良好的地方(模拟实际环境)，检测土壤中金属离子的浓度，确定固化效果。在每天对土壤进行取样检测后，在第二天固化重金属的效果达到最大，有效态Pb重金属去除率达到83.90％，有效态Cd重金属去除率达到70.37％，有效态As重金属去除率达到65.04％，有效态Zn重金属去除率达到84.50％。

表9土壤实验重金属固化率

脲酶活性的测定：

(1)样本的前处理：按提取比例加入提取液，超声破碎细胞(冰浴，功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次)4℃离心弃上清，置冰上待测。

(2)测定步骤：分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至578nm，蒸馏水调零；酶促反应：按照试剂盒加入并混匀，放入37℃水浴1h后，10000r/min 25℃离心10min，取上清液；将上清液稀释10倍后测氨量：在微量石英比色皿96孔板中加入下列试剂，充分混匀，室温放置20min。混匀，于578nm处，蒸馏水调零，读吸光值A，计算A-A测定管-A对照管，每个测定管设一个对照管；UE活力计算：按细菌或细胞密度计算，标准条件下测定的回归方程为y＝0.0915x+0.0373；x为标准品浓度(ug/ml)，y为吸光值A。

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1ugNH3-N定义为一个酶活力单位。

Claims (7)

1.一种固化重金属的粪产碱杆菌，其分类命名为：粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）FC-33093，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16874。

2.根据权利要求1所述的固化重金属的粪产碱杆菌，其特征在于，该粪产碱杆菌生产脲酶，所述脲酶酶活在pH=8时最佳。

3.权利要求1所述的固化重金属的粪产碱杆菌在修复被重金属污染的土壤中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将粪产碱杆菌菌株FC-33093活化，在30~45℃下发酵培养24~72 h，然后在发酵液中添加40~160g/L的尿素加入到待修复的被重金属污染的土壤中，固化土壤中的重金属；

其中，发酵培养基为：碳源10~48g/L，氮源10~36g/L，无机盐为1~9g/L，pH6.5~8.5。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糊精、β-环糊精中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵中的至少一种。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述无机盐为磷酸盐、钾盐、钙盐、镁盐中的任意一种或者几种的组合。