CN112602926B - 一种富含吡咯喹啉醌和γ-氨基丁酸的植物酵素及其制造方法 - Google Patents
一种富含吡咯喹啉醌和γ-氨基丁酸的植物酵素及其制造方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种富含吡咯喹啉醌和γ‑氨基丁酸的植物酵素及其制造方法，该方法包括将糙米、山楂、红枣、沙棘按照比例混合后，得到混合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，25～30℃发酵48～72小时，得到发酵液；将酿酒酵母、巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和纳豆芽孢杆菌分别制成菌悬液，加入至发酵液中，混匀，25～30℃继续发酵24～48小时，澄清过滤，获得风味口感优良且富含吡咯喹啉醌和γ‑氨基丁酸的植物酵素。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，尤其涉及一种富含吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone，PQQ)和γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyrate，GABA)的植物酵素及其制造方法。
背景技术
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone，PQQ)是继黄素核苷酸(FMN，FAD)和烟酰胺核苷酸(NAD，NADP)之后，在膜束缚的细菌脱氢酶中发现的第3种辅基。PQQ虽然在生物体内含量非常低，但作用重要，不仅是新发现的一种线粒体呼吸链组分，参与催化生物体内氧化还原反应，还具有非常多样的生物活性，缺乏时会引起哺乳动物诸多代谢障碍。欧洲食品监管部门(EFSA Panelon Dietetic Products,Nutrition and Allergies)经过严谨详尽评估，已充分认定PQQ的安全性，批准其作为功能性物质在食品中添加，批准号为Regulation(EC)No 258/97(Turck D,et al.Safety of pyrroloquinoline quinonedisodium salt as a novel food pursuant to Regulation(EC)No258/97[J].EFSA J,2017,15(11):UNSP 5058.)
浙江工商大学申报的发明专利“一种微生物共培养发酵生产含有吡咯喹啉醌食醋的方法(CN 201910796795.4)”，利用酿酒酵母、生丝微菌和巴氏醋杆菌构建共培养体系，生产富含PQQ的食醋，其中含有微量PQQ。吴银娣申报的发明专利“一种提高吡咯喹啉醌产量的方法”(CN 201611152572.7)，通过对浅绿黄假单胞菌产PQQ的营养因子进行分析，控制培养基中特定氨基酸含量以及维生素含量，有效提高PQQ产量。福建师范大学申报的发明专利“定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌”(CN 201610059296.3)，提供了一种定向驯化选育高产PQQ的甲基营养菌突变株的方法，通过逐步提高培养基中的甲醇浓度对甲基营养菌进行应激驯化，提高了选育正突变率以及PQQ产量增加幅度。海正药业申报的发明专利“一种生丝微菌和吡咯喹啉醌的制备方法(CN 201510262476.7)”，其PQQ产率达到1783mg/L，但该菌属于甲基营养菌，发酵时需要甲醇。目前进行PQQ发酵的微生物均不属于常用的食品发酵微生物。
γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyrate，GABA)具有极其重要的生理功能，具有健脑益智、抗癫痫、促进睡眠、美容润肤、延缓衰老、降血压等功效。每日补充微量GABA有利于缓解高血压，促进体内氨基酸代谢平衡，调节免疫功能。闽南师范大学申报的专利“一种发芽糙米富集γ-氨基丁酸的方法”(CN 202010513634.2)通过将糙米冷激处理后发芽富集GABA。吉林农业大学申报的专利“一种富含γ-氨基丁酸啤酒的酿造工艺”(CN 202010042953.X)使用发芽糙米和向麦芽汁中加入假丝酵母菌株Y6发酵，得到富含GABA啤酒。天津科技大学申报的发明专利“一种高产γ-氨基丁酸的乳杆菌及其分离培养方法和应用”(CN201911184419.6)涉及一种高产GABA的植物乳杆菌及其分离培养方法和应用。
