CN104745513A - 一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌及其应用。本发明公开一株脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)，其保藏编号为CGMCC No.10620。本发明公开的一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌FJNU-R8，其培养液中吡咯喹啉醌产量较高，该菌株在以甲醇为碳源的培养基中培养4-6天，吡咯喹啉醌的产量为150-350mg/L，蛋白含量低，发酵性能稳定。本发明公开的生丝微菌可以应用于微生物发酵生产吡咯喹啉醌中。

Description

一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一种红褐色的见光易分解、热稳定的水溶性邻位醌类化合物，是继NAD/NADP和FMN/FAD之后发现的第3种氧化还原酶(oxidordeuctase)的辅酶，参与呼吸链电子传递。PQQ的研究最早可追溯到1959年Hauge发现醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的葡萄糖脱氢酶活性不依赖于吡啶核苷酸和黄素核苷酸，而是依赖一种新的可分离的辅酶。1979年，Duine等采用电子自旋共振、核磁共振和质谱发现这种辅酶为邻位醌类化合物。随后，Salisbury(1979年)采用X射线晶体衍射技术阐明了该辅酶的化学结构，并正式命名为吡咯喹啉醌。

PQQ广泛存在于革兰氏阴性菌中，在人和动、植物体内也均有微量存在，具有促进机体生长、防护肝损伤、促进神经生长因子合成、调节机体自由基水平、提高细菌对毒性和辐射等极端条件的耐受性等功能，是一种独特的生理活性物质，在食品和医药保健领域具有重要的开发前景。PQQ的早期生产方法以化学合成法为主，但其合成步骤繁杂，产率低，副产物多，纯化成本高。微生物发酵法以无机培养基为主，成本低，产率较高且利于纯化，是PQQ的主要产业化方向。

迄今为止，能够产生PQQ的生物仅限于某些革兰氏阴性细菌，哺乳动物自身不能合成只能从外界摄入。不同细菌的PQQ合成量差距十分明显，有的细菌只生成微量的PQQ，以满足自身正常的生理代谢需求，如假单胞菌属(Pseudomonas)、微环菌属(Microcyclus)和枝动杆菌属(Mycoplana)等；有的细菌能产生过量PQQ，如交替单胞菌属(Alteromonas)、嗜甲基菌属(Methylophilus)和生丝微菌属(Hyphomicrobium)等，其中甲基营养型细菌的PQQ生物合成水平最高，且能分泌至细胞外。目前已报道的野生菌株，其PQQ产量较低，均在10mg/L以下。食甲基菌Methylovorus sp.MP688经过培养体系优化，在7.5L发酵罐上的PQQ产量可达2g/L，是目前已报道的产量最高的野生菌株。生丝微菌Hyphomicrobiumdenitrificans FJNU-6培养88h发酵液中PQQ产量达到121mg/L，而蛋白含量只有32mg/L(杨诗颖，陈佳，柯崇榕，黄建忠.吡咯喹啉醌产生菌的筛选及其培养基优化.药物生物技术，2014，21(5):429～432)。而PQQ的具体合成途径尚未彻底阐明，代谢调控机制不清，通过基因工程改造存在较大难度。Methylobacteriumextorquens AM1经过基因改造后的产量也只有114mg/L，是已报道的产量最高的基因工程菌株。此外，PQQ作为辅酶易与培养液中的氨基酸发生不可逆的反应形成稳定的无活性恶唑类化合物，会造成产量急剧下降。因此，筛选胞外蛋白含量低且产量较高的菌株是微生物发酵生产PQQ进行工业化的关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高微生物发酵生产吡咯喹啉醌的产量和/或降低发酵液中的蛋白含量。

为了解决以上技术问题，本发明提供一株脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)，其保藏编号为CGMCC No.10620。

为了解决以上技术问题，本发明还提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的脱氮生丝微菌；

所述菌剂为用于产生吡咯喹啉醌的菌剂。

为了解决以上技术问题，本发明还提供所述的脱氮生丝微菌或所述的菌剂在生产吡咯喹啉醌中的应用。

为了解决以上技术问题，本发明还提供一种生产吡咯喹啉醌的方法，包括将所述的脱氮生丝微菌进行发酵培养，得到吡咯喹啉醌。

上述方法中，所述发酵培养中使用的发酵培养基由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、无机氮源、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、微量元素液、维生素辅液，溶剂为水；所述甲醇在所述发酵培养基中的浓度为10-15g/L、所述无机氮源在所述发酵培养基中的浓度为2-6g/L、所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为1.2-3.5g/L、所述磷酸氢二钠在所述发酵培养基中的浓度为4-8g/L、所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为1-3g/L、所述微量元素液在所述发酵培养基中的浓度为1-5mL/L、所述维生素辅液在所述发酵培养基中的浓度为1-3mL/L，pH 6.8-7.0；

