CN109926448A - 一种固化重金属的粪产碱杆菌及其应用 - Google Patents
一种固化重金属的粪产碱杆菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109926448A CN109926448A CN201910201902.4A CN201910201902A CN109926448A CN 109926448 A CN109926448 A CN 109926448A CN 201910201902 A CN201910201902 A CN 201910201902A CN 109926448 A CN109926448 A CN 109926448A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- heavy metal
- foecalis alkaligenes
- bacillus foecalis
- soil
- curing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 54
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 39
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims abstract description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 30
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 25
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 7
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 claims abstract description 5
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 21
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 8
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N ammonium dihydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].OP(O)([O-])=O LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910000387 ammonium dihydrogen phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 5
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 4
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 claims description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 4
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 claims description 4
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 12
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 8
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000010884 ion-beam technique Methods 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 4
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 4
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- 241000422409 Alkalibacterium Species 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000005067 remediation Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 231100000783 metal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000003900 soil pollution Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Processing Of Solid Wastes (AREA)
Abstract
本发明涉及一种固化重金属的粪产碱杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis），已于保藏在中国微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.16874。本发明还公开了利用上述粪产碱杆菌CGMCC No.16874生产脲酶，并且利用尿素作为底物生成碳酸根离子，固化重金属离子，能够在含有高浓度的重金属土壤环境中生长，转化重金属成化合物。本发明方法与其他化学方法修复重金属污染土壤相比，经济层面具有费用低、效率高，本身对环境影响小；设备层面具备对技术及设备要求低等优势；较其他化学法修复法而言，具备修复周期短、见效快和耗力小的优势，可大规模用来修复重金属污染土壤，保护生态环境。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种固化重金属的粪产碱杆菌及 其在修复重金属土壤中的应用。
背景技术
随着当今社会的发展、工业的进步，经济发展的速度越来越快，同时对环境 的污染也日益加剧。有些污染物中含有多种重金属，这些重金属可以通过很多的 途径进入到土壤，土壤上生长的各种作物又会通过食物链循环，最终通过各种食 物进入人体，从而危害人类的身体健康。因此，如何治理土壤重金属污染成为当 务之急。
治理土壤重金属的办法有物理化学方法和生物法。物理化学方法包括：化学 固化，土壤淋洗和非毒性化改良剂法等。虽能达到一定的效果，但因为其成本昂 贵，操作复杂，而且还会破坏土壤结构以及土著微生物，也可能造成二次污染而 难以推广，对于大区域低浓度有害的重金属污染更难以处理，所以都没有成为理 想的修复措施。
近年来，重金属污染生物修复技术逐渐兴起。生物修复技术是利用土壤中天 然微生物资源，或人为地投加菌株，利用微生物的金属修复机理：生物吸附、酸 解作用、细胞代谢、氧化还原和植物吸收等。目前国内外对治理土壤中重金属污 染的酸解作用途径主要固化作用和活化作用。一般利用微生物菌株，在生物酶化 作用下将底物尿素分解产生的碳酸根，矿化固结土壤中的有效态的重金属，使其 由活化态转变为稳定态，转变为较稳定的碳酸盐，减少土壤中重金属的迁移率。 目前，用于微生物修复土壤的菌株有恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、酵母菌 (Yeast)、短波单胞菌(Pseudomonas)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。现有技术中的菌株主要针对Pb2+/、Zn2+、 Cu2+/重金属离子进行修复，但对于重金属Cd2+、As3离子的修复没有报道，主要 是由于菌株适应性差、产脲酶低、生长过缓等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可固化重金属的粪产碱杆菌，以及这种粪产碱杆 菌在修复土壤保护环境中的应用。该菌株能够生产脲酶，并且在尿素的底物作用 下，能够高效的固定土壤环境中的重金属，并且具有对环境影响小，修复费用低 且对技术设备要求都低等特点。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种固化重金属的粪产碱杆菌，所述菌株的分类命名为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)FC-33093，已于2018年12月3日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.16874。
本发明所述菌株是从如下方法得到：从南京市工业区周边采集的重金属污染 的土壤样品中分离出四株粪产碱细菌在37℃培养48h后，测定生物量和脲酶活 性，得到一株活性最强活力最旺盛的菌株，命名为Y-1，作为优势菌株。
将Y-1进行培养，并且按照稀释涂布法稀释至107/mL，取菌液0.1mL均匀 涂于无菌的空平板中，待风干后进行N+离子束注入，N+离子束注入剂量为(80、 125、170、215、260)×2.6×1013N+/cm2，N+离子束注入能量为15keV。辐照结 束后用1mL无菌水洗涤细胞，按10倍稀释法稀释后涂入平板培养基，37℃倒 置培养48h，待挑取单菌落，摇瓶检测，筛选出其中脲酶活性最强及酶活耐受 pH能力最强的那一株菌株，命名为粪产碱杆菌FC-33093。
所述的粪产碱杆菌FC-33093培养条件为：碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、 麦芽糊精、β-环糊精等材料；氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵等 材料；生长的最适温度范围为30～45℃，pH为6.5～8.5，培养过程中可添加磷酸 二氢铵、氯化钙、硫酸镁等。
所述的粪产碱杆菌菌株的主要形态特征和生理生化性质为：
粪产碱杆菌菌落边缘不规则，菌落细小。在显微镜下呈现短杆状，或弧线形， 无荚膜，成对或列状排列；革兰氏染色为阴性。其中某些菌株能产生特征性的水 果味并使血平板成绿色。
所述的粪产碱杆菌能够发酵生产脲酶，脲酶活性强且能耐受高pH环境，例 如该酶在pH＝8条件下，酶活最高可达0.53±0.02ug/h/104cell。
所述的粪产碱杆菌在固化重金属中的应用。
所述粪产碱杆菌在修复被重金属污染的土壤中的应用。
将粪产碱杆菌菌株FC-33093活化，在30～45℃下发酵培养24～72h，然后 将发酵液中添加40～160g/L的尿素加入到待修复的被重金属污染的土壤中进行 固化修复，通过发酵液中发酵得到的脲酶，脲酶将加入的尿素分解产生的碳酸根， 矿化固结土壤中的有效态的重金属，使其由活化态转变为稳定态，转变为较稳定 的碳酸盐，减少土壤中重金属的迁移率，对污染土壤中游离的重金属离子进行固 化，从而达到降解效果。本发明的菌株适用于所有的含有的重金属离子土壤的修 复。
具体包括如下步骤：
