CN113699194B - 一种利用氧化还原电位调控甲基营养菌生产吡咯喹啉醌的方法 - Google Patents
一种利用氧化还原电位调控甲基营养菌生产吡咯喹啉醌的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种利用氧化还原电位调控甲基营养菌生产吡咯喹啉醌的方法,包括菌种活化、种子培养和发酵生产;在甲基营养菌发酵生产吡咯喹啉醌的体系中引入氧化还原电位电极,通过控制体系中通气量和搅拌转速来调节发酵生产阶段的氧化还原电位在高电位氧化阶段和低电位还原阶段变化,进而保证菌体生长和吡咯喹啉醌的积累,本发明的方法能够缩短发酵时间,同时提高吡咯喹啉醌的产量和产率及发酵体系的稳定性。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种利用氧化还原电位(ORP)调控甲基营养菌生产吡咯 喹啉醌的方法,属于发酵工程技术领域。
背景技术
吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)是继NAD+/NADP+和FMN/FAD 之后发现的第3种氧化还原酶的辅酶,天然存在于自然界中,是迄今为止发现 的唯一存在于所有动植物组织中的生物因子。PQQ作为一种独特的生理活性物 质,在抗衰老、抗疲劳、提高免疫力以及炎症、肝病和骨质疏松等疾病的治疗或辅助治疗方面具有很大的潜力,具有良好的医疗和保健开发前景。PQQ对于 哺乳动物自身是不能合成的,只能从食物中摄取,在芹菜、菠菜、青椒、猕猴 桃和木瓜含量较高,特别是在人类母乳中含量高达140-180μg/L。2003年日本 科学家Kasahara在《Nature》发表论文建议将PQQ归类为维生素,2018年美国 癌症与抗衰老专家Bruce N.Ames在PNAS上发文将PQQ定义为“长寿维生素”。 目前,PQQ在美国、日本和欧盟被归类为类维生素,作为膳食补充剂进行销售。
迄今为止,能够合成PQQ的生物主要是革兰氏阴性细菌,其中,生丝微菌 的PQQ生物合成水平高,已经替代化学合成法,成为PQQ的主要生产方式。截止2020年12月,共有6家企业向美国FDA进行NDI认证或GRAS注册, 其中5家企业均采用以生丝微菌Hyphomicrobium为生产菌株的微生物发酵法进行PQQ的生产合成。目前PQQ的具体生物合成途径基本阐释清楚,该过程需 要平衡细胞质中的氧含量,满足PqqE和PqqC对厌氧微环境和氧气的需求,完成PqqA的缩合和羟基化以及AHQQ的环化和氧化。工业上生产PQQ均是采用 补料分批发酵(CN106282044A、GRN No.641、GRN No.694、GRN No.701和 GRN No.709)或者半连续发酵(CN109628509A),将溶氧控制在5%以上。但 是,上述发酵工艺存在三个突出的问题:1、前期低溶氧影响菌体生长,造成发 酵周期长;2、中期供氧不足中间体大量积累,造成碳源转化率低;3、后期菌 体自溶螯合PQQ,造成单位细胞产率低。申请号为CN201510262476.7的中国专 利公开了一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法,其中具体公开了一种生丝微 菌,采用控氧工艺(DO维持在5%)在80T发酵罐中培养生丝微菌,从发酵液 中获取获得吡咯喹啉醌,240h的PQQ产量为1.78g/L。因此,根据PQQ强氧化 还原特性及其独特的生物合成途径,建立高效的发酵生产工艺是提高生丝微菌 工业化生产PQQ的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用氧化还原电位(ORP)调控甲基营养菌生 产吡咯喹啉醌的方法,通过三阶段ORP控制策略,调节吡咯喹啉醌的发酵过程, 从而提高吡咯喹啉醌的产量和产率及发酵体系的稳定性,缩短发酵时间。
