CN108570325A - 用于高盐土壤修复的微生物制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于高盐土壤修复的微生物制剂，该微生物制剂由核壳结构的颗粒组成，所述核壳结构的颗粒包括复合制剂和附着在复合制剂表面的外部壳层；复合制剂包括脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU‑R8菌剂和节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC‑RL1菌剂；外部壳层为由无机凝胶、氯化钙和醋酸钙构成的壳层。本发明还公开了上述微生物制的制备方法。本发明的微生物制剂可对土壤中有机物和重金属离子进行高效去除，具有良好的应用前景。

Description

用于高盐土壤修复的微生物制剂及其制备方法
技术方案
本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及一种用于高盐土壤修复的微生物制剂及其制备方法。
背景技术
土壤是人类赖以生存的资源，是生态系统中物质、能量循环的重要场所。土壤环境和生态安全是可持续发展的重要保证。随着经济的快速发展，尚未得到有效处理的生产和生活废水、废气、废渣及其它废弃物急剧增加，不少有害物质源源不断地进入土壤并积累，土壤污染的总体形势严峻，对生态环境、农业安全和可持续发展产生较大影响。
近年来，人们对通过微生物进行土壤修复进行了较多研究，然而，对于相对极端条件下，如高盐度条件下土壤修复研究较少，这主要是因为极端条件对微生物的活性影响较大。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种能够对高盐土壤中的有机污染物和重金属进行高效降解的微生物制剂。
本发明的另一目的是提供上述微生物制剂的制备方法。
技术方案：本发明提供一种用于高盐土壤修复的微生物制剂，该微生物制剂由核壳结构的颗粒组成，核壳结构的颗粒包括复合制剂和附着在复合制剂表面的外部壳层；复合制剂包括脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂和节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂；外部壳层为包含无机凝胶、氯化钙和醋酸钙的壳层。
上述脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10620，该菌种已在公开号为CN104745513A、申请号为201510151479.3的在先专利中公开。
上述节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏编号为保藏编号为CGMCC No.10611，该菌种已在公开号为CN104946556A、申请号为201510251242.2的在先专利中公开。
优选地，上述复合制剂和外部壳层的重量比为1∶0.5～0.7。
复合制剂中，脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8的活菌含量为5×108～1.0×1010cfu/kg(即每kg复合制剂中的活菌含量为5×108～1.0×1010cfu)，节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1的活菌含量为5×108～1.0×1010cfu/kg(即每kg复合制剂中的活菌含量为5×108～1.0×1010cfu)。
本发明另一方面提供一种制备上述用于高盐土壤修复的微生物制剂方法，包括以下步骤：
1)将脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8在种子培养基中25～32℃培养48～72小时，然后按照体积比1％～5％接种到发酵培养基中25～32℃培养4～6天，制得脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂；
2)将节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1接种到LB液体培养基中活化，培养到对数生长期OD300＝0.8，按照体积比1％～5％接种到另一LB液体培养基中，25～32℃培养4～6天，制得节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂；
3)将步骤1)制得的脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂和步骤2)制得的节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂按照重量比1∶1.2～1.5的比例混合均匀，加入向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得复合制剂；吸附剂为硅藻土、草炭、发酵后的油枯或活性炭的一种或几种；
4)将无机凝胶、氯化钙和醋酸钙按照重量比为1∶2～5∶1～2的比例混合均匀，均匀喷淋至步骤3)制得的复合制剂表面，干燥，即得到用于高盐土壤修复的微生物制剂。