1)种子培养：从活化的平板上挑取满满一环菌接入液态种子培养基，30～45℃ 培养24～72h。
2)其中步骤1)中液态种子培养基为碳源10～48g/L，氮源10～36g/L，无机 盐为1～9g/L，pH6.5～8.5。所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糊精、 β-环糊精中的至少一种。所述的氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵 中的至少一种。所述的无机盐为磷酸盐、钾盐、钙盐、镁盐中的任意一种或者几 种的组合，其中，种子液培养基的装液量为100mL/500mL。待种子液生长好， 按照接种量为5％转接至发酵培养基中进行培养。
最佳发酵生产方式：在37℃下发酵36h，在发酵过程中，通气比为3.0v/vm、 搅拌250rpm。
所述的发酵培养基为：碳源10～48g/L，氮源10～36g/L，无机盐为1～9g/L， pH6.5～8.5。所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糊精、β-环糊精中的 至少一种；所述的氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵中的至少一种； 所述无机盐为磷酸盐、钾盐、钙盐、镁盐中的任意一种或者几种的组合。
所述的发酵培养基优选为：葡萄糖20g/L，酵母粉18g/L，磷酸二氢铵4.2g/L， 氯化钙3.1g/L，尿素10g/L，无水硫酸镁3.5g/L，其余为水，pH＝7.8。
本发明粪产碱杆菌菌株FC-33093是基于生物矿化原理，利用粪产碱杆菌菌 株FC-33093发酵得到的脲酶，将尿素分解成碳酸根离子，固结重金属离子，使 其由可提取态转变为较稳定的碳酸盐矿物态，达到修复污染土壤的目的。采用该 技术修复重金属污染土壤不仅能够将滞留的重金属污染物快速降解，或降低重金 属毒性，减少污染现场污染物的浓度，同时还具有费用低、对环境影响小、效率 高、对技术及设备要求较低等优点。
有益效果：本发明与现有技术相比具有一下优势：
1)与化学修复重金属污染的土壤的方法具有费用低、效率高，本身对环境 影响小，对技术及设备要求低等优势；
2)其他植物类生物修复法也具有周期短、见效快和耗力小的优势，同时降 低环境污染。
3)与其他菌种相比，本发明的粪产碱杆菌具备高产脲酶的能力，能够在高 浓度的重金属土壤中，以尿素为底物，进行土壤快速修复。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式 限制本发明。
实施例1粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)FC-33093的诱变筛选
从南京市工业区周边采集的重金属污染的土壤样品中分离出四株粪产碱细 菌，在37℃培养48h后，测定生物量和脲酶活性，得到一株活性最强、活力最 旺盛的菌株，命名为Y-1，作为优势菌株。将Y-1进行培养，并且按照稀释涂布 法稀释至107/mL，取菌液0.1mL均匀涂于无菌的空平板中，待风干后进行N+ 离子束注入，N+离子束注入剂量为(80、125、170、215、260)×2.6×1013N+/cm2， N+离子束注入能量为15keV。辐照结束后用1mL无菌水洗涤细胞，按10倍稀 释法稀释后涂入平板培养基(平板培养基配方：胰蛋白胨15g/L、大豆蛋白胨 5g/L、氯化钠5g/L)，37℃倒置培养48h，待挑取单菌落，摇瓶检测，筛选出其 中脲酶活性最强及酶活耐受pH能力最强的那一株菌株，命名为粪产碱杆菌 FC-33093。其中，脲酶活性最强为0.34ug/h/104cell，比原始菌株(0.12ug/h/104cell) 提高了1.83倍，能在pH为8的条件上产酶最佳。
表1菌株pH耐受能力的确定
实施例2粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)FC-33093的培养及生理学特征
培养条件为：葡萄糖15g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢铵2.3g/L，无水硫酸 镁3.5g/L，其余为水，pH＝7.8。500mL摇瓶装液量为100mL，110℃灭菌温度15min。在37℃、170rpm培养24-48h。
所述的粪产碱杆菌菌株的主要形态特征和生理生化性质为：
粪产碱杆菌菌落边缘不规则，菌落细小。在显微镜下呈现短杆状，或弧线形， 无荚膜，成对或列状排列；革兰氏染色为阴性。
实施例3固化重金属的粪产碱杆菌的发酵生产脲酶及其对重金属离子固 化效果的影响
平板培养基：胰蛋白胨20g/L，酵母膏15g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L， pH自然。
种子培养基：葡萄糖20g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母膏15g/L，氯化钠10g/L
发酵培养基1：葡萄糖15g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢铵3.5g/L，无水硫 酸镁2.1g/L，其余为水，pH＝7.8。500mL摇瓶装液量为100mL，110℃灭菌温度 15min。
发酵培养基2：葡萄糖20g/L，酵母粉18g/L，磷酸二氢铵4.2g/L，氯化钙 3.1g/L，尿素10g/L，无水硫酸镁3.5g/L，其余为水，pH＝7.8。500mL摇瓶装液 量为100mL，110℃灭菌温度15min。
