CN112143683B - 培养基及应用该培养基提高维生素pqq转化率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种培养基及应用所述培养基对菌种进行发酵培养的方法，所述培养基通过在现有的通用培养基中添加适当重量的甲胺乙醇溶液和甲醛，甲胺和甲醛一部分通过丝氨酸循环进行碳固定，另一部分氧化成甲酸可以产生能量供甲基营养菌生长，物料配伍合理，碳源品种丰富，可有效加快生丝微菌胞内脱氢酶的生成而大量诱导合成PQQ，该培养基应用于PQQ的发酵生产中，有效提高从甲醇到PQQ的转化率。本发明所述的应用所述培养基对菌种进行发酵培养的方法，在三级扩大培养过程中，发酵培养80h后开始流加补料培养基，能有效加快生丝微菌胞内代谢活动，缩短代谢流路，提高脱氢酶的生成量，进一步提高了甲醇的利用率；且上述补料策略操作简便，适合工业化生产。

Description

培养基及应用该培养基提高维生素PQQ转化率的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种培养基及应用该培养基提高维生素PQQ转化率的发酵方法。
背景技术
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone简称PQQ)是一种具有氧化还原活性的芳香三环邻位醌。PQQ是继黄素核苷酸FMN/FAD)和吡啶核苷酸(N AD/NADP)之后被发现的第三种氧化还原酶的辅因子，参与呼吸链的电子传递。PQQ具有促进机体生长、防护肝损伤、促进神经生长因子合成、调节机体自由基水平、提高细菌对毒性和辐射等极端条件的耐受性等功能，是一种独特的生理活性物质，在食品和医药保健领域具有重要的开发前景。
PQQ的生产方法分化学合成法和生物合成法，但其合成步骤繁杂，产率低，副产物多，纯化成本高。而生物合成的方法具有成本低、步骤少、分离更为容易的优点，是PQQ产业化的主要方向。CN104745513B专利公开的培养基以甲醇为单一碳源培养4-6天，吡咯喹啉醌的产量仅为150-350mg/L，未达到1g/L；CN106282044B专利公开的培养基以甲醇为单一碳源，发酵过程补料工艺粗放简陋，不易于控制，虽然最终产物浓度达到1783mg/L，但耗用甲醇过多，转化率低。因此，开发新的培养基和提高维生素PQQ的转化率是微生物发酵生产PQQ进行工业化的关键。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种培养基及应用该培养基提高维生素PQQ转化率的发酵方法。本发明所述培养基，通过在现有的通用培养基中添加适当重量的甲胺乙醇溶液和甲醛，甲胺和甲醛一部分通过丝氨酸循环进行碳固定，另一部分氧化成甲酸可以产生能量供甲基营养菌生长，物料配伍合理，碳源品种丰富，可加快生丝微菌胞内脱氢酶的生成而大量诱导合成PQQ，该培养基应用于PQQ的发酵生产中，可以提高从甲醇到PQQ的转化率；进一步，应用所述培养基进行的PQQ发酵方法，通过控制补料策略，能有效加快生丝微菌胞内代谢活动，缩短代谢流路，提高脱氢酶的生成量，进而提高甲醇的利用率，且所述补料策略操作简便，适用于工业化生产。
本发明所采用的技术方案为：
一种培养基，原料组分包括无水甲醇0.1-2重量份、甲胺乙醇溶液0.1-0.5重量份、甲醛0.02-0.1重量份、(NH4)2SO4 0.5-1.0重量份、KH2PO4 0.1-0.5重量份、Na2HPO4 0.6-1.0重量份、MgSO4·7H2O 0.1-0.3重量份、FeSO4·7H2O 0.005-0.01重量份、ZnSO4·7H2O 0.01-0.03重量份、CoCl2·6H2O 0.005-0.01重量份、水100重量份。
进一步优选所述培养基的原料还包括0.001-0.003重量份的辅酶Q10、0.01-0.05重量份的甘氨酸和0.01-0.03重量份的天冬酰胺；
所述甲胺乙醇溶液的质量浓度为30％。
一种提高维生素PQQ转化率的发酵方法，应用所述培养基对菌种进行发酵培养，从发酵液中获得PQQ。
所述菌种为生丝微菌菌种。
所述发酵培养包括三级扩大培养，具体步骤如下：
(1)将菌种的种子液加入培养基中，进行一级扩大培养；
(2)将一级扩大培养得到的菌液加入到培养基中，进行二级扩大培养；
(3)将二级扩大培养得到的菌液加入到含培养基的发酵罐进行三级扩大培养。
步骤(1)中，所述一级扩大培养的条件为在150rpm、34℃条件下进行振荡培养20-24h；