食用植物酵素是指以植物性食品原料，添加或不添加辅料，经过微生物发酵制得的含有特定生物活性成分，可供食用的酵素产品。浙江大学申报的发明专利“一种改善哮喘的植物酵素及其制备方法”(CN 201710475099.4)以蓝莓、桑椹、柿子、冬虫夏草的天然植物原料各自不同时间与温度独立发酵，将发酵后的发酵料渣与发酵原液依照比例复配，得到二次发酵原酱酵素或复合植物酵素食品。北京中医药大学申报的发明专利“沙棘复合发酵液及其制备方法、保健饮品、植物酵素”(CN 202010183760.6)所述沙棘复合发酵液包括沙棘提取液、食物酶解液、培养液以及发酵剂，对酒精性肝损伤有明显改善效果。
纳豆是一种以纳豆芽孢杆菌为主、多种微生物参与共同发酵的健康食品，富含PQQ，但纳豆芽孢杆菌纯菌发酵时，产物中PQQ含量很低，这是因为纳豆芽孢杆菌虽然具有与PQQ合成相关的关键酶，但代谢途径并不完整，需要其它微生物如酵母、乳酸菌、醋酸菌等提供相关功能基因。乳酸菌则是制造酵素和合成GABA的重要微生物，基于此，将植物原料优化复配，通过食品级微生物如酵母、乳酸菌、醋酸菌和纳豆芽孢杆菌共发酵，可望获得富含PQQ和GABA、并且风味浓郁丰富的植物酵素。
发明内容
本发明提供了一种富含吡咯喹啉醌(PQQ)和γ-氨基丁酸(GABA)的植物酵素及其制造方法，该植物酵素的制备方法不仅简单，而且获得的产品中吡咯喹啉醌含量高达100μg/mL以上，γ-氨基丁酸含量高达1.50μg/mL以上。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种富含PQQ和GABA的植物酵素的制造方法，包括以下步骤：
(1)将糙米、山楂、红枣、沙棘按照比例混合后，得到混合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，25～30℃发酵48～72小时，得到发酵液；
(2)将酿酒酵母、巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和纳豆芽孢杆菌分别制成菌悬液，加入至步骤(1)的发酵液中，混匀，25～30℃继续发酵24～48小时，澄清过滤，获得富含PQQ和GABA的植物酵素。
本发明以糙米为发酵主料，以山楂、红枣、沙棘为配料进行调味，第一阶段以麦曲为糖化发酵剂，营造一个糖化充分且排除致病菌等杂菌从而微生态稳定的发酵环境，第二阶段加入食品级微生物如酵母、乳酸菌、醋酸菌和纳豆芽孢杆菌共发酵，制成植物酵素，在这个过程中，乳酸菌合成GABA，同时，纳豆芽孢杆菌的PQQ合成途径得到来自酵母、乳酸菌、醋酸菌的功能基因补充从而完整，能够高效合成PQQ。
进一步地，步骤(1)的发酵体系中，糙米、山楂、红枣和沙棘的混合比例为10:1:1:1；所述混合物与麦曲、水的比例为10:1:10。
进一步地，步骤(1)中，所述麦曲购自中粮孔乙己酒业有限公司，产品名称和编号为ZLKYJ-MQ-2020-1。
进一步地，步骤(2)中，酿酒酵母菌悬液、巴氏醋杆菌菌悬液、植物乳杆菌菌悬液和纳豆芽孢杆菌菌悬液的制备方法，包括：将斜面菌种接到液体培养基，酿酒酵母接种至YPD液体培养基，巴氏醋杆菌接种至AC液体培养基，植物乳杆菌接种至MRS液体培养基，纳豆芽孢杆菌接种至FB液体培养基，均在33℃～39℃振荡培养20～36h，直至菌液密度为108～109cfu/mL，得到菌悬液。
进一步地，步骤(2)中，所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 2.1543，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；所述巴氏醋杆菌为巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)CGMCC 1.4546，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC 1.511，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；所述纳豆芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ACCC19833，保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
进一步地，步骤(2)中，以体积百分数计，四种菌悬液接种至发酵液的接种量均为0.8％～1.2％。
进一步地，所述的YPD液体培养基，以1L计，包括以下组分：
该培养基的pH值调节至6.8～7.2；
进一步地，所述的AC液体培养基，以1L计，包括以下组分：
该培养基的pH值调节至6.4～7.0。
进一步地，所述的MRS培养基，以1L计，包括以下组分：
该培养基的pH值调节至6.0～6.8；