所述微量元素液由溶质和溶剂组成，溶质为硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜、氯化钠、钼酸钠、氯化钾、氯化钴、硼酸和氯化钙，溶剂为水；所述硫酸亚铁在所述微量元素液中的浓度为80g/L，所述硫酸锌在所述微量元素液中的浓度为22.5g/L，所述硫酸锰在所述微量元素液中的浓度为40g/L，所述硫酸铜在所述微量元素液中的浓度为5g/L，所述氯化钠在所述微量元素液中的浓度为15g/L，所述钼酸钠在所述微量元素液中的浓度为0.3g/L，所述氯化钾在所述微量元素液中的浓度为0.3g/L，所述氯化钴在所述微量元素液中的浓度为0.03g/L，所述硼酸在所述微量元素液中的浓度为3g/L，所述氯化钙在所述微量元素液中的浓度为300g/L；

所述维生素辅液由溶质和溶剂组成，溶质为核黄素、盐酸吡哆素、盐酸硫胺素、叶酸、烟酸、对氨基苯甲酸、泛酸钙、生物素和肌醇，溶剂为水；所述核黄素在所述维生素辅液中的浓度为200g/L，所述盐酸吡哆素在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述盐酸硫胺素在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述叶酸在所述维生素辅液中的浓度为2g/L，所述烟酸在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述对氨基苯甲酸在所述维生素辅液中的浓度为200g/L，所述泛酸钙在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述生物素在所述维生素辅液中的浓度为2g/L，所述肌醇在所述维生素辅液中的浓度为2000g/L；

所述无机氮源具体为硫酸铵；

所述发酵培养基具体由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、微量元素液、维生素辅液，溶剂为水；所述甲醇在所述发酵培养基中的浓度为10g/L、所述硫酸铵在所述发酵培养基中的浓度为2g/L、所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为3.5g/L、所述磷酸氢二钠在所述发酵培养基中的浓度为5g/L、所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为1.5g/L、所述微量元素液在所述发酵培养基中的浓度为1.2mL/L、所述维生素辅液在所述发酵培养基中的浓度为2mL/L，pH 6.8。

上述任一所述的方法中，所述发酵培养的条件如下：温度25-32℃、溶氧≥20％、pH为6.7-7.2、当发酵液中的甲醇浓度降到1g/L时添加甲醇，使甲醇浓度为3-5g/L；

所述发酵液包含所述脱氮生丝微菌和所述发酵培养基；

所述发酵培养基占所述发酵时所用发酵罐装液量的2/3-3/4，具体为7/10；

所述温度具体为30℃；

所述发酵培养的转速为150-600rpm，具体为250rpm；

所述发酵培养的通气量为0.3-0.6vvm；

所述pH具体是通过氨水进行调节的。

上述任一所述的方法中，所述发酵培养的时间为4-6天。

上述任一所述的方法中，所述脱氮生丝微菌是通过种子液接入所述发酵培养基进行所述发酵培养的。

上述任一所述的方法中，所述种子液是将所述的脱氮生丝微菌在种子培养基中培养得到的：

所述种子培养基由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、无机氮源、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁，溶剂为水；所述甲醇在所述种子培养基中的浓度为5-10g/L，所述无机氮源在所述种子培养基中的浓度为2-4g/L，所述磷酸二氢钾在所述种子培养基中的浓度为0.8-2.4g/L，所述磷酸氢二钠在所述种子培养基中的浓度为3-6g/L，所述硫酸镁在所述种子培养基中的浓度为1-3g/L，pH 6.8-7.0；