步骤(2)中，所述二级扩大培养的条件为在150rpm、34℃条件下进行振荡培养18-22h。
步骤(3)中，进行三级扩大培养时，搅拌速度为100-400rpm，最大通气比0.2-0.5vvm，0-80h发酵培养温度为33-35℃，80h后至结束发酵培养温度为30-32℃。
步骤(3)中，发酵培养80h后开始流加补料培养基。
所述补料培养基的组成为无水甲醇40％、甲胺乙醇溶液(质量浓度为30％)10％、甲醛5％、甲酸2％、甘氨酸0.5％，其余为水。
所述补料培养基的加入总体积占所述发酵罐内培养基初始体积的25-40％；
80h后所述补料培养基的流加策略如下：
80h开始流加占所述发酵罐内培养基初始体积2％的补料培养基，之后每隔1h检测OD，OD每增加2流加占所述培养基初始体积1％的补料培养基，直至流加完全部的补料培养基。
本发明的有益效果为：
(1)本发明所述的培养基，通过在通用培养基中添加适当重量的甲胺乙醇溶液和甲醛，生丝微菌一方面能够将甲醛、甲醇、甲胺乙醇中的一碳化合物氧化成二氧化碳从而提供能量(异化作用)，另一方面能够通过同化作用变成细胞自身的碳骨架，作为一碳化合物脱氢酶的辅因子—PQQ必须在生长代谢过程中随脱氢酶的生成而大量诱导合成，从而本发明所述培养基的物料配伍合理，碳源品种丰富，可有效加快生丝微菌胞内脱氢酶的生成而大量诱导合成PQQ，该培养基应用于PQQ的发酵生产中，有效提高从甲醇到PQQ的转化率。
(2)本发明还提供一种培养基，在通用培养基中添加适当重量配比的甲胺乙醇溶液(30％浓度)和甲醛，甲胺和甲醛一部分通过丝氨酸循环进行碳固定，另一部分氧化成甲酸以产生能量供甲基营养菌生长，甘氨酸、辅酶Q10和天冬酰胺能够参与氧化磷酸化及ATP的生成过程，可作为细胞代谢和细胞呼吸的激活剂，提高抗氧化性，各组分协同发挥功效，将该培养基应用于PQQ的发酵生产中，进一步提高从甲醇到PQQ的转化率。数据显示，应用该培养基对生丝微菌进行发酵培养，甲醇转化率高达0.9％。
(3)本发明所述的应用所述培养基对菌种进行发酵培养的方法，在三级扩大培养过程中，发酵培养80h后开始流加补料培养基，能有效加快生丝微菌胞内代谢活动，缩短代谢流路，提高脱氢酶的生成量，进一步提高了甲醇的利用率；且上述补料策略操作简便，适合工业化生产。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种培养基，原料组分包括：无水甲醇1.5g、质量浓度为30％的甲胺乙醇溶液0.5g、甲醛0.1g、(NH4)2SO4 1.0g、KH2PO4 0.5g、Na2HPO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.01g、ZnSO4·7H2O 0.03g、CoCl2·6H2O 0.01g、辅酶Q10 0.003g、甘氨酸0.05g、天冬酰胺0.03g、水100g。
应用所述培养基对生丝微菌进行发酵培养，具体步骤如下：
(1)一级扩大培养：将生丝微菌甘油管保存的种子液加入培养基中，于150rpm、34℃条件下进行振荡培养22h；
(2)二级扩大培养：将步骤(1)得到的菌液加入到培养基中，于150rpm、34℃条件下进行振荡培养20h；
(3)三级扩大培养：将步骤(2)得到的菌液加入到含培养基的发酵罐进行培养，具体为：使用机械搅拌通风的15L发酵罐，培养基初始体积为10L，搅拌速度400rpm，通气比0.4vvm，0-80h发酵培养温度34℃，80h后至结束发酵培养温度31℃，并于80h开始流加补料培养基；
80h后所述补料培养基的流加策略如下：80h开始流加占培养基初始体积2％的补料培养基(即10L×2％＝200ml)，之后每隔1h检测OD，OD每增加2流加占所述培养基初始体积1％(即10L×1％＝100ml)的补料培养基，直至OD增长66个后，流加完全部的补料培养基。
其中，所述补料培养基的配方组成按照重量份计，包括以下组分：无水甲醇40％、甲胺乙醇溶液(质量浓度为30％)10％、甲醛5％、甲酸2％、甘氨酸0.5％，其余为水；补料培养基总体积为发酵罐内培养基初始体积的35％即10L×35％＝3500ml。
实施例2
本实施例提供一种培养基，原料组分包括：无水甲醇1g、质量浓度为30％的甲胺乙醇溶液0.5g、甲醛0.03g、(NH4)2SO4 1.0g、KH2PO4 0.4g、Na2HPO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、FeSO4·7H2O 0.008g、ZnSO4·7H2O 0.03g、CoCl2·6H2O 0.005g、辅酶Q10 0.001g、甘氨酸0.02g、天冬酰胺0.03g、水100g。