进一步地，所述的FB培养基，以1L计，包括以下组分：
该培养基的pH值调节至pH 7.2～7.4。
本发明还提供了一种如上所述的制造方法制得的富含PQQ和GABA的植物酵素。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以糙米为发酵主料，以山楂、红枣、沙棘为配料进行调味，可使获得的植物酵素的滋味和风味丰富可口，色泽美观；第一阶段以麦曲为糖化发酵剂，营造一个糖化充分且排除致病菌等杂菌从而微生态稳定的发酵环境，为后续发酵奠定基础；第二阶段加入食品级微生物如酵母、乳酸菌、醋酸菌和纳豆芽孢杆菌共发酵，制成植物酵素，在这个过程中，乳酸菌合成GABA，同时，纳豆芽孢杆菌的PQQ合成途径得到来自酵母、乳酸菌、醋酸菌的功能基因补充从而完整，能够高效合成PQQ。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
下列实施例中涉及的麦曲购自粮孔乙己酒业有限公司，产品名称和编号为ZLKYJ-MQ-2020-1；酿酒酵母的菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.1543，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；巴氏醋杆菌的菌株为巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)CGMCC 1.4546，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；植物乳杆菌的菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC 1.511，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；纳豆芽孢杆菌的菌株为纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ACCC 19833，保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
吡咯喹啉醌(PQQ)测定方法：采用高效液相色谱法，进样量10μl，温度40℃，保留时间10min，流动相为甲醇-水(含0.06M磷酸)混合液，梯度洗脱(甲醇:水＝1:9，至甲醇:水＝9:1)，流速1mL/min，在250nm处测定。以蒸馏水为对照，将PQQ标准品梯度稀释(15.625μg/ml,31.25μg/ml,62.5μg/ml,125μg/ml,250μg/ml)，以浓度为横坐标，色谱面积为纵坐标，制作标准曲线。线性关系为y＝27.139x-16.976，相关系数R2＝0.99924，说明在该范围内线性关系良好，可作为PQQ含量计算的标准曲线。
γ-氨基丁酸(GABA)测定方法：按照QB/T 4587规定的方法。
pH值含量测定：按照GB/T 10468规定的方法。
乙醇含量(g/100g)测定：按照GB/T 12143规定的方法。
多酚含量测定：按照GB/T 31740.2附录A规定的方法。
乳酸菌计数测定：按照GB 4789.35规定的方法。
酵母菌计数测定：按照GB 4789.15规定的方法。
感官品质评价方法：按照“QB/T 5323-2018植物酵素”所规定的原则，设置滋味、香气和色泽等3个感官品质子项，分别占权重50％、25％和25％，进行评价并计算综合得分。
实施例1
(1)将糙米、山楂、红枣、沙棘按照10:1:1:1的比例混合后，得到混合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，混合物与麦曲、水的比例为10:1:10，28±1℃发酵60±1小时，得到发酵液；
(2)将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.1543、巴氏醋杆菌Acetobacter pasteurianus CGMCC 1.4546、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CGMCC1.511和纳豆芽孢杆菌Bacillus subtilis natto ACCC 19833分别接种至YPD、AC、MRS和FB液体培养基中，均在36±1℃振荡培养24±1h，至菌液密度为5×108cfu/mL的菌悬液；
培养基组成为：
YPD液体培养基，以1L计，包括以下组分：蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖20g，余量为水；该培养基的pH值调节至6.8～7.2。