本发明的技术方案如下:
本发明的目的在于一种利用氧化还原电位调控甲基营养菌生产吡咯喹 啉醌的方法,包括菌种活化、种子培养和发酵生产;在甲基营养菌发酵生产吡 咯喹啉醌的体系中引入氧化还原电位电极,通过控制体系中通气量和搅拌转速 来调节发酵生产阶段的氧化还原电位在高电位氧化阶段和低电位还原阶段变 化,进而保证菌体生长和吡咯喹啉醌的积累。
进一步的,所述发酵生产中引入氧化还原电位电极后设置三阶段控制发酵 过程,所述氧化还原电位维持在190~250mV范围内,其中,第一阶段为发酵开 始至35~60h内,为高电位强氧化阶段;第二阶段发酵开始后的35~60h至70~100h 内,为低电位强还原阶段;第三阶段为发酵开始后的70~100h至150~200h之后, 为中和阶段。
进一步的,所述甲基营养菌为脱氮生丝微菌或扭托甲基杆菌或者是其经过基因工程改造的突变菌,具体为脱氮生丝微菌FJNU-6或脱氮生丝微菌DSM 1869或扭托甲基杆菌ATCC 8457;其中,脱氮生丝微菌FJNU-6(脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans)已于2014年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号为CGMCC No.1.12893;脱氮生丝微菌DSM 1869和扭托甲基杆菌ATCC 8457为模式菌株,可以从DSM或ATCC官网购买。
进一步的,引入氧化还原电位电极后,在电位调控过程中当氧化还原电位 低于设定值时,首先增加通气量再调高搅拌转速;当氧化还原电位高于设定值 时,首先降低搅拌转速再减少通气量。
进一步的,所述利用氧化还原电位调控甲基营养菌生产吡咯喹啉醌的方 法,具体包括以下步骤:
S1、菌种活化:采用固体培养基,其pH为6.0~7.5,含有甲醇且能提供碳 源、氮源及无机盐,活化培养时将菌种在固体培养基中进行平板划线后,于恒 温培养箱中25~30℃培养3~4天;
S2、种子培养:采用液体培养基,其pH为6.0~7.5,含有甲醇且能提供碳 源、氮源及无机盐,培养时挑取1~2环经过菌种活化后的活化菌接种于装有液体培养基的锥形瓶中,培养温度为25~30℃,摇床转速150~220rpm,培养时间 为18~36h,OD650为1.2~1.6;
S3、发酵生产:采用液体培养基,其pH为6.0~7.5,含有甲醇且能提供碳 源、氮源及无机盐,将培养后的种子接种在发酵罐中的液体培养基中,接种量 为5~10%v/v,培养温度为25~30℃,pH为6.0~7.5,溶解氧不低于10%,发酵 培养时间为150~200h;发酵生产过程中流加25%氨水维持pH,流加甲醇维持发 酵体系中甲醇浓度不低于1g/L。
进一步的,所述菌种活化的固体培养基包括以下组分:甲醇、硫酸铵、磷 酸二氢钾、硫酸镁和琼脂粉。
进一步的,所述种子培养的液体培养基包括以下组分:甲醇、硫酸铵、磷 酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁和维生素辅液。
进一步的,所述发酵生产的液体培养基包括以下组分:甲醇、硫酸铵、磷 酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、微量元素液和维生素辅液。
进一步的,所述维生素辅液包括以下组分:核黄素、盐酸吡哆素、盐酸硫 胺素、肌醇、叶酸、烟酸、对氨基苯甲酸、泛酸钙和生物素。
进一步的,所述微量元素液包括以下组分:硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、 硫酸铜、氯化钠、钼酸钠、氯化钾、氯化钴、硼酸和氯化钙。