应用所述培养基对生丝微菌进行发酵培养，具体步骤如下：
(1)一级扩大培养：将生丝微菌甘油管保存的种子液加入培养基中，于150rpm、34℃条件下进行振荡培养24h；
(2)二级扩大培养：将步骤(1)得到的菌液加入到培养基中，于150rpm、34℃条件下进行振荡培养22h；
(3)三级扩大培养：将步骤(2)得到的菌液加入到含培养基的发酵罐进行培养，具体为：使用机械搅拌通风的15L发酵罐，培养基初始体积为10L，搅拌速度100rpm，通气比0.2vvm，0-80h发酵培养温度33℃，80h后至结束发酵培养温度30℃，并于80h开始流加补料培养基(配方组成和总体积均与实施例1相同)；
80h后所述补料培养基的流加策略与实施例1完全相同。
实施例3
本实施例提供一种培养基，原料组分包括：无水甲醇2g、质量浓度为30％的甲胺乙醇溶液0.4g、甲醛0.05g、(NH4)2SO4 0.8g、KH2PO4 0.5g、Na2HPO4 0.8g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.005g、ZnSO4·7H2O 0.02g、CoCl2·6H2O 0.007g、辅酶Q10 0.003g、甘氨酸0.04g、天冬酰胺0.02g、水100g。
应用所述培养基对生丝微菌进行发酵培养，具体步骤如下：
(1)一级扩大培养：将生丝微菌甘油管保存的种子液加入培养基中，于150rpm、34℃条件下进行振荡培养20h；
(2)二级扩大培养：将步骤(1)得到的菌液加入到培养基中，于150rpm、34℃条件下进行振荡培养18h；
(3)三级扩大培养：将步骤(2)得到的菌液加入到含培养基的发酵罐进行培养，具体为：使用机械搅拌通风的15L发酵罐，培养基初始体积为10L，搅拌速度200rpm，通气比0.5vvm，0-80h发酵培养温度35℃，80h后至结束发酵培养温度32℃，并于80h开始流加补料培养基(配方组成和总体积均与实施例1相同)；
80h后所述补料培养基的流加策略与实施例1完全相同。
实施例4
本实施例提供一种培养基，原料组分包括：无水甲醇0.8g、质量浓度为30％的甲胺乙醇溶液0.3g、甲醛0.08g、(NH4)2SO4 0.7g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4 0.6g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.01g、ZnSO4·7H2O 0.01g、CoCl2·6H2O 0.01g、辅酶Q10 0.002g、甘氨酸0.03g、天冬酰胺0.01g、水100g。
应用所述培养基对生丝微菌进行发酵培养的方法同实施例1。
实施例5
本实施例提供一种培养基，原料组分包括：无水甲醇0.3g、质量浓度为30％的甲胺乙醇溶液0.1g、甲醛0.02g、(NH4)2SO4 0.5g、KH2PO4 0.1g、Na2HPO4 0.6g、MgSO4·7H2O 0.1g、FeSO4·7H2O 0.005g、ZnSO4·7H2O 0.01g、CoCl2·6H2O 0.005g、辅酶Q10 0.001g、甘氨酸0.01g、天冬酰胺0.01g、水100g。
应用所述培养基对生丝微菌进行发酵培养的方法同实施例1。
实施例6
本实施例提供一种培养基，与实施例1的区别在于：原料组分不含辅酶Q10、甘氨酸、天冬氨酸，其原料组成为：无水甲醇2g、质量浓度为30％的甲胺乙醇溶液0.5g、甲醛0.1g、(NH4)2SO4 1.0g、KH2PO4 0.5g、Na2HPO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.01g、ZnSO4·7H2O 0.03g、CoCl2·6H2O 0.01g、水100g。
发酵培养方法同实施例1。其中，所述补料培养基的加入总体积占所述发酵罐内培养基初始体积的40％。
实施例7
本实施例提供一种培养基，与实施例1的区别在于：原料组分不含辅酶Q10、甘氨酸、天冬氨酸，其原料组成为：无水甲醇0.1g、质量浓度为30％的甲胺乙醇溶液0.5g、甲醛0.1g、(NH4)2SO4 1.0g、KH2PO4 0.5g、Na2HPO4 1.0g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O 0.01g、ZnSO4·7H2O 0.03g、CoCl2·6H2O 0.01g、水100g。