步骤1)中，种子培养基包括浓度为5～10g/L的甲醇、浓度为2～4g/L的无机氮源、浓度为0.8～2.4g/L的磷酸二氢钾、浓度为3～6g/L的磷酸氢二钠、浓度为1～3g/L的硫酸镁和水，种子培养基的pH为6.8～7.0；发酵培养基包括浓度为10～15g/L的甲醇、浓度为2～6g/L的无机氮源、浓度为1.2～3.5g/L的磷酸二氢钾、浓度为4～8g/L的磷酸氢二钠、浓度为1～3g/L的硫酸镁、浓度为1～5mL/L的微量元素液、浓度为1～3mL/L的维生素辅液和水，发酵培养基的pH为6.8～7.0。
微量元素液包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜、氯化钠、钼酸钠、氯化钾、氯化钴、硼酸、氯化钙和水；维生素辅液包括核黄素、盐酸吡哆素、盐酸硫胺素、叶酸、烟酸、对氨基苯甲酸、泛酸钙、生物素、肌醇和水；无机氮源具体为硫酸铵。
有益效果：本发明的微生物制剂的颗粒呈核壳结构，当微生物制剂进入土壤后，外壳层可吸收空气以及土壤中的水份，络合土壤中的重金属离子，然后内部的复合制剂逐渐分散在土壤中，对有机物进行降解；本发明首次将脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)FJNU-R8和节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1用于高盐土壤修复，并发现两种细菌菌剂结合使用可显著降低高盐土壤中的有机污染物含量，具有良好的应用前景。
具体实施方式
实施例中使用的脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.10620，该菌种已在公开号为CN104745513A、申请号为201510151479.3的在先专利中公开；节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏编号为保藏编号为CGMCC No.10611，该菌种已在公开号为CN104946556A、申请号为201510251242.2的在先专利中公开。
实施例1
用于高盐土壤修复的微生物制剂，由核壳结构的颗粒组成，核壳结构的颗粒包括复合制剂和附着在复合制剂表面的外部壳层；复合制剂包括脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂和节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂；外部壳层为由无机凝胶、氯化钙和醋酸钙构成的壳层。微生物制剂中，脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8的活菌含量为5×109～1.0×1010cfu/mL，节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1的活菌含量为5×109～1.0×1010cfu/mL。该微生物制剂的制备方法如下：
(1)制备脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂：
将脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8在种子培养基中30℃培养60小时，然后按照体积比5％接种到发酵培养基中30℃培养5天。
种子培养基中各物质含量为：浓度为6g/L的甲醇、浓度为2.5g/L的硫酸铵、浓度为1.4g/L的磷酸二氢钾、浓度为3g/L的磷酸氢二钠、浓度为1g/L的硫酸镁和水，种子培养基的pH为7.0。
发酵培养基中各物质含量为：10g/L的甲醇、浓度为4g/L的硫酸铵、浓度为2g/L的磷酸二氢钾、浓度为6g/L的磷酸氢二钠、浓度为2g/L的硫酸镁、浓度为3mL/L的微量元素液、浓度为2mL/L的维生素辅液和水，发酵培养基的pH为7.0。微量元素液中各物质含量为：80g/L硫酸亚铁、22.5g/L硫酸锌、40g/L硫酸锰、5g/L硫酸铜、15g/L氯化钠、0.3g/L钼酸钠、0.3g/L氯化钾、0.03g/L氯化钴、3g/L硼酸、300g/L氯化钙和水。维生素辅液中各物质含量为：200g/L核黄素、400g/L盐酸吡哆素、400g/L盐酸硫胺素、2g/L叶酸、400g/L烟酸、200g/L对氨基苯甲酸400g/L泛酸钙、2g/L生物素、2000g/L肌醇和水。
(2)制备节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂
将节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1接种到LB液体培养基中活化，培养到对数生长期OD300＝0.8，按照体积比5％接种到另一LB液体培养基中，28℃培养5天。
(3)将步骤(1)制得的脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂和步骤(2)制得的节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂按照重量比1∶1.2的比例混合均匀，加入硅藻土，使硅藻土与两种菌剂混合物的质量比为1∶2.5，制得复合制剂；
(4)将无机凝胶、氯化钙和醋酸钙按照重量比为1∶5∶1的比例混合均匀，均匀喷淋至步骤(3)制得的复合制剂表面，干燥，形成外部壳层，复合制剂和外部壳层的重量比为1∶0.5，即得到微生物制剂。
实施例2
用于高盐土壤修复的微生物制剂，由核壳结构的颗粒组成，核壳结构的颗粒包括复合制剂和附着在复合制剂表面的外部壳层；复合制剂包括脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂和节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂；外部壳层为由无机凝胶、氯化钙和醋酸钙构成的壳层。微生物制剂中，脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8的活菌含量为5×109～1×1010cfu/mL，节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1的活菌含量为5×109～1×1010cfu/mL。该微生物制剂的制备方法如下：
(1)制备脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂：
将脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8在种子培养基中32℃培养48小时，然后按照体积比5％接种到发酵培养基中28℃培养6天。
种子培养基中各物质含量为：浓度为5g/L的甲醇、浓度为4g/L的硫酸铵、浓度为0.8g/L的磷酸二氢钾、浓度为5g/L的磷酸氢二钠、浓度为2g/L的硫酸镁和水，种子培养基的pH为6.8。
发酵培养基中各物质含量为：12g/L的甲醇、浓度为6g/L的硫酸铵、浓度为3.5g/L的磷酸二氢钾、浓度为8g/L的磷酸氢二钠、浓度为1g/L的硫酸镁、浓度为5mL/L的微量元素液、浓度为1mL/L的维生素辅液和水，发酵培养基的pH为6.8。微量元素液中各物质含量为：80g/L硫酸亚铁、22.5g/L硫酸锌、40g/L硫酸锰、5g/L硫酸铜、15g/L氯化钠、0.3g/L钼酸钠、0.3g/L氯化钾、0.03g/L氯化钴、3g/L硼酸、300g/L氯化钙和水。维生素辅液中各物质含量为：200g/L核黄素、400g/L盐酸吡哆素、400g/L盐酸硫胺素、2g/L叶酸、400g/L烟酸、200g/L对氨基苯甲酸400g/L泛酸钙、2g/L生物素、2000g/L肌醇和水。
(2)制备节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂
将节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1接种到LB液体培养基中活化，培养到对数生长期OD300＝0.8，按照体积比5％接种到另一LB液体培养基中，30℃培养4天。
(3)将步骤(1)制得的脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂和步骤(2)制得的节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂按照1∶1.5的质量比混合均匀，加入硅藻土，使硅藻土与两种菌剂混合物的质量比为1∶2，制得复合制剂；
(4)将无机凝胶、氯化钙和醋酸钙按照重量比为1∶2∶1的比例混合均匀，均匀喷淋至步骤(3)制得的复合制剂表面，干燥，形成外部壳层，复合制剂和外部壳层的重量比为1∶0.7，即得到微生物制剂。
实施例3
用于高盐土壤修复的微生物制剂，由核壳结构的颗粒组成，核壳结构的颗粒包括复合制剂和附着在复合制剂表面的外部壳层；复合制剂包括脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂和节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂；外部壳层为由无机凝胶、氯化钙和醋酸钙构成的壳层。微生物制剂中，脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8的活菌含量为1×109～5×109cfu/mL，节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1的活菌含量为1×109～5×109cfu/mL。该微生物制剂的制备方法包括：
(1)制备脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂：
将脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8在种子培养基中28℃培养72小时，然后按照体积比3％接种到发酵培养基中25℃培养6天。
种子培养基由以下组分构成：浓度为10g/L的甲醇、浓度为2g/L的硫酸铵、浓度为2.4g/L的磷酸二氢钾、浓度为6g/L的磷酸氢二钠、浓度为3g/L的硫酸镁和水，种子培养基的pH为7.0。
发酵培养基中各物质含量为：15g/L的甲醇、浓度为2g/L的硫酸铵、浓度为1.2g/L的磷酸二氢钾、浓度为4g/L的磷酸氢二钠、浓度为3g/L的硫酸镁、浓度为1mL/L的微量元素液、浓度为3mL/L的维生素辅液和水，发酵培养基的pH为7.0。微量元素液中各物质含量为：80g/L硫酸亚铁、22.5g/L硫酸锌、40g/L硫酸锰、5g/L硫酸铜、15g/L氯化钠、0.3g/L钼酸钠、0.3g/L氯化钾、0.03g/L氯化钴、3g/L硼酸、300g/L氯化钙和水。维生素辅液中各物质含量为：200g/L核黄素、400g/L盐酸吡哆素、400g/L盐酸硫胺素、2g/L叶酸、400g/L烟酸、200g/L对氨基苯甲酸400g/L泛酸钙、2g/L生物素、2000g/L肌醇和水。
(2)制备节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂
将节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1接种到LB液体培养基中活化，培养到对数生长期OD300＝0.8，按照体积比3％接种到另一LB液体培养基中，30℃培养4天。
(3)将步骤(1)制得的脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂和步骤(2)制得的节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂按照1∶1.3的质量比混合均匀，加入硅藻土，使硅藻土与两种菌剂混合物的质量比为1∶2，制得复合制剂；
(4)将无机凝胶、氯化钙和醋酸钙按照重量比为1∶2∶2的比例混合均匀，均匀喷淋至步骤(3)制得的复合制剂表面，干燥，形成外部壳层，复合制剂和外部壳层的重量比为1∶0.6，即得到微生物制剂。
对比例1
用于高盐土壤修复的微生物制剂，由核壳结构的颗粒组成，核壳结构的颗粒包括复合制剂和附着在复合制剂表面的外部壳层；复合制剂包括脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂；外部壳层为由无机凝胶、氯化钙和醋酸钙构成的壳层。微生物制剂中，脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8的活菌含量为5×109～1×1010cfu/mL。该微生物制剂的制备方法如下：
(1)制备脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂：
将脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8在种子培养基中32℃培养48小时，然后按照体积比5％接种到发酵培养基中28℃培养6天。
种子培养基中各物质含量为：浓度为5g/L的甲醇、浓度为4g/L的硫酸铵、浓度为0.8g/L的磷酸二氢钾、浓度为5g/L的磷酸氢二钠、浓度为2g/L的硫酸镁和水，种子培养基的pH为6.8。
发酵培养基中各物质含量为：12g/L的甲醇、浓度为6g/L的硫酸铵、浓度为3.5g/L的磷酸二氢钾、浓度为8g/L的磷酸氢二钠、浓度为1g/L的硫酸镁、浓度为5mL/L的微量元素液、浓度为1mL/L的维生素辅液和水，发酵培养基的pH为6.8。微量元素液中各物质含量为：80g/L硫酸亚铁、22.5g/L硫酸锌、40g/L硫酸锰、5g/L硫酸铜、15g/L氯化钠、0.3g/L钼酸钠、0.3g/L氯化钾、0.03g/L氯化钴、3g/L硼酸、300g/L氯化钙和水。维生素辅液中各物质含量为：200g/L核黄素、400g/L盐酸吡哆素、400g/L盐酸硫胺素、2g/L叶酸、400g/L烟酸、200g/L对氨基苯甲酸400g/L泛酸钙、2g/L生物素、2000g/L肌醇和水。
(2)向步骤(1)制得的脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂中加入硅藻土，使硅藻土与菌剂的质量比为1∶2，制得复合制剂；
(3)将无机凝胶、氯化钙和醋酸钙按照重量比为1∶2∶1的比例混合均匀，均匀喷淋至步骤(2)制得的复合制剂表面，干燥，形成外部壳层，复合制剂和外部壳层的重量比为1∶0.7，即得到微生物制剂。
对比例2
用于高盐土壤修复的微生物制剂，由核壳结构的颗粒组成，核壳结构的颗粒包括复合制剂和附着在复合制剂表面的外部壳层；复合制剂包括节杆菌属细菌(Arthrobactersp.)YC-RL1菌剂；外部壳层为由无机凝胶、氯化钙和醋酸钙构成的壳层。微生物制剂中，节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1的活菌含量为5×109～1×1010cfu/mL。该微生物制剂的制备方法如下：
(1)制备节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂
将节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1接种到LB液体培养基中活化，培养到对数生长期OD300＝0.8，按照体积比5％接种到另一LB液体培养基中，30℃培养4天。
(2)向步骤(1)制得的节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂中加入硅藻土，使硅藻土与菌剂的质量比为1∶2，制得复合制剂；
(3)将无机凝胶、氯化钙和醋酸钙按照重量比为1∶2∶1的比例混合均匀，均匀喷淋至步骤(2)制得的复合制剂表面，干燥，形成外部壳层，复合制剂和外部壳层的重量比为1∶0.7，即得到微生物制剂。
对比例3
用于高盐土壤修复的微生物制剂，由核壳结构的颗粒组成，核壳结构的颗粒包括复合制剂和附着在复合制剂表面的外部壳层；复合制剂包括脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂和节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂；外部壳层为由无机凝胶、氯化钙和醋酸钙构成的壳层。微生物制剂中，脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8的活菌含量为5×109～1×1010cfu/mL，节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1的活菌含量为5×107～1×108cfu/mL。该微生物制剂的制备方法如下：
(1)制备脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂：
将脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8在种子培养基中32℃培养48小时，然后按照体积比5％接种到发酵培养基中28℃培养6天。
种子培养基中各物质含量为：浓度为5g/L的甲醇、浓度为4g/L的硫酸铵、浓度为0.8g/L的磷酸二氢钾、浓度为5g/L的磷酸氢二钠、浓度为2g/L的硫酸镁和水，种子培养基的pH为6.8。
发酵培养基中各物质含量为：12g/L的甲醇、浓度为6g/L的硫酸铵、浓度为3.5g/L的磷酸二氢钾、浓度为8g/L的磷酸氢二钠、浓度为1g/L的硫酸镁、浓度为5mL/L的微量元素液、浓度为1mL/L的维生素辅液和水，发酵培养基的pH为6.8。微量元素液中各物质含量为：80g/L硫酸亚铁、22.5g/L硫酸锌、40g/L硫酸锰、5g/L硫酸铜、15g/L氯化钠、0.3g/L钼酸钠、0.3g/L氯化钾、0.03g/L氯化钴、3g/L硼酸、300g/L氯化钙和水。维生素辅液中各物质含量为：200g/L核黄素、400g/L盐酸吡哆素、400g/L盐酸硫胺素、2g/L叶酸、400g/L烟酸、200g/L对氨基苯甲酸400g/L泛酸钙、2g/L生物素、2000g/L肌醇和水。
(2)制备节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂
将节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1接种到LB液体培养基中活化，培养到对数生长期OD300＝0.8，按照体积比5％接种到另一LB液体培养基中，30℃培养4天。
(3)将步骤(1)制得的脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂和步骤(2)制得的节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂按照5∶1的质量比混合均匀，加入硅藻土，使硅藻土与两种菌剂混合物的质量比为1∶2，制得复合制剂；
(4)将无机凝胶、氯化钙和醋酸钙按照重量比为1∶2∶1的比例混合均匀，均匀喷淋至步骤(3)制得的复合制剂表面，干燥，形成外部壳层，复合制剂和外部壳层的重量比为1∶0.7，即得到微生物制剂。
实施例4
对实施例1～3和对比例1～3的微生物制剂进行降解性能测试：
(1)重金属去除性能测试：
取冶炼石废渣堆周边污染土壤，风干，捣碎，过20目筛，充分混合均匀后置于聚丙烯塑料袋，置于高压灭菌锅中，110℃灭菌100分钟，冷却后加入NaCl，使土壤中NaCl的浓度为20g/kg(即每1kg土壤中含NaCl的质量为40g)，备用。将灭菌后的土壤平均分成18份分别置于消毒后的容器中，将18份灭菌后的土壤分成6组，每组3份。取实施例1～3和对比例1～3制得的微生物制剂，每个实施例/对比例制得的微生物制剂对应加入到其中一组土壤中，混合均匀，其中份土壤中加入的复合微生物土壤修复剂的质量占土壤质量的0.5％。
一个月后检测经处理后的土壤中重金属的可交换态物质的量含量，每组3份取平均值，结果如表1所示。
表1
(2)有机污染物降解性能测试：
取加油站污染土壤，破碎，筛分，去除污染土壤中植物根系和大石块等杂质，同时将大块土进行破碎，将土壤pH调整到6.5～7.5的范围内。将处理后的土壤平均分成36份分别置于消毒后的容器中，将36份灭菌后的土壤分成6组，每组6份。向每组中的各份土壤中分别加入不同重量的NaCl，使每组中的各份土壤中NaCl浓度(即每千克土壤中NaCl含量)分别为0、20g/kg、40g/kg、60g/kg、80g/kg和100g/kg。取实施例1～3和对比例1～3制得的微生物菌剂，每个实施例/对比例制得的微生物菌剂对应加入到其中一组土壤中，混合均匀，其中份土壤中加入的复合微生物土壤修复剂的质量占土壤质量的0.5％。