相较于现有技术,本发明的有益效果在于:本发明在甲基营养菌发酵生产 吡咯喹啉醌的过程中引入了氧化还原电位电极,设置三阶段氧化还原电位控制 策略,其中,第一阶段为高电位强氧化阶段,有利于菌体生长,溶氧较高;第 二阶段为低电位强还原阶段,能够诱导吡咯喹啉醌合成,溶氧较低;第三阶段 为中和阶段,既有利于生产也有利于生长;另一方面,三阶段发酵过程克服了 现有工艺中溶解氧大于5%时菌体容易自溶,导致发酵不稳定的问题;因此,本 发明中通过三阶段发酵控制,调节吡咯喹啉醌的发酵过程,缩短发酵时间,提高发酵体系的稳定性,同时能够促进菌体的快速高密度生长,和产物吡咯喹啉 醌的高效累积,进而提高吡咯喹啉醌的产量和产率。
附图标记
图1为根据本发明实施例1中不同氧化还原电位对脱氮生丝微菌DSM 1869 产PQQ的影响;
图2为根据本发明实施例4中三阶段发酵控制脱氮生丝微菌FJNU-6产PQQ 的过程曲线示意图。
具体实施方式
下面结合附图和较佳实施例对本发明做进一步的说明,给出的实施例仅为 了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到; 实施例1
一种利用氧化还原电位调控甲基营养菌生产吡咯喹啉醌的方法,在甲基营 养菌发酵生产吡咯喹啉醌的体系中引入氧化还原电位电极,通过控制体系中通 气比和搅拌转速来调节氧化还原电位,实现吡咯喹啉醌在发酵生产中三阶段控 制发酵,进而保证菌体生长和吡咯喹啉醌的积累;在本实施例中甲基营养菌采 用脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)DSM 1869,具体包括以下步骤:
S1、菌种活化:采用固体培养基,其pH为6.5,活化培养时取1环脱氮生 丝微菌DSM1869在固体培养基中进行平板划线后,于恒温培养箱中30℃培养 4天;其中,所述菌种活化的固体培养基组成为:甲醇10g/L、硫酸铵4g/L、磷 酸二氢钾3g/L、硫酸镁2g/L和琼脂粉20g/L;
S2、种子培养:采用液体培养基,其pH为6.5,培养时挑取1环经过菌种 活化后的活化菌接种于装有液体培养基的锥形瓶中,培养温度为30℃,摇床转 速220rpm,培养时间为18~24h,OD650为1.5;所述种子培养的液体培养基组 成为:甲醇5g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钠4g/L、硫酸镁1g/L 和维生素辅液1mL/L;其中维生素辅液包含核黄素2g/L、盐酸吡哆素0.1g/L、 盐酸硫胺素0.2g/L、肌醇0.2g/L、叶酸2mg/L、烟酸0.8g/L、对氨基苯甲酸0.1g/L、 泛酸钙0.3g/L、生物素6mg/L;
S3、发酵生产:采用液体培养基,其pH为6.5,将培养后的种子接种在5L 发酵罐中的液体培养基中,接种量为10%v/v,培养温度为30℃,溶解氧不低于 10%,发酵培养时间为150~200h;发酵生产过程中流加25%氨水维持pH,流加 甲醇维持发酵体系中甲醇浓度不低于1g/L;所述发酵生产的液体培养基组成为: 甲醇10g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠3g/L、硫酸镁1.6g/L、 微量元素液2mL/L和维生素辅液1mL/L;其中,所述微量元素包含硫酸亚铁 80g/L、硫酸锌22.5g/L、硫酸锰40g/L、硫酸铜5g/L、氯化钠15g/L、钼酸钠0.3g/L、 氯化钾0.3g/L、氯化钴0.03g/L、硼酸3g/L、氯化钙300g/L;所述维生素辅液包含核黄素2g/L、盐酸吡哆素0.1g/L、盐酸硫胺素0.2g/L、肌醇0.2g/L、叶酸2mg/L、烟酸0.8g/L、对氨基苯甲酸0.1g/L、泛酸钙0.3g/L和生物素6mg/L;通过氧化还 原电位电极测定发酵罐中发酵体系的氧化还原电位,通气量为1.0vvm,初始搅 拌速度为200rpm,通过控制通气量和搅拌转速来调节氧化还原电位在 190~250mV之间,搅拌转速范围在150~800rpm进行调整,通气量范围在 0.8~2.0vvm进行调整,例如,当ORP低于设定值时,首先增加通气量再调高搅 拌转速;当ORP高于设定值时,首先降低搅拌转速再调减少通气量。
