CN107142232A - 一种复合微生物制剂及其在铅污染土壤中的应用 - Google Patents

一种复合微生物制剂及其在铅污染土壤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，公开了一种复合微生物制剂，其按照如下步骤制备而得：步骤1）制备液体菌剂，步骤2）制备载体，步骤3）搅拌、干燥以及包装。本发明复合微生物制剂中各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，活性高，能够有效地处理铅污染土壤。

Description

一种复合微生物制剂及其在铅污染土壤中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种复合微生物制剂及其在铅污染土壤中的应用。
背景技术
近年来，土壤重金属日趋污染，严重威胁着生态平衡、食品安全和人体健康。其中铅（Pb）、镉（Cd）、汞（Hg）、砷（As）、铬（Cr）被认为是主要重金属污染物中的“五毒”。在我国24个省份（及城市）开展的受污染农作物种植地调查中，80％的土壤污染类型为重金属污染，其中矿冶活动是重金属污染的主要来源。
铅属于重金属的一种，是一种人体的非必需元素，它可影响神经、造血、生殖和发育、内分泌、免疫、骨骼等各类系统和器官。全世界平均每年排放约500万吨铅，其中大部分进入土壤，致使世界各国土壤出现不同程度的铅污染。随着工农业的发展和含铅化学物质的广为应用，铅在矿产开采、电镀冶金、废物处理处置等过程中，大量含铅污染物进入土壤环境，造成世界范围内土壤中铅污染现象普遍存在。铅对人类健康的危害很大，能对神经、心血管和内分泌等个系统造成危害，甚至危及生命。因此铅污染土壤的治理及修复受到越来越多的关注。
目前土壤铅污染修复主要修复途径有三种：物理修复、化学修复和生物修复。物理修复具有彻底、稳定的优点，但实施工程量大、投资费用高，破坏土壤结构，并且还要对换出的污土进行堆放或处理。化学修复虽然简单易行，见效快，但往往修复剂用量较大，且重金属元素易活化。生物修复则包括植物修复和微生物修复，其中植物修复虽然标本兼治，但修复周期长，投资大。微生物修复虽然处理费用低、对周边环境扰动小、不产生二次污染，但合适微生物资源少，修复效果不明显。
发明内容
为了克服现有技术中生物修复铅污染土壤的缺陷，本发明提供了一种复合微生物制剂及其在铅污染土壤中的应用。
本发明是采用如下技术方案实现的
一种复合微生物制剂，其按照如下步骤制备而得：
将短小芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）和枯草芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）按照1-2:2-3的体积比混合，然后按照10%的接种量转到发酵罐中培养24h，得到短小芽孢杆菌-枯草芽孢杆菌混合发酵液；
所述发酵罐培养基组分为：按照质量百分比，葡萄糖8%，酵母膏5%，玉米浆3%，尿素0.1%，硫酸亚铁0.02%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.01%，磷酸氢二钾 0.01%，pH 6.5。
将短小芽孢杆菌-枯草芽孢杆菌混合发酵液、戈登氏菌发酵液、乙酸钙不动杆菌发酵液、鞘氨醇假单胞菌发酵液以及成晶节杆菌发酵液按照7-10:5-8:3-4:2-3:2-3的体积比混合均匀，得到液体菌剂；戈登氏菌发酵液、乙酸钙不动杆菌发酵液、鞘氨醇假单胞菌发酵液以及成晶节杆菌发酵液的浓度均控制在1×1010cfu/ml；
将小麦秸秆用粉碎机粉碎，然后过100目筛，得到秸秆粉，将秸秆粉和硅藻土按照2:1的质量比混合搅拌均匀得到载体；
将液体菌剂添加到两倍重量的载体中，200rpm搅拌3min，然后进行低温干燥，干燥温度为15-20℃，干燥后含水量为6-10％，包装，即得。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC NO.7126（CN104152377A）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC No：0954（CN1554744A）、戈登氏菌(Gordonia amicalis)CGMCC No.4794（CN102250801A）、乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus) CGMCCNo.7334（CN 103266073A）、鞘氨醇假单胞菌（Sphingomonas sp．）CGMCC No.4589（CN102168054A）、成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)ATCC 15481。
本发明所述的菌种均可以从CGMCC和美国模式培养物集存库（ATCC）等商业途径购买得到。本发明的各菌种发酵培养为本领域的常规培养方式，不是本发明创新点，此处不详述。
本发明取得的有益效果主要包括：