发酵培养方法同实施例1。其中，所述补料培养基的加入总体积占所述发酵罐内培养基初始体积的25％。
对比例1
本对比例提供一种培养基，与实施例1的区别仅在于，原料组分不含甲胺乙醇溶液、甲醛、甘氨酸、辅酶Q10和天冬酰胺，其他原料组分和用量均与实施例1相同。
发酵培养方法同实施例1。
对比例2
本对比例提供一种培养基，与实施例1的区别仅在于，原料组分不含甲胺乙醇溶液、甲醛、甘氨酸和天冬酰胺，其他原料组分和用量均与实施例1相同。
发酵培养方法同实施例1。
对比例3
本对比例提供一种培养基，与实施例1的区别仅在于，原料组分不含甘氨酸和辅酶Q10，其他原料组分和用量均与实施例1相同。
发酵培养方法同实施例1。
对比例4
本对比例提供一种培养基，与实施例1的区别仅在于，原料组分不含甘氨酸和天冬酰胺，其他原料组分和用量均与实施例1相同。
发酵培养方法同实施例1。
对比例5
本对比例提供一种培养基，采用现有文献提供的配方组成，具体为：甲醇12g、硫酸铵5g、酵母抽提粉5g、磷酸二氢钾2g、磷酸氢二钠5g、七水硫酸镁0.6g、二水氯化钙0.06g、四水硫酸锰0.08g、七水硫酸锌0.1g。
发酵培养方法同实施例1。
实验例
在使用不同培养基对生丝微菌进行发酵培养后，放罐时对PQQ效价(发酵效价)和甲醇转化率进行检测，结果如表1所示。
表1-不同实施例的发酵放罐检测结果
从表1可以看出，本发明实施例1-5提供的培养基，用于生丝微菌的发酵培养后，能有效提高从甲醇到PQQ的转化率，尤其是实施例1中提供的培养基效果最好，放罐效价高达2.0g/L，甲醇转化率高达0.9％；而对比例1培养基不添加甲胺乙醇溶液(30％浓度)、甲醛、甘氨酸、辅酶Q10和天冬酰胺中的任一成分，进行发酵培养的甲醇转化率最低；对比例2-4仅添加甲胺乙醇溶液(30％浓度)、甲醛、甘氨酸、辅酶Q10和天冬酰胺中的两种或三种成分，进行发酵培养后的放罐效价和甲醇转化率均明显低于实施例1-5培养基的放罐效价和甲醇转化率，从而说明本发明所述培养基采用的原料甲胺乙醇溶液(30％浓度)、甲醛、甘氨酸、辅酶Q10和天冬酰胺一起发挥协同作用，同时采用五种原料制得的培养基应用于PQQ的发酵生产中，能够有效提高从甲醇到PQQ的转化率。
综上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种提高维生素PQQ转化率的发酵方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)一级扩大培养：将生丝微菌的种子液加入培养基中，于150rpm、34℃条件下进行振荡培养20-24h；
(2)二级扩大培养：将步骤(1)得到的菌液加入到培养基中，于150rpm、34℃条件下进行振荡培养18-22h；
(3)三级扩大培养：将步骤(2)得到的菌液加入到含培养基的发酵罐进行培养，搅拌速度为100-400rpm，通气比为0.2-0.5vvm，0-80h发酵培养温度为33-35℃，80h后至结束发酵培养温度为30-32℃，并于80h开始流加补料培养基；
其中，步骤(1)、(2)、(3)中所述培养基的原料组分构成为：无水甲醇0.1-2重量份、甲胺乙醇溶液0.1-0.5重量份、甲醛0.02-0.1重量份、(NH4)2SO40.5-1.0重量份、KH2PO40.1-0.5重量份、Na2HPO40.6-1.0重量份、MgSO4·7H2O 0.1-0.3重量份、FeSO4·7H2O 0.005-0.01重量份、ZnSO4·7H2O 0.01-0.03重量份、CoCl2·6H2O 0.005-0.01重量份、水100重量份、辅酶Q10 0.001-0.003重量份、甘氨酸0.01-0.05重量份、天冬酰胺0.01-0.03重量份；所述甲胺乙醇溶液的质量浓度为30％；
步骤(3)中所述补料培养基的配方组成按照重量份计，由以下组分构成：无水甲醇40％、甲胺乙醇溶液10％、甲醛5％、甲酸2％、甘氨酸0.5％，其余为水；所述甲胺乙醇溶液的质量浓度为30％；所述补料培养基的加入总体积占所述发酵罐内培养基初始体积的25-40％；
步骤(3)中80h后所述补料培养基的流加策略如下：80h开始流加占所述发酵罐内培养基初始体积2％的补料培养基，之后每隔1h检测OD，OD每增加2流加占所述培养基初始体积1％的补料培养基，直至流加完全部的补料培养基。
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