15天后检测经处理后的土壤中VPH、EPA和TPH去除率。VPH相当于汽油，主要为C5～C10的脂肪烃、芳烃、烯烃和环烷烃；EPH相当于柴油，主要为C10～C40间能被二氯甲烷萃取且不被硅酸镁吸附的有机物总和；TPH为总石油烃(VPH和EPH之和)。结果如表2所示。
表2
由表1可以看出，实施例1～3制得的微生物制剂对重金属具有较好的去除性能。由表2可以看出，实施例1～3制得的微生物制剂在高盐土壤修复方面有较好的性能：当NaCl浓度低于60g/kg时，微生物制剂降解有机污染物的能力基本不受影响；当NaCl达到60g/kg时，微生物制剂降解有机污染物的能力略有下降；当NaCl达到80/kg以上时，微生物制剂降解有机污染物的能力受到较大影响。

Claims (7)

1.一种用于高盐土壤修复的微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂由核壳结构的颗粒组成，所述核壳结构的颗粒包括复合制剂和附着在复合制剂表面的外部壳层；所述复合制剂包括脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂和节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂；所述外部壳层为由无机凝胶、氯化钙和醋酸钙构成的壳层。
2.根据权利要求1所述的用于高盐土壤修复的微生物制剂，其特征在于，所述复合制剂和外部壳层的重量比为1∶0.5～0.7。
3.根据权利要求1所述的用于高盐土壤修复的微生物制剂，其特征在于，所述复合制剂中，所述脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8的活菌含量为5×108～1.0×1010cfu/kg，所述节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1的活菌含量为5×108～1.0×1010cfu/kg。
4.一种制备权利要求1～3中任意一项所述的用于高盐土壤修复的微生物制剂方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8在种子培养基中25～32℃培养48～72小时，然后按照体积比1％～5％接种到发酵培养基中25～32℃培养4～6天，制得脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂；
2)将节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1接种到LB液体培养基中活化，培养到对数生长期OD300＝0.8，按照体积比1％～5％接种到另一LB液体培养基中，25～32℃培养4～6天，制得节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂；
3)将步骤1)制得的脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8菌剂和步骤2)制得的节杆菌属细菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1菌剂按照重量比1∶1.2～1.5的比例混合均匀，加入向该发酵液中加入吸附剂，干燥，即得复合制剂；所述吸附剂为硅藻土、草炭、发酵后的油枯或活性炭；
4)将无机凝胶、氯化钙和醋酸钙按照重量比为1∶2～5∶1～2的比例混合均匀，均匀涂覆至步骤3)制得的复合制剂表面，干燥，即得到所述微生物制剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述种子培养基包括浓度为5～10g/L的甲醇、浓度为2～4g/L的无机氮源、浓度为0.8～2.4g/L的磷酸二氢钾、浓度为3～6g/L的磷酸氢二钠、浓度为1～3g/L的硫酸镁和水，所述种子培养基的pH为6.8～7.0。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述发酵培养基包括浓度为10～15g/L的甲醇、浓度为2～6g/L的无机氮源、浓度为1.2～3.5g/L的磷酸二氢钾、浓度为4～8g/L的磷酸氢二钠、浓度为1～3g/L的硫酸镁、浓度为1～5mL/L的微量元素液、浓度为1～3mL/L的维生素辅液和水，所述发酵培养基的pH为6.8～7.0。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微量元素液包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜、氯化钠、钼酸钠、氯化钾、氯化钴、硼酸、氯化钙和水；所述维生素辅液包括核黄素、盐酸吡哆素、盐酸硫胺素、叶酸、烟酸、对氨基苯甲酸、泛酸钙、生物素、肌醇和水；所述无机氮源具体为硫酸铵。
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