所述种子液是按照体积比1％-5％接种到所述发酵培养基中的，具体是按照体积比5％接种到所述发酵培养基中的；

所述无机氮源具体为硫酸铵；

所述种子培养基具体由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁，溶剂为水；所述甲醇在所述种子培养基中的浓度为6g/L，所述硫酸铵在所述种子培养基中的浓度为2.5g/L，所述磷酸二氢钾在所述种子培养基中的浓度为1.4g/L，所述磷酸氢二钠在所述种子培养基中的浓度为3g/L，所述硫酸镁在所述种子培养基中的浓度为1g/L，pH 6.8-7.2。

上述任一所述的方法中，所述种子液为将所述的脱氮生丝微菌在所述种子培养基中进行一级培养，得到一级种子液；再将所述一级种子液在所述种子培养基中进行二级培养，得到的二级种子液；

所述一级培养的条件为25-32℃培养24-36小时，具体为32℃培养24-36小时；

所述一级培养的转速为150-220rpm，具体为220rpm；

所述一级种子液的OD₆₅₀在2.5-3.0之间，以所述种子培养基调零；

所述二级培养的条件为25-32℃培养24-36小时、空气流量4-7L/min，具体为30℃培养24-36小时，空气流量5L/min；

所述二级培养的转速为400-600rpm，具体为500rpm；

所述二级种子液的OD₆₅₀在4.0-5.0之间，以所述种子培养基调零；

所述一级种子液是按照体积比1％-3％接种到所述种子培养基中进行所述二级培养的，具体是按照体积比1％接种到所述种子培养基中进行所述二级培养的；

所述二级培养中，所述种子培养基占所述二级培养时所用发酵罐装液量的1/3-3/4，具体为1/2。

上述任一所述的无机氮源为硫酸铵、氯化铵和氨水中至少一种。

本发明提供的一株产吡咯喹啉醌的生丝微菌FJNU-R8，其培养液中吡咯喹啉醌产量较高，该菌株在以甲醇为碳源、硫酸铵为氮源的培养基中培养4-6天，吡咯喹啉醌的产量为150-350mg/L，且分泌的胞外蛋白含量较低，有利于吡咯喹啉醌的纯化，发酵性能稳定。本发明提供的生丝微菌可以应用于微生物发酵生产吡咯喹啉醌中。

保藏说明

菌种名称：脱氮生丝微菌

拉丁名：Hyphomicrobium denitrificans

菌株编号：FJNU-R8

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年3月13日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10620

附图说明

图1为发酵上清中的吡咯喹啉醌鉴定。

图2为菌株FJNU-R8的扫描电镜照片。

图3为实施例3中菌株FJNU-R8的生长曲线及发酵液中PQQ、甲醇和蛋白浓度的变化。

图4为实施例4中菌株FJNU-R8在100L发酵罐中的生长曲线、发酵液中PQQ和甲醇浓度的变化。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

富集培养基：甲醇20g/L、硫酸铵3g/L、磷酸二氢钾1.4g/L、磷酸氢二钠3g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.5g/L、硫酸亚铁1g/L，余量为蒸馏水，pH 6.8。

筛选培养基：甲醇15g/L、硫酸铵4g/L、磷酸二氢钾1.4g/L、磷酸氢二钠5g/L、硫酸镁1g/L、氯化钙0.075g/L、硫酸亚铁0.05g/L，余量为蒸馏水，pH 6.8。

筛选培养基平板：在筛选培养基中加入1.5g/100ml的琼脂。

微量元素液由溶质和溶剂组成，溶质为硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜、氯化钠、钼酸钠、氯化钾、氯化钴、硼酸和氯化钙，溶剂为水；所述硫酸亚铁在所述微量元素液中的浓度为80g/L，所述硫酸锌在所述微量元素液中的浓度为22.5g/L，所述硫酸锰在所述微量元素液中的浓度为40g/L，所述硫酸铜在所述微量元素液中的浓度为5g/L，所述氯化钠在所述微量元素液中的浓度为15g/L，所述钼酸钠在所述微量元素液中的浓度为0.3g/L，所述氯化钾在所述微量元素液中的浓度为0.3g/L，所述氯化钴在所述微量元素液中的浓度为0.03g/L，所述硼酸在所述微量元素液中的浓度为3g/L，所述氯化钙在所述微量元素液中的浓度为300g/L。