本实施例中选择将发酵罐中发酵体系的氧化还原电位控制在130mV和 160mV为对照组,将发酵罐中发酵体系的氧化还原电位控制在250mV、220mV 和190mV为实验组,实验组和对照组在利用氧化还原电位调控甲基营养菌生产 吡咯喹啉醌中只有发酵过程氧化还原电位不同,其余条件均相同,取最终生物 量和吡咯喹啉醌(PQQ)产量进行对比,具体结果参见图1,生物量与ORP电 位成正比,250mV时细胞干重达51.89g/L,130mV时细胞干重仅有17.15g/L; 前80小时190mV时PQQ产量最高,单位细胞产量5.29mg/g;80小时后220mV 的PQQ产量最高,达到604.63mg/L,单位细胞产量12.34mg/g。
实施例2
一种利用氧化还原电位调控甲基营养菌生产吡咯喹啉醌的方法,在本实施 例中甲基营养菌采用脱氮生丝微菌DSM 1869,具体包括以下步骤:
S1、菌种活化:采用固体培养基,其pH为7.5,活化培养时取1环脱氮生 丝微菌DSM1869在固体培养基中进行平板划线后,于恒温培养箱中25℃培养4 天;
S2、种子培养:采用液体培养基,其pH为7.5,培养时挑取2环经过菌种 活化后的活化菌接种于装有液体培养基的锥形瓶中,培养温度为25℃,摇床转 速200rpm,培养时间为30~36h,OD650为1.2~1.5;
S3、发酵生产:采用液体培养基,将培养后的种子接种在5L发酵罐中的液 体培养基中,接种量为5%v/v,培养温度为25℃,初始pH为6.0,溶解氧不低 于10%,发酵时间为200h;发酵生产过程中流加25%氨水维持pH,流加甲醇维 持发酵体系中甲醇浓度不低于1g/L;通过氧化还原电位电极测定发酵罐中发酵 体系的氧化还原电位,初始通气量为1.0vvm,初始搅拌速度为200rpm,在本实 施例中,发酵生产中引入氧化还原电位电极后设置三阶段控制发酵过程,在发 酵开始0-60h为第一阶段:调节通气量和搅拌转速,将发酵体系中氧化还原电位 维持在250±5mV,pH维持在6.0~6.5;发酵进行到60-100h为第二阶段,调节 通气量和搅拌转速,将发酵体系中氧化还原电位维持在190±5mV,pH维持在 6.5~7.0;发酵进行到100-200h为第三阶段,调节通气量和搅拌转速,将发酵体 系中氧化还原电位维持在220±5mV,pH维持在7.0~7.5,其中,通过控制搅拌转速和通气量来调整氧化还原电位,搅拌转速范围在150~800rpm进行调整,通 气量范围在0.8~2.0vvm进行调整;
其中,上述过程中采用的菌种活化的固体培养基、种子培养的液体培养基 和发酵生产的液体培养基同实施例1;
在本实施例中,选择发酵生产过程中不控制氧化还原电位,只维持发酵体 系中溶解氧不低于10%为对照组,按照三阶段发酵控制氧化还原电位同时控制 溶解氧不低于10%为实验组,其余条件均相同,取最终生物量和吡咯喹啉醌 (PQQ)产量进行对比,具体结果参见表1,通过控制ORP,单位细胞的PQQ 产量提高了64.67%,PQQ合成速率提高了49.41%;
表1脱氮生丝微菌DSM 1869控制ORP与不控制ORP发酵结果对比表
培养条件 | 生物量(g/L) | PQQ产量(mg/L) | 发酵时间(h) |
DO>10% | 57.66 | 636.45 | 220 |
控制ORP | 47.56 | 864.44 | 200 |
实施例3
一种利用氧化还原电位调控甲基营养菌生产吡咯喹啉醌的方法,在本实施 例中甲基营养菌采用扭托甲基杆菌ATCC 8457,具体包括以下步骤:
S1、菌种活化:采用固体培养基,其pH为7.0,活化培养时取1环扭托甲 基杆菌ATCC8457在固体培养基中进行平板划线后,于恒温培养箱中28℃培养 3天;
S2、种子培养:采用液体培养基,其pH为7.0,培养时挑取2环经过菌种 活化后的活化菌接种于装有液体培养基的锥形瓶中,培养温度为28℃,摇床转 速150rpm,培养时间为24~30h,OD650为1.6~2.0;
S3、发酵生产:采用液体培养基,初始pH为7.5,将培养后的种子接种在 5L发酵罐中的液体培养基中,接种量为8%v/v,培养温度为28℃,溶解氧不低 于10%,发酵时间为150h;发酵生产过程中流加25%氨水维持pH,流加甲醇维 持发酵体系中甲醇浓度不低于1g/L;通过氧化还原电位电极测定发酵罐中发酵 体系的氧化还原电位,初始通气量为1.0vvm,初始搅拌速度为200rpm,在本实 施例中,发酵生产中引入氧化还原电位电极后设置三阶段控制发酵过程,在发 酵开始0-35h为第一阶段:调节通气量和搅拌转速,将发酵体系中氧化还原电位 维持在250±5mV,pH维持在6.5;发酵进行到35-70h为第二阶段,调节通气 量和搅拌转速,将发酵体系中氧化还原电位维持在190±5mV,pH维持在6.5~7.0;发酵进行到70-150h为第三阶段,调节通气量和搅拌转速,将发酵体系中氧化还原电位维持在220±5mV,pH维持在7.5,其中,通过控制搅拌转速和 通气量来调整氧化还原电位,搅拌转速范围在150~800rpm进行调整,通气量范 围在0.8~2.0vvm进行调整;
其中,上述过程中采用的菌种活化的固体培养基、种子培养的液体培养基 和发酵生产的液体培养基同实施例1;
在本实施例中,选择发酵生产过程中不控制氧化还原电位,只维持发酵体 系中溶解氧不低于10%为对照组,按照三阶段发酵控制氧化还原电位同时控制 溶解氧不低于10%为实验组,其余条件均相同,取最终生物量和吡咯喹啉醌 (PQQ)产量进行对比,具体结果参见表2,通过控制ORP,单位细胞的PQQ 产量提高了76.8%,PQQ合成速率提高了62.94%;
表2扭托甲基杆菌ATCC 8457控制ORP与不控制ORP发酵结果对比
培养条件 | 生物量(g/L) | PQQ产量(mg/L) | 发酵时间(h) |
DO>10% | 62.37 | 227.84 | 160 |
控制ORP | 53.89 | 348.05 | 150 |
实施例4
一种利用氧化还原电位调控甲基营养菌生产吡咯喹啉醌的方法,在本实施 例中甲基营养菌采用脱氮生丝微菌FJNU-6,具体包括以下步骤:
S1、菌种活化:采用固体培养基,其pH为6.5,活化培养时取1环脱氮生 丝微菌FJNU-6在固体培养基中进行平板划线后,于恒温培养箱中30℃培养3 天;
S2、种子培养:采用液体培养基,其pH为6.5,培养时挑取1环经过菌种 活化后的活化菌接种于装有液体培养基的锥形瓶中,培养温度为30℃,摇床转 速220rpm,培养时间为18~24h,OD650为1.5~2.0;
S3、发酵生产:采用液体培养基,初始pH为7.0,将培养后的种子接种在 5L发酵罐中的液体培养基中,接种量为10%v/v,培养温度为30℃,溶解氧不 低于10%,发酵时间为192h;发酵生产过程中流加25%氨水维持pH,流加甲醇 维持发酵体系中甲醇浓度不低于1g/L;通过氧化还原电位电极测定发酵罐中发 酵体系的氧化还原电位,初始通气量为1.0vvm,初始搅拌速度为200rpm,在本 实施例中,发酵生产中引入氧化还原电位电极后设置三阶段控制发酵过程,在 发酵开始0-40h为第一阶段:调节通气量和搅拌转速,将发酵体系中氧化还原电 位维持在250±5mV,pH维持在6.5;发酵进行到40-70h为第二阶段,调节通气量和搅拌转速,将发酵体系中氧化还原电位维持在190±5mV,pH维持在 6.5~7.0;发酵进行到70-192h为第三阶段,调节通气量和搅拌转速,将发酵体系中氧化还原电位维持在220±5mV,pH维持在7.5,其中,通过控制搅拌转速和 通气量来调整氧化还原电位,搅拌转速范围在150~800rpm进行调整,通气量范 围在0.8~2.0vvm进行调整;
其中,上述过程中采用的菌种活化的固体培养基、种子培养的液体培养基 和发酵生产的液体培养基同实施例1;
在本实施例中,选择发酵生产过程中不控制氧化还原电位,只维持发酵体 系中溶解氧不低于10%,发酵192h为对照组,按照三阶段发酵控制氧化还原电 位同时控制溶解氧不低于10%为实验组,其余条件均相同,定时取样测定发酵 液中的生物量和吡咯喹啉醌(PQQ)产量,具体结果参见图2,通过控制ORP, PQQ产量达到2070.41mg/L(192h),比未控制的PQQ产量提高了45.77% (1420.29mg/L)。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利 用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其 他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (2)
1.一种利用氧化还原电位调控甲基营养菌生产吡咯喹啉醌的方法,其特征在于:包括菌种活化、种子培养和发酵生产;所述甲基营养菌为脱氮生丝微菌或扭托甲基杆菌;在甲基营养菌发酵生产吡咯喹啉醌的体系中引入氧化还原电位电极,通过控制体系中通气量和搅拌转速来调节发酵生产阶段的氧化还原电位在高电位氧化阶段和低电位还原阶段变化,在电位调控过程中当氧化还原电位低于设定值时,首先增加通气量再调高搅拌转速;当氧化还原电位高于设定值时,首先降低搅拌转速再减少通气量;进而保证菌体生长和吡咯喹啉醌的积累;其中,所述发酵生产中引入氧化还原电位电极后设置三阶段控制发酵过程,所述氧化还原电位维持在190~250mV范围内,其中,第一阶段为发酵开始至35~60h内,为高电位强氧化阶段;第二阶段发酵开始后的35~60h至70~100h内,为低电位强还原阶段;第三阶段为发酵开始后的70~100h至150~200h之后,为中和阶段。
2.如权利要求1所述的一种利用氧化还原电位调控甲基营养菌生产吡咯喹啉醌的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、菌种活化:采用固体培养基,其pH为6.0~7.5,含有甲醇且能提供碳源、氮源及无机盐,活化培养时将菌种在固体培养基中进行平板划线后,于恒温培养箱中25~30℃培养3~4天;
S2、种子培养:采用液体培养基,其pH为6.0~7.5,含有甲醇且能提供碳源、氮源及无机盐,培养时挑取1~2环经过菌种活化后的活化菌接种于装有液体培养基的锥形瓶中,培养温度为25~30℃,摇床转速150~220rpm,培养时间为18 ~36h,OD650为1.2~1.6;
S3、发酵生产:采用液体培养基,其pH为6.0~7.5,含有甲醇且能提供碳源、氮源及无机盐,将培养后的种子接种在发酵罐中的液体培养基中,接种量为5~10%v/v,培养温度为25~30℃,溶解氧不低于10%,发酵培养时间为150~200h;发酵过程中测定并控制通气比和搅拌转速来调节发酵罐中氧化还原电位,同时,发酵生产过程中流加25%氨水维持pH,流加甲醇维持发酵体系中甲醇浓度不低于1g/L。
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适应性驯化选育高产吡咯喹啉醌的生丝微菌突变株;柯崇榕;《生物工程学报》;20191211;第36卷(第1期);第1.1.2培养基,1.4分批发酵验证高产菌株产PQQ性能和2.5高产突变株的分批发酵,图5 * |
高产吡咯喹啉醌扭脱甲基杆菌的高通量选育;李红月等;《生物工程学报》;20180306(第05期);全文 * |
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