CN113981021A - 一种通过嗜氨副球菌发酵合成pqq的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，专利菌株保藏号为：CCTCC NO:M 2021560涉及微生物学和生物工程技术领域。该通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，包括以下步骤：S1.活化菌株将保藏的嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus LHS410)接种在活化培养基里，在适合菌株生长的条件下进行活化培养，成为活化菌液；S2.种子液培养将步骤S1中得到的活化菌液接种于种子培养基，在适合菌株生长的条件下培养，成为种子液。通过利用副球菌等甲基营养型菌株进行吡咯喹啉醌的生产制备，