维生素辅液由溶质和溶剂组成，溶质为核黄素、盐酸吡哆素、盐酸硫胺素、叶酸、烟酸、对氨基苯甲酸、泛酸钙、生物素和肌醇，溶剂为水；所述核黄素在所述维生素辅液中的浓度为200g/L，所述盐酸吡哆素在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述盐酸硫胺素在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述叶酸在所述维生素辅液中的浓度为2g/L，所述烟酸在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述对氨基苯甲酸在所述维生素辅液中的浓度为200g/L，所述泛酸钙在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述生物素在所述维生素辅液中的浓度为2g/L，所述肌醇在所述维生素辅液中的浓度为2000g/L。

下述实施例中的FJNU-6是下述文献中的脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)FJNU-6：“杨诗颖，陈佳，柯崇榕，黄建忠.吡咯喹啉醌产生菌的筛选及其培养基优化.药物生物技术，2014，21(5):429～432”。公众可从福建师范大学获得。

实施例1中的发酵培养基的组成：甲醇20g/L、硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾1.2g/L，磷酸氢二钠4g/L、硫酸镁1g/L、微量元素液1mL/L、维生素辅液2mL/L，余量为蒸馏水，pH 6.8。

实施例1、吡咯喹啉醌产生菌的筛选

一、将从泉州市泉港石化区采集的化工污水水样用富集培养基30℃培养48h，得到培养液，将其稀释涂布在筛选培养基平板上，待长出单菌落(甲基营养菌)后，分别挑取单菌落接种于发酵培养基，30℃，220r/min振荡培养96h，观察菌体生长情况。分离得到的120多株甲基营养菌中有47株能使筛选培养基变色(红色、褐色或者黄色)。

二、将步骤一初筛得到的47株菌株进行复筛，将47株菌株分别在发酵培养基中进行培养，30℃，220r/min振荡培养88h，得到各发酵培养液，将各发酵培养液离心，得到各发酵培养液的上清，取各发酵培养液的上清通过HPLC测定上清中的吡咯喹啉醌含量，即PQQ产量，结果如表1所示。

HPLC测定发酵培养液的上清中的吡咯喹啉醌含量的条件如下：

检测波长：254和330nm；

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C₁₈反相柱(5μm，2.1×100mm)；

柱温：35℃；

流动相：水：乙腈(体积比)＝95:5；

流速：0.5mL/min。

表1表明，编号为FJNU-R8的菌株发酵培养液的上清中吡咯喹啉醌含量最高，达到13mg/L。

三、为确定各菌株发酵培养液上清中的目的产物的确为吡咯喹啉醌，采用UV二维图谱和电喷雾离子阱质谱分析方法，将各菌株发酵培养液与Sigma公司的吡咯喹啉醌标准品进行比对鉴定。结果如图1所示。

图1中，A为吡咯喹啉醌标准品的UV二维图谱(上)和电喷雾离子阱质谱(下)，B为表1中编号为FJNU-R8的菌株的发酵培养液上清的UV二维图谱(上)和电喷雾离子阱质谱(下)，C为吡咯喹啉醌特征离子峰的结构式。

表1中各菌的发酵培养液上清的UV二维图谱和电喷雾离子阱质谱与图1中的B类似。

UV二维图谱分析表明，菌株发酵培养液上清具有与吡咯喹啉醌标准品一致的254nm和330nm的特征吸收峰；电喷雾离子阱质谱分析表明，菌株发酵培养液上清的化合物离子峰m/z为333.05、348.80和371.06，与PQQ·H⁺(333.04)、PQQ·H₂O(348.82)和PQQ·H₂O·Na⁺(371.01)分子离子峰相一致。

表1 部分初筛菌株的PQQ产量

实施例2、菌株FJNU-R8的鉴定

一、按《伯杰氏系统细菌学手册》(第二版，2004)对实施例1筛选得到的编号为FJNU-R8菌株进行形态学特征及生理生化特征的鉴定，结果如表2所示。

FJNU-R8菌株好氧，革兰氏阴性，适宜生长温度为25-32℃，适宜生长pH为6.0-8.0；能利用阿拉伯糖、蔗糖、木糖、果糖、海藻糖和棉子糖，不能利用甘露醇、阿拉伯醇和肌醇等醇类物质，也不能利用鸟氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；氧化酶阳性，脲酶和色氨酸脱氨酶阴性；甲基红、V-P和淀粉水解试验阴性；能还原亚硝酸盐，不产吲哚和硫化氢；无荧光反应。