将初始菌株进行平板活化，生长24h后，从37℃活化的平板上挑取满满一 环菌接入液态种子培养基，放入37℃、170r/min摇床培养24h，然后将种子液 按照接种量3％接入分别接入发酵培养基1和发酵培养基2中进行发酵培养，在 37℃、转速170r/min下培养24h。得到以下结论：在37℃、170r/min培养24h 的条件下，在同样测定方法的条件下，测得发酵培养基2条件下粪产碱杆菌 FC-33093的酶活最高为0.53±0.02ug/h/104cell。本发明是利用菌株先发酵，发酵 液中得到脲酶，然后再加入尿素，脲酶分解尿素从而固定重金属。将其发酵前后 的培养基进行对金属离子固化实验的对比实验结果如下表3。
表2脲酶活性的比较
表3对金属离子的固化效果对比的影响
实施例4发酵粪产碱杆菌菌液利用底物尿素产脲酶固化重金属
取培养好的粪产碱杆菌FC-33093的发酵菌液，菌体浓度为1g/L，添加1mL 的尿素溶液，加入尿素后充分振荡混匀，在加入尿素反应2h后加入不同浓度的 四种Pb2+、Cd2+、As3 +、Zn2+金属离子溶液，充分混匀，放置24h后，离心测上 清中金属离子的含量，从而得到加入四种Pb2+、Cd2+、As3+、Zn2+金属离子的最 佳浓度是1g/L、0.01g/L、0.1g/L、1g/L。
表3铅(Pb2+)离子浓度的固化实验
表5镉(Cd2+)离子浓度的固化实验
表6砷(As3+)离子浓度的固化实验
表7锌(Zn2+)离子浓度的固化实验
取粪产碱杆菌的发酵菌液各20支，分别添加20g/L、60g/L、100g/L、140g/L、 180g/L的尿素1ml，加入尿素后充分振荡混匀，放置20min，然后根据上述四个 表格分别加入四种不同金属离子溶液：1g/LPb2+溶液、0.01g/LCd2+溶液、 0.1g/LAs3+溶液、1g/LZn2+溶液，充分混匀，放置24h后，离心测上清中金属离 子的含量，从而得到添加尿素的最佳量是100g/L，此添加量对重金属离子具有 最佳的矿化效果。
表8最佳尿素添加量的确定
实施例5粪产碱杆菌FC-33093固化重金属的土壤实验
分别称取五种土壤各20g于小碗中(碗底平铺4层纱布)，向其中加入尿素 溶液，使其中的终浓度为100g/L，然后向其中加入发酵菌液，菌体浓度为1g/L， 放置于通风良好的地方(模拟实际环境)，检测土壤中金属离子的浓度，确定固 化效果。在每天对土壤进行取样检测后，在第二天固化重金属的效果达到最大， 有效态Pb重金属去除率达到83.90％，有效态Cd重金属去除率达到70.37％，有 效态As重金属去除率达到65.04％，有效态Zn重金属去除率达到84.50％。
表9土壤实验重金属固化率
脲酶活性的测定：
(1)样本的前处理：按提取比例加入提取液，超声破碎细胞(冰浴，功率 20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次)4℃离心弃上清，置冰上待测。
(2)测定步骤：分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至578nm， 蒸馏水调零；酶促反应：按照试剂盒加入并混匀，放入37℃水浴1h后， 10000r/min 25℃离心10min，取上清液；将上清液稀释10倍后测氨量：在微量 石英比色皿96孔板中加入下列试剂，充分混匀，室温放置20min。混匀，于578nm 处，蒸馏水调零，读吸光值A，计算A-A测定管-A对照管，每个测定管设一个 对照管；UE活力计算：按细菌或细胞密度计算，标准条件下测定的回归方程为 y＝0.0915x+0.0373；x为标准品浓度(ug/ml)，y为吸光值A。
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1ugNH3-N定义为一个酶活力单 位。
Claims (8)
1.一种固化重金属的粪产碱杆菌，其分类命名为：粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）FC-33093，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16874。
2.根据权利要求1所述的固化重金属的粪产碱杆菌，其特征在于，该粪产碱杆菌生产脲酶，所述脲酶酶活在pH=8时最佳。
3.权利要求1所述的固化重金属的粪产碱杆菌在修复被重金属污染的土壤中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将粪产碱杆菌菌株FC-33093活化，在30~45℃下发酵培养24~72 h，然后在发酵液中添加40~160g/L的尿素加入到待修复的被重金属污染的土壤中，固化土壤中的重金属；
其中，发酵培养基为：碳源10~48g/L，氮源10~36g/L，无机盐为1~9g/L，pH6.5~8.5。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的碳源为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糊精、β-环糊精中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述无机盐为磷酸盐、钾盐、钙盐、镁盐中的任意一种或者几种的组合。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将所述的粪产碱杆菌FC-33093进行活化，在37 ℃下发酵36 h，在发酵过程中，通气比为3.0 v/vm、搅拌250 rpm，其中，所述的发酵培养基为：葡萄糖20 g/L，酵母粉18 g/L，磷酸二氢铵4.2 g/L，氯化钙3.1 g/L，尿素10 g/L，无水硫酸镁3.5 g/L，其余为水，pH=7.8。