AC液体培养基，以1L计，包括以下组分：酵母膏10g，葡萄糖10g，碳酸钙20g，余量为水；该培养基的pH值调节至6.4～7.0。
MRS培养基，以1L计，包括以下组分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g；柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g；乙酸钠5g；磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g；硫酸锰0.2g；吐温80 1.5mL，余量为水；该培养基的pH值调节至6.0～6.8。
FB培养基，以1L计，包括以下组分：葡萄糖15g，蛋白胨15g，Na2HPO4 2g，NaH2PO42g，MgSO4 0.5g，CaCl2 0.2g，余量为水；该培养基的pH值调节至pH 7.2～7.4。
(3)将酿酒酵母菌悬液、巴氏醋杆菌菌悬液、植物乳杆菌菌悬液和纳豆芽孢杆菌菌悬液各0.8份/100份(体积比)加入至步骤(1)的发酵液中，混匀，28±1℃继续发酵24±1小时，澄清过滤，获得富含PQQ和GABA的植物酵素。
表1
PQQ、GABA等测定和感官品质评价(表1)显示，植物酵素感官品质佳，综合评分达到85分，并富含PQQ和GABA，含量分别达到116.5μg/mL和1.50μg/mL。pH值、乙醇含量、多酚含量、乳酸菌密度和酵母菌密度均符合“QB/T 5323-2018植物酵素”的规定要求(pH值≤4.5，乙醇含量≤0.5g/100g，多酚含量≥0.5、乳酸菌密度≥1×105cfu/mL，酵母菌密度≥1×105cfu/mL)。
实施例2
(1)将糙米、山楂、红枣、沙棘按照10:1:1:1的比例混合后，得到混合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，混合物与麦曲、水的比例为10:1:10，28±1℃发酵60±1小时，得到发酵液；
(2)将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.1543、巴氏醋杆菌Acetobacter pasteurianus CGMCC 1.4546、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CGMCC1.511和纳豆芽孢杆菌Bacillus subtilis natto ACCC 19833分别接种至YPD、AC、MRS和FB液体培养基中，均在36±1℃振荡培养24±1h，至菌液密度为5×108cfu/mL的菌悬液；
培养基组成为：
YPD液体培养基，以1L计，包括以下组分：蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖20g，余量为水；该培养基的pH值调节至6.8～7.2。
AC液体培养基，以1L计，包括以下组分：酵母膏10g，葡萄糖10g，碳酸钙20g，余量为水；该培养基的pH值调节至6.4～7.0。
MRS培养基，以1L计，包括以下组分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g；柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g；乙酸钠5g；磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g；硫酸锰0.2g；吐温80 1.5mL，余量为水；该培养基的pH值调节至6.0～6.8。
FB培养基，以1L计，包括以下组分：葡萄糖15g，蛋白胨15g，Na2HPO4 2g，NaH2PO42g，MgSO4 0.5g，CaCl2 0.2g，余量为水；该培养基的pH值调节至pH 7.2～7.4。
(3)将酿酒酵母菌悬液、巴氏醋杆菌菌悬液、植物乳杆菌菌悬液和纳豆芽孢杆菌菌悬液各1.2份/100份(体积比)加入至步骤(1)的发酵液中，混匀，28±1℃继续发酵24±1小时，澄清过滤，获得富含PQQ和GABA的植物酵素。
表2
PQQ、GABA等测定和感官品质评价(表2)显示，植物酵素感官品质佳，综合评分达到83分，并富含PQQ和GABA，含量分别达到108.6μg/mL和1.57μg/mL。pH值、乙醇含量、多酚含量、乳酸菌密度和酵母菌密度均符合“QB/T 5323-2018植物酵素”的规定要求。
实施例3
(1)将糙米、山楂、红枣、沙棘按照10:1:1:1的比例混合后，得到混合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，混合物与麦曲、水的比例为10:1:10，28±1℃发酵60±1小时，得到发酵液；
(2)将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.1543、巴氏醋杆菌Acetobacter pasteurianus CGMCC 1.4546、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum CGMCC1.511和纳豆芽孢杆菌Bacillus subtilis natto ACCC 19833分别接种至YPD、AC、MRS和FB液体培养基中，均在36±1℃振荡培养24±1h，至菌液密度为5×108cfu/mL的菌悬液；
培养基组成为：
YPD液体培养基，以1L计，包括以下组分：蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖20g，余量为水；该培养基的pH值调节至6.8～7.2。
AC液体培养基，以1L计，包括以下组分：酵母膏10g，葡萄糖10g，碳酸钙20g，余量为水；该培养基的pH值调节至6.4～7.0。
MRS培养基，以1L计，包括以下组分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g；柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g；乙酸钠5g；磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g；硫酸锰0.2g；吐温80 1.5mL，余量为水；该培养基的pH值调节至6.0～6.8。
FB培养基，以1L计，包括以下组分：葡萄糖15g，蛋白胨15g，Na2HPO4 2g，NaH2PO42g，MgSO4 0.5g，CaCl2 0.2g，余量为水；该培养基的pH值调节至pH 7.2～7.4。
(3)将酿酒酵母菌悬液、巴氏醋杆菌菌悬液、植物乳杆菌菌悬液和纳豆芽孢杆菌菌悬液各1.0份/100份(体积比)加入至步骤(1)的发酵液中，混匀，28±1℃继续发酵24±1小时，澄清过滤，获得富含PQQ和GABA的植物酵素。
表3
PQQ、GABA等测定和感官品质评价(表3)显示，植物酵素感官品质佳，综合评分达到88分，并富含PQQ和GABA，含量分别达到133.7μg/mL和1.84μg/mL。pH值、乙醇含量、多酚含量、乳酸菌密度和酵母菌密度均符合“QB/T 5323-2018植物酵素”的规定要求。
对比例1
(1)将糙米、山楂、红枣、沙棘按照10:1:1:1的比例混合后，得到混合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，混合物与麦曲、水的比例为10:1:10，28±1℃发酵60±1小时，得到发酵液；
(2)适当补水，28±1℃继续发酵24±1小时，澄清过滤，即获得植物酵素。
表4
PQQ、GABA等测定和感官品质评价(表4)显示，植物酵素感官品质不佳，综合评分仅55分，未检出GABA和PQQ。pH值、乙醇含量、多酚含量、乳酸菌密度和酵母菌密度等指标，仅乙醇含量和多酚含量符合“QB/T 5323-2018植物酵素”的规定要求，其它均不符合。
对比例2
(1)将糙米、山楂、红枣、沙棘按照10:1:1:1的比例混合后，得到混合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，混合物与麦曲、水的比例为10:1:10，28±1℃发酵60±1小时，得到发酵液；
(2)将纳豆芽孢杆菌Bacillus subtilis natto ACCC 19833分别接种至FB液体培养基中，均在36±1℃振荡培养24±1h，至菌液密度为5×108cfu/mL的菌悬液；
FB培养基，以1L计，包括以下组分：葡萄糖15g，蛋白胨15g，Na2HPO4 2g，NaH2PO42g，MgSO4 0.5g，CaCl2 0.2g，余量为水；该培养基的pH值调节至pH 7.2～7.4。
(3)将纳豆芽孢杆菌菌悬液1.0份/100份(体积比)加入至步骤(1)的发酵液中，混匀，28±1℃继续发酵24±1小时，澄清过滤，获得植物酵素。
表5
PQQ、GABA等测定和感官品质评价(表5)显示，植物酵素感官品质不佳，综合评分仅53分，未检出GABA，PQQ含量为72.7μg/mL。pH值、乙醇含量、多酚含量、乳酸菌密度和酵母菌密度等指标，仅乙醇含量和多酚含量符合“QB/T 5323-2018植物酵素”的规定要求，其它均不符合。
对比例3
(1)将糙米、山楂、红枣、沙棘按照10:1:1:1的比例混合后，得到混合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，混合物与麦曲、水的比例为10:1:10，28±1℃发酵60±1小时，得到发酵液；