二、FJNU-R8菌株菌落较小，圆形，规则，中间凹下，边缘整齐，质地粘状，随着菌龄增长会由乳白色变为浅褐色，菌落表面由平滑变为褶皱。

三、FJNU-R8菌株的扫描电镜照片如图2所示。图2表明，FJNU-R8菌株菌体呈梭状，不产芽孢，有单极生的丝状长物，大小约为0.3–0.6×1–3μm。

表2 菌株FJNU-R8的生理生化特征

注：“+”：阳性；“－”：阴性；FR1：7AMC+赖氨酸；FR3：4MU+磷酸盐；FR4：4MU+α-D吡喃葡萄糖；FR5：7AMC+脯氨酸；FR6：4MU+α-D吡喃半乳糖；FR7：7AMC+γ-谷氨酸盐；FR8：4MU+双磷酸盐；FR9：4MU+葡萄糖醛酸化物；FR10：4MU+β-D吡喃半乳糖；FR12：4MU-2-乙酰胺基-乙去氧吡喃葡萄糖+4MUα-L-阿拉伯吡喃葡萄糖苷；4MU：4-甲基伞形酮；7AMC：7-甲基香豆素酰胺。

四、提取FJNU-R8菌株的基因组DNA，用细菌通用引物8F/1492R(8F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)PCR扩增其16S rDNA，并将其16S rDNA测序，得到其16S rDNA的序列。

根据FJNU-R8菌株的形态特征、生理生化特征及其16S rDNA序列，FJNU-R8菌株经鉴定为脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)，该菌株已于2015年3月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.10620。

实施例3、培养时间对吡咯喹啉醌产量的影响

一、挑取实施例2的FJNU-R8单菌落至装有30mL如下A所示的种子培养基的三角瓶中，30℃、220rpm振荡培养24-36小时(OD₆₅₀在2.5-3.0之间，以种子培养基调零)，得到种子液；然后将种子液按体积百分含量5％的接种量转接入装有50mL如下B所示的发酵培养基的250mL三角瓶中，在30℃、150-220rpm(第0-2天：220rpm；第2-6天：150rpm)条件下培养5-6天，得到发酵液，从转接开始每隔8小时取发酵液，测定发酵液的生物量(OD₆₅₀，以B所示的发酵培养基调零)，并将发酵液于10000×g离心10min，取上清，测定发酵液的吡咯喹啉醌(PQQ)产量、甲醇和蛋白含量。

A、种子培养基由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁，溶剂为水；所述甲醇在所述种子培养基中的浓度为6g/L，所述硫酸铵在所述种子培养基中的浓度为2.5g/L，所述磷酸二氢钾在所述种子培养基中的浓度为1.4g/L，所述磷酸氢二钠在所述种子培养基中的浓度为3g/L，所述硫酸镁在所述种子培养基中的浓度为1g/L，pH 6.8-7.0。

B、发酵培养基由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、微量元素液、维生素辅液，溶剂为水；所述甲醇在所述发酵培养基中的浓度为12g/L、所述硫酸铵在所述发酵培养基中的浓度为1.5g/L、所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为2.94g/L、所述磷酸氢二钠在所述发酵培养基中的浓度为4g/L、所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为1.1g/L、所述微量元素液在所述发酵培养基中的浓度为0.9mL/L、所述维生素辅液在所述发酵培养基中的浓度为1.1mL/L，pH 6.8。

二、吡咯喹啉醌(PQQ)产量采用高效液相色谱(HPLC)进行测定，具体测定步骤如下：

(一)PQQ标准曲线的绘制

准确称取0.0256g PQQ标准品(购自美国Sigma公司)置于50mL容量瓶中，加入30mL高纯水，于60℃水浴加热使其完全溶解，待冷却至室温后用高纯水定容至50mL；摇匀后依次用高纯水稀释成512μg/ml、256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml和8μg/ml的PQQ标准水溶液，用0.22μm水系滤头过滤PQQ标准水溶液，收集滤液，采用HPLC进行测定，以254nm吸收峰的峰面积为横坐标，PQQ标准水溶液浓度为纵坐标，绘制PQQ标准曲线，得到PQQ标准曲线公式。