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910201902.4A CN109926448B (zh) | 2019-03-18 | 2019-03-18 | 一种固化重金属的粪产碱杆菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910201902.4A CN109926448B (zh) | 2019-03-18 | 2019-03-18 | 一种固化重金属的粪产碱杆菌及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109926448A true CN109926448A (zh) | 2019-06-25 |
| CN109926448B CN109926448B (zh) | 2021-04-30 |
Family
ID=66987483
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910201902.4A Active CN109926448B (zh) | 2019-03-18 | 2019-03-18 | 一种固化重金属的粪产碱杆菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109926448B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110713959A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-01-21 | 上海海事大学 | 用于重金属污染修复的微生物菌剂及其应用 |
| CN110813979A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-02-21 | 内蒙古科技大学 | 一种利用微生物技术实现氰化尾渣无害化处理的方法 |
| CN112538449A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-03-23 | 中南大学 | 一株粪产碱杆菌dy-8及其在去除重金属镉中的应用 |
| CN113278558A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-08-20 | 南宁市拜欧生物工程有限责任公司 | 一种高产脲酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法 |
| CN113430132A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-09-24 | 广东工业大学 | 一种胞外聚合物及其制备方法和应用 |
| CN114231455A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-03-25 | 南华大学 | 一种生物小球、固定化微球及其制备方法和应用 |
| CN116274338A (zh) * | 2023-01-10 | 2023-06-23 | 浙江大学 | 使用刀豆脲酶诱导沉淀去除填埋场腐殖土重金属的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101245328A (zh) * | 2008-03-21 | 2008-08-20 | 湘潭大学 | 一种粪产碱杆菌及其用于催化降解苯酚废水的方法 |
| CN108500059A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-07 | 青岛农业大学 | 粪产碱杆菌的用途、粪产碱杆菌wz-2及其制备的降解剂和用途 |
| CN108676752A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-10-19 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 粪产碱杆菌y311筛选方法和应用 |
-
2019
- 2019-03-18 CN CN201910201902.4A patent/CN109926448B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101245328A (zh) * | 2008-03-21 | 2008-08-20 | 湘潭大学 | 一种粪产碱杆菌及其用于催化降解苯酚废水的方法 |
| CN108500059A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-07 | 青岛农业大学 | 粪产碱杆菌的用途、粪产碱杆菌wz-2及其制备的降解剂和用途 |
| CN108676752A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-10-19 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 粪产碱杆菌y311筛选方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 康凯璇等: "生物技术在石油污染修复领域的最新进展 ", 《石油化工安全环保技术》 * |