(2)将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.1543、巴氏醋杆菌Acetobacter pasteurianus CGMCC 1.4546和纳豆芽孢杆菌Bacillus subtilis nattoACCC 19833分别接种至YPD、AC和FB液体培养基中，均在36±1℃振荡培养24±1h，至菌液密度为5×108cfu/mL的菌悬液；
培养基组成为：
YPD液体培养基，以1L计，包括以下组分：蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖20g，余量为水；该培养基的pH值调节至6.8～7.2。
AC液体培养基，以1L计，包括以下组分：酵母膏10g，葡萄糖10g，碳酸钙20g，余量为水；该培养基的pH值调节至6.4～7.0。
FB培养基，以1L计，包括以下组分：葡萄糖15g，蛋白胨15g，Na2HPO4 2g，NaH2PO42g，MgSO4 0.5g，CaCl2 0.2g，余量为水；该培养基的pH值调节至pH 7.2～7.4。
(3)将酿酒酵母菌悬液、巴氏醋杆菌菌悬液、植物乳杆菌菌悬液和纳豆芽孢杆菌菌悬液各1.0份/100份(体积比)加入至步骤(1)的发酵液中，混匀，28±1℃继续发酵24±1小时，澄清过滤，获得植物酵素。
表6
PQQ、GABA等测定和感官品质评价(表6)显示，植物酵素感官品质尚可，综合评分71分，含PQQ和GABA，但含量较低，分别74.6μg/mL和0.77μg/mL。pH值、乙醇含量、多酚含量、乳酸菌密度和酵母菌密度等指标符合“QB/T 5323-2018植物酵素”的规定要求，但乳酸菌密度较低。
对比例4
(1)将糙米、山楂、红枣、沙棘按照10:1:1:1的比例混合后，得到混合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，混合物与麦曲、水的比例为10:1:10，28±1℃发酵60±1小时，得到发酵液；
(2)将酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.1543、巴氏醋杆菌Acetobacter pasteurianus CGMCC 1.4546和植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 1.511分别接种至YPD、AC和MRS液体培养基中，均在36±1℃振荡培养24±1h，至菌液密度为5×108cfu/mL的菌悬液；
培养基组成为：
YPD液体培养基，以1L计，包括以下组分：蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖20g，余量为水；该培养基的pH值调节至6.8～7.2。
AC液体培养基，以1L计，包括以下组分：酵母膏10g，葡萄糖10g，碳酸钙20g，余量为水；该培养基的pH值调节至6.4～7.0。
MRS培养基，以1L计，包括以下组分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g；柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g；乙酸钠5g；磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g；硫酸锰0.2g；吐温80 1.5mL，余量为水；该培养基的pH值调节至6.0～6.8。
(3)将酿酒酵母菌悬液、巴氏醋杆菌菌悬液、植物乳杆菌菌悬液和纳豆芽孢杆菌菌悬液各1.0份/100份(体积比)加入至步骤(1)的发酵液中，混匀，28±1℃继续发酵24±1小时，澄清过滤，获得植物酵素。
表7
PQQ、GABA等测定和感官品质评价(表7)显示，植物酵素感官品质佳，综合评分82分，GABA含量1.34μg/mL，但不含PQQ。pH值、乙醇含量、多酚含量、乳酸菌密度和酵母菌密度等指标符合“QB/T 5323-2018植物酵素”要求，但乳酸菌密度较低。
总结以上案例：
(1)在添加麦曲自然发酵的基础上，进一步添加酿酒酵母、巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和纳豆芽孢杆菌强化发酵，所制得植物酵素品质佳(实施例1、实施例2、实施例3)。
(2)仅用麦曲自然发酵，所制得植物酵素品质不佳，PQQ和GABA均未检出(对比例1)；在添加麦曲自然发酵的基础上，进一步添加纳豆芽孢杆菌强化发酵，而不添加酿酒酵母、巴氏醋杆菌和植物乳杆菌，所制得植物酵素品质不佳，GABA未检出，但PQQ仍然有一定含量(对比例2)，说明纳豆芽孢杆菌对于PQQ合成起着关键作用。
(3)在添加麦曲自然发酵的基础上，进一步添加酿酒酵母、巴氏醋杆菌和纳豆芽孢杆菌强化发酵，未添加植物乳杆菌，所制得植物酵素品质不高(对比例3)，且PQQ和GABA含量均较低，说明植物乳杆菌不仅对于植物酵素品质影响较大，而且对PQQ和GABA的合成也发挥重要作用。
(4)在添加麦曲自然发酵的基础上，进一步添加酿酒酵母、巴氏醋杆菌和植物乳杆菌强化发酵，未添加纳豆芽孢杆菌，所制得植物酵素品质佳(对比例4)，且GABA含量较高，但PQQ未检出，说明纳豆芽孢杆菌发酵是合成PQQ的关键，其PQQ合成途径只有得到其它微生物的功能基因予以补充后，方才高效和完整。
Claims (5)
1.一种富含吡咯喹啉醌和γ-氨基丁酸的植物酵素的制造方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将糙米、山楂、红枣、沙棘按照比例混合后，得到混合物；混合物粉碎后，加入麦曲，冲水混合，25~30 ℃发酵48~72小时，得到发酵液；
（2）将酿酒酵母、巴氏醋杆菌、植物乳杆菌和纳豆芽孢杆菌分别制成菌悬液，加入至步骤（1）的发酵液中，混匀，25~30 ℃继续发酵24~48小时，澄清过滤，获得富含吡咯喹啉醌和γ-氨基丁酸的植物酵素；
步骤（2）中，酿酒酵母菌悬液、巴氏醋杆菌菌悬液、植物乳杆菌菌悬液和纳豆芽孢杆菌菌悬液的制备方法，包括：将斜面菌种接到液体培养基，酿酒酵母接种至YPD液体培养基，巴氏醋杆菌接种至AC液体培养基，植物乳杆菌接种至MRS液体培养基，纳豆芽孢杆菌接种至FB液体培养基，均在33℃~39 ℃振荡培养20~36 h，直至菌液密度为108~109 cfu/mL，得到菌悬液；以体积百分数计，四种菌悬液接种至发酵液的接种量均为0.8%~1.2%；
所述酿酒酵母为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）CGMCC 2.1543，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；所述巴氏醋杆菌为巴氏醋杆菌（Acetobacterpasteurianus）CGMCC1.4546，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC 1.511，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；所述纳豆芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilisnatto）ACCC 19833，保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
2.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，步骤（1）的发酵体系中，糙米、山楂、红枣和沙棘的混合比例为10 : 1 : 1 : 1；所述混合物与麦曲、水的比例为10 : 1 : 10。
3.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述的YPD液体培养基，以1 L计，包括以下组分：
蛋白胨 20 g；
酵母膏 10 g；
葡萄糖 20 g；
水 余量；
该培养基的pH值调节至6.8~7.2；
所述的AC液体培养基，以1 L计，包括以下组分：
酵母膏 10 g；
葡萄糖 10 g；
碳酸钙 20 g；
水 余量；
该培养基的pH值调节至6.4~7.0。
4.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于，所述的MRS液体培养基，以1 L计，包括以下组分：
蛋白胨 10 g；
牛肉膏 10 g；
酵母膏 5 g；
柠檬酸氢二铵 2 g；
葡萄糖 20 g；
乙酸钠 5 g；
磷酸氢二钾 2 g；
硫酸镁 0.5 g；
硫酸锰 0.2 g；
吐温80 1.5 mL；
水 余量；
该培养基的pH值调节至6.0~6.8；
所述的FB液体 培养基，以1 L计，包括以下组分：
葡萄糖 15 g
蛋白胨 15 g
Na2HPO4 2 g
NaH2PO4 2 g
MgSO4 0.5 g
CaCl2 0.2 g
水 余量；
该培养基的pH值调节至pH 7.2～7.4。
5.一种如权利要求1~4任一项所述的制造方法制得的富含吡咯喹啉醌和γ-氨基丁酸的植物酵素。
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