本发明微生物制剂中各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，活性高，能够有效地处理铅污染土壤；
相对于单一发酵方式，混合发酵枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌之间的协同作用使得菌株中SOD以及脱氢酶的活性大大提高，提高了处理重金属的能力；
本发明采用硅藻土和秸秆粉作为载体，不仅增强菌株的存活时间及在土壤中的定植能力，对重金属也有较强的吸附性，还可以为土壤提供养料；
本发明利用微生物制剂的修复方法操作简单易行，修复成本低，环保无污染，可应用于大规模的铅污染土壤中，应用前景广阔。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种复合微生物制剂，其按照如下步骤制备而得：
将短小芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）和枯草芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）按照1:2的体积比混合，然后按照10%的接种量转到发酵罐中培养24h，得到短小芽孢杆菌-枯草芽孢杆菌混合发酵液；
所述发酵罐培养基组分为：按照质量百分比，葡萄糖8%，酵母膏5%，玉米浆3%，尿素0.1%，硫酸亚铁0.02%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.01%，磷酸氢二钾 0.01%，pH 6.5。
将短小芽孢杆菌-枯草芽孢杆菌混合发酵液、戈登氏菌发酵液、乙酸钙不动杆菌发酵液、鞘氨醇假单胞菌发酵液以及成晶节杆菌发酵液按照7:5:3:2:2的体积比混合均匀，得到液体菌剂；戈登氏菌发酵液、乙酸钙不动杆菌发酵液、鞘氨醇假单胞菌发酵液以及成晶节杆菌发酵液的浓度均控制在1×1010cfu/ml；
将小麦秸秆用粉碎机粉碎，然后过100目筛，得到秸秆粉，将秸秆粉和硅藻土按照2:1的质量比混合搅拌均匀得到载体；
将液体菌剂添加到两倍重量的载体中，200rpm搅拌3min，然后进行低温干燥，干燥温度为20℃，干燥后含水量为7％，包装，即得。
菌株选自以下：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC NO.7126（可参见CN104152377A）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC No：0954（可参见CN1554744A）、戈登氏菌(Gordonia amicalis) CGMCC No.4794（可参见CN102250801A）、乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus) CGMCC No.7334（可参见CN 103266073A）、鞘氨醇假单胞菌（Sphingomonas sp．）CGMCC No.4589（可参见CN102168054A）、成晶节杆菌(Arthrobactercrystallopoietes)ATCC 15481。
实施例2
一种复合微生物制剂，其按照如下步骤制备而得：
将短小芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）和枯草芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）按照2:3的体积比混合，然后按照10%的接种量转到发酵罐中培养24h，得到短小芽孢杆菌-枯草芽孢杆菌混合发酵液；
所述发酵罐培养基组分为：按照质量百分比，葡萄糖8%，酵母膏5%，玉米浆3%，尿素0.1%，硫酸亚铁0.02%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.01%，磷酸氢二钾 0.01%，pH 6.5。
将短小芽孢杆菌-枯草芽孢杆菌混合发酵液、戈登氏菌发酵液、乙酸钙不动杆菌发酵液、鞘氨醇假单胞菌发酵液以及成晶节杆菌发酵液按照10:8:4:3:3的体积比混合均匀，得到液体菌剂；戈登氏菌发酵液、乙酸钙不动杆菌发酵液、鞘氨醇假单胞菌发酵液以及成晶节杆菌发酵液的浓度均控制在1×1010cfu/ml；
将小麦秸秆用粉碎机粉碎，然后过100目筛，得到秸秆粉，将秸秆粉和硅藻土按照2:1的质量比混合搅拌均匀得到载体；
将液体菌剂添加到两倍重量的载体中，200rpm搅拌3min，然后进行低温干燥，干燥温度为15℃，干燥后含水量为9％，包装，即得。
菌株选自以下：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC NO.7126（CN104152377A）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CGMCC No：0954（CN1554744A）、戈登氏菌(Gordonia amicalis) CGMCC No.4794（CN102250801A）、乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus) CGMCC No.7334（CN 103266073A）、鞘氨醇假单胞菌（Sphingomonas sp．）CGMCC No.4589（CN102168054A）、成晶节杆菌(Arthrobactercrystallopoietes)ATCC 15481。
实施例3
土壤中铅金属的去除试验：
样品选择：样品1：含铅量为400mg/kg；样品2：含铅量为200mg/kg；样品3：含铅量:100mg/kg；样品4：含铅量:50mg/kg。
操作流程：将按照上述实施例制备的微生物制剂0.1kg加入到铅污染土壤样品100kg中，搅拌均匀，培养7d，保证含水量为20-30％左右。7d后，将土壤在65℃下烘干，准确称取1g，用BCR连续提取法，提取土壤中可交换态的铅。步骤如下：准确称取通过100目筛的风干土壤样品1g，加40mL 0.1mol/L的HAc，放在恒温振荡器中24±1℃下连续振荡16h，然后5000rpm下离心15min。取上清液，用ICP-AES测定Pb2+含量。具体结果见表1。
表1
组别 实施例1组 实施例2组
样品1 12.75 15.91
样品2 4.13 6.58
样品3 0.36 0.72
样品4 0.23 0.49
结论：本发明微生物制剂适用于处理各种浓度的铅污染土壤，但是浓度降为100mg/kg以下时，铅浓度下降效果并不明显，可以优选在100-400mg/kg浓度时使用。
实施例4
各菌株的配伍协同除铅效果：
选择土壤样本铅含量为300mg/kg；微生物制剂分别为实施例1组，对照组1（不添加短小芽孢杆菌-枯草芽孢杆菌混合发酵液，其他同实施例1），对照组2（不添加戈登氏菌发酵液，其他同实施例1），对照组3（不添加鞘氨醇假单胞菌发酵液，其他同实施例1），对照组4（短小芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌采用分开发酵的方式，其他同实施例1）；操作流程同实施例 3；具体结果见表2：
表2
组别 实施例1组 对照组1 对照组2 对照组3 对照组4
铅浓度（mg/kg） 6.01 49.8 27.6 31.2 18.7
结论：本发明复合微生物制剂中各菌株相互协同，配伍合理，除铅能力较好，应用前景广阔。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种复合微生物制剂，其按照如下步骤制备而得：步骤1）制备液体菌剂，步骤2）制备载体，步骤3）搅拌、干燥以及包装。
2.根据权利要求1所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物制剂按照如下步骤制备而得：
步骤1）制备液体菌剂：将短小芽孢杆菌-枯草芽孢杆菌混合发酵液、戈登氏菌发酵液、乙酸钙不动杆菌发酵液、鞘氨醇假单胞菌发酵液以及成晶节杆菌发酵液按照7-10:5-8:3-4:2-3:2-3的体积比混合均匀，得到液体菌剂；
步骤2）制备载体：将小麦秸秆用粉碎机粉碎，然后过100目筛，得到秸秆粉，将秸秆粉和硅藻土按照2:1的质量比混合搅拌均匀得到载体；
步骤3）搅拌、干燥以及包装：将液体菌剂添加到两倍重量的载体中，200rpm搅拌3min，然后进行低温干燥，干燥温度为15-20℃，干燥后含水量为6-10wt％，包装，即得。
3.根据权利要求2所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CGMCC NO.7126；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CGMCC No：0954；所述戈登氏菌为戈登氏菌(Gordonia amicalis) CGMCCNo.4794；所述乙酸钙不动杆菌为乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus) CGMCCNo.7334；所述鞘氨醇假单胞菌为鞘氨醇假单胞菌（Sphingomonas sp．）CGMCC No.4589；所述成晶节杆菌为成晶节杆菌(Arthrobacter crystallopoietes)ATCC 15481。
4.根据权利要求2所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述短小芽孢杆菌-枯草芽孢杆菌混合发酵液的制备方法包括如下步骤：将短小芽孢杆菌种子液和枯草芽孢杆菌种子液按照1-2:2-3的体积比混合，然后按照10%的接种量转到发酵罐中培养24h，得到短小芽孢杆菌-枯草芽孢杆菌混合发酵液。
5.根据权利要求4所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述发酵罐培养基组分为：按照质量百分比，葡萄糖8%，酵母膏5%，玉米浆3%，尿素0.1%，硫酸亚铁0.02%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾0.01%，磷酸氢二钾 0.01%，pH 6.5。
6.根据权利要求1-5任其一所述的复合微生物制剂在修复铅土壤中的应用。
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