HPLC测定条件如下：

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C₁₈反相柱(5μm，2.1×100mm)；

柱温：35℃；

检测波长：254和330nm；

流动相：水：乙腈(体积比)＝95:5；

流速：0.5mL/min。

(二)发酵液中PQQ含量的测定

将步骤一得到的上清用0.22μm水系滤头过滤，收集滤液，得到待测样品，将待测样品替换步骤(一)的PQQ标准水溶液，其余步骤不变，得到待测样品在254nm处吸收峰的峰面积，再将其带入PQQ标准曲线公式得到滤液的PQQ含量，再换算成发酵液的PQQ含量。

PQQ标准曲线公式为：吡咯喹啉醌(PQQ)含量(μg/mL)＝3.3394×P_st-0.3075，其中P_st代表254nm处吸收峰的峰面积(P_st单位：mAu)。

三、发酵液中甲醇含量的测定

将步骤一得到的上清用0.22μm水系滤头过滤，收集滤液，采用气相色谱(GC)法测定滤液的甲醇含量，再换算成发酵液的甲醇含量。GC法参照文献“张平.气相色谱法检测甲醇酵母表达系统中发酵液中甲醇的含量.2006,18(4):84”中公开的方法。

四、发酵液中蛋白含量的测定

将步骤一得到的上清用0.22μm水系滤头过滤，收集滤液，采用福林酚法进行测定滤液中的蛋白含量，再换算成发酵液的蛋白含量。福林酚法参照文献“Lowry,0.H.,N.J.Rosebrough,A.L.Farr,and R.J.Randall.Protein measurement with the Folinphenol reagent.J.Biol.Chem，1951，193(1):265-275.”中公开的方法。

发酵液的生物量(OD₆₅₀)、吡咯喹啉醌(PQQ)产量、甲醇以及蛋白含量的测定结果如图3所示。

图3表明，从转接开始发酵96小时时，发酵液中的PQQ含量达到153mg/L，蛋白质含量为637mg/L。

实施例4、100L发酵罐发酵生产吡咯喹啉醌

一、挑取实施例2的FJNU-R8单菌落至装有50mL实施例3中A所示的种子培养基的三角瓶中，32℃、220rpm振荡培养24-36小时(OD₆₅₀在2.5-3.0之间，以实施例3中A所示的种子培养基调零)，得到一级种子液。

二、将一级种子液按体积百分含量1％的接种量转接入装有5L实施例3中A所示的种子培养基的10L发酵罐中，30℃、500rpm振荡培养24-36小时(OD₆₅₀在4.0-5.0之间，以实施例3中A所示的种子培养基调零)空气流量5L/min，得到二级种子液。

三、将二级种子液按体积百分含量5％的接种量转接入装有70L如下C所示的发酵培养基的100L发酵罐中，30℃、250rpm发酵培养，通气量0.3-0.6vvm。发酵过程中，通过流加氨水控制pH在6.8左右(pH6.7-7.2)，调节通气量使溶氧不低于20％。发酵后期(当甲醇浓度降到1g/L的时候)流加甲醇，甲醇浓度控制在3-5g/L之间。

C、发酵培养基由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、微量元素液、维生素辅液，溶剂为水；所述甲醇在所述发酵培养基中的浓度为10g/L、所述硫酸铵在所述发酵培养基中的浓度为2g/L、所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为3.5g/L、所述磷酸氢二钠在所述发酵培养基中的浓度为5g/L、所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为1.5g/L、所述微量元素液在所述发酵培养基中的浓度为1.2mL/L、所述维生素辅液在所述发酵培养基中的浓度为2mL/L，pH 6.8。

每隔8小时取发酵液，测定发酵液的生物量(OD₆₅₀，以C所示的发酵培养基调零)，并将发酵液于10000×g离心10min，取上清，测定发酵液中的甲醇含量和PQQ产量，测定方法同实施例3。结果如图4所示。

图4表明，将二级种子液转接到C所示的发酵培养基后，在发酵136小时时，PQQ含量达到347mg/L，生物量(OD₆₅₀)达到22，且蛋白质含量为61mg/L。

将FJNU-6作为对照菌株，进行上述实验，结果证明该菌株在发酵136小时时，PQQ含量达到178mg/L，生物量(OD₆₅₀)达到23，且蛋白质含量为183mg/L。

Claims (10)

1.一株脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)，其保藏编号为CGMCC No.10620。

2.一种菌剂，该菌剂的活性成分为权利要求1所述的脱氮生丝微菌。

3.权利要求1所述的脱氮生丝微菌或权利要求2所述的菌剂在生产吡咯喹啉醌中的应用。

4.一种生产吡咯喹啉醌的方法，包括将权利要求1所述的脱氮生丝微菌进行发酵培养，得到吡咯喹啉醌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养中使用的发酵培养基由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、无机氮源、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、微量元素液、维生素辅液，溶剂为水；所述甲醇在所述发酵培养基中的浓度为10-15g/L、所述无机氮源在所述发酵培养基中的浓度为2-6g/L、所述磷酸二氢钾在所述发酵培养基中的浓度为1.2-3.5g/L、所述磷酸氢二钠在所述发酵培养基中的浓度为4-8g/L、所述硫酸镁在所述发酵培养基中的浓度为1-3g/L、所述微量元素液在所述发酵培养基中的浓度为1-5mL/L、所述维生素辅液在所述发酵培养基中的浓度为1-3mL/L，pH6.8-7.0；

所述微量元素液由溶质和溶剂组成，溶质为硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜、氯化钠、钼酸钠、氯化钾、氯化钴、硼酸和氯化钙，溶剂为水；所述硫酸亚铁在所述微量元素液中的浓度为80g/L，所述硫酸锌在所述微量元素液中的浓度为22.5g/L，所述硫酸锰在所述微量元素液中的浓度为40g/L，所述硫酸铜在所述微量元素液中的浓度为5g/L，所述氯化钠在所述微量元素液中的浓度为15g/L，所述钼酸钠在所述微量元素液中的浓度为0.3g/L，所述氯化钾在所述微量元素液中的浓度为0.3g/L，所述氯化钴在所述微量元素液中的浓度为0.03g/L，所述硼酸在所述微量元素液中的浓度为3g/L，所述氯化钙在所述微量元素液中的浓度为300g/L；

所述维生素辅液由溶质和溶剂组成，溶质为核黄素、盐酸吡哆素、盐酸硫胺素、叶酸、烟酸、对氨基苯甲酸、泛酸钙、生物素和肌醇，溶剂为水；所述核黄素在所述维生素辅液中的浓度为200g/L，所述盐酸吡哆素在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述盐酸硫胺素在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述叶酸在所述维生素辅液中的浓度为2g/L，所述烟酸在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述对氨基苯甲酸在所述维生素辅液中的浓度为200g/L，所述泛酸钙在所述维生素辅液中的浓度为400g/L，所述生物素在所述维生素辅液中的浓度为2g/L，所述肌醇在所述维生素辅液中的浓度为2000g/L。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件如下：温度25-32℃、溶氧≥20％、pH为6.7-7.2、当发酵液中的甲醇浓度降到1g/L时添加甲醇，使甲醇浓度为3-5g/L。

7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的时间为4-6天。

8.根据权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于：所述权利要求1所述的脱氮生丝微菌是通过种子液接入所述发酵培养基进行所述发酵培养的。

9.根据权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于：所述种子液是将权利要求1所述的脱氮生丝微菌在种子培养基中培养得到的：

所述种子培养基由溶质和溶剂组成，溶质为甲醇、无机氮源、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁，溶剂为水；所述甲醇在所述种子培养基中的浓度为5-10g/L，所述无机氮源在所述种子培养基中的浓度为2-4g/L，所述磷酸二氢钾在所述种子培养基中的浓度为0.8-2.4g/L，所述磷酸氢二钠在所述种子培养基中的浓度为3-6g/L，所述硫酸镁在所述种子培养基中的浓度为1-3g/L，pH 6.8-7.0；

所述种子液是按照体积比1％-5％接种到所述发酵培养基中的，具体是按照体积比5％接种到所述发酵培养基中的。

10.根据权利要求4-9任一所述的方法，其特征在于：所述种子液为将权利要求1所述的脱氮生丝微菌在所述种子培养基中进行一级培养，得到一级种子液；再将所述一级种子液在所述种子培养基中进行二级培养，得到的二级种子液；

所述一级培养的条件为25-32℃培养24-36小时，具体为32℃培养24-36小时；

所述二级培养的条件为25-32℃培养24-36小时、空气流量4-7L/min，具体为30℃培养24-36小时，空气流量5L/min；

所述一级种子液是按照体积比1％-3％接种到所述种子培养基中进行所述二级培养的，具体是按照体积比1％接种到所述种子培养基中进行所述二级培养的。