| 熊智慧等: "产碱菌Alcaligenes sp. qz-1对铬污染土壤中玉米生长和铬累积的影响研究 ", 《生态科学》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110813979A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-02-21 | 内蒙古科技大学 | 一种利用微生物技术实现氰化尾渣无害化处理的方法 |
| CN110713959A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-01-21 | 上海海事大学 | 用于重金属污染修复的微生物菌剂及其应用 |
| CN112538449A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-03-23 | 中南大学 | 一株粪产碱杆菌dy-8及其在去除重金属镉中的应用 |
| CN112538449B (zh) * | 2020-12-29 | 2022-05-10 | 中南大学 | 一株粪产碱杆菌dy-8及其在去除重金属镉中的应用 |
| CN113278558A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-08-20 | 南宁市拜欧生物工程有限责任公司 | 一种高产脲酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法 |
| CN113430132A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-09-24 | 广东工业大学 | 一种胞外聚合物及其制备方法和应用 |
| CN114231455A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-03-25 | 南华大学 | 一种生物小球、固定化微球及其制备方法和应用 |
| CN116274338A (zh) * | 2023-01-10 | 2023-06-23 | 浙江大学 | 使用刀豆脲酶诱导沉淀去除填埋场腐殖土重金属的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109926448B (zh) | 2021-04-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109926448A (zh) | 一种固化重金属的粪产碱杆菌及其应用 | |
| Yu et al. | Coupling of biochar-mediated absorption and algal-bacterial system to enhance nutrients recovery from swine wastewater | |
| CN106906170A (zh) | 复合微生物菌剂及其制备方法和应用 | |
| CN108165509B (zh) | 用于河道黑臭水治理的复合微生态制剂及其制备方法 | |
| CN105420147A (zh) | 一种强化硝酸钙治理黑臭河流的复合微生物制剂 | |
| CN103694010B (zh) | 一种污泥超高温好氧发酵方法及其应用 | |
| CN105802870A (zh) | 一种利用微生物复合菌剂处理有机废弃物的方法 | |
| CN101724582A (zh) | 一种修复PAHs污染土壤的固定化菌剂及其制备方法 | |
| CN103484447B (zh) | 一种石油降解酶制剂的制备方法与应用 | |
| KR101715764B1 (ko) | 유기성 폐기물 처리방법 및 이를 위한 미생물 제제 | |
| CN104829078B (zh) | 用混合微生物菌剂无害化处理钻井泥浆的方法 | |
| CN102250808B (zh) | 一株产acc脱氨酶的小麦内生固氮菌及其用途 | |
| CN104830942A (zh) | 有机污水的生物产醇技术 | |
| CN101712937A (zh) | 一种用于化粪池免清掏和除臭的微生物制剂及其制备方法 | |
| CN105062919A (zh) | 一种处理污水及污泥的微生物菌剂 | |
| CN103058389A (zh) | 一种污染水体淤泥原位净化干粉制剂 | |
| CN106187331A (zh) | 一种利用禽畜粪便制备复合微生物生态菌肥及其方法 | |
| CN101186889A (zh) | 一种处理污水污泥的嗜热微生物制剂及其制备方法和应用 | |
| CN107142232A (zh) | 一种复合微生物制剂及其在铅污染土壤中的应用 | |
| CN105385648A (zh) | 减量剩余污泥微生物复合菌剂的筛选、制备和使用方法 | |
| CN112979119B (zh) | 城镇湿垃圾高值化处理系统或方法 | |
| CN111440747B (zh) | 用于污水处理的复合微生物菌剂及微生态制剂与应用 | |
| CN109868243A (zh) | 加快土壤有机物污染修复的微生物菌剂，其制备方法及应用 | |
| CN103146776B (zh) | 一种用枯草芽孢杆菌生产靛蓝色素的方法 | |
| CN107129940A (zh) | 修复石油污染土壤的复合菌群、菌剂及培养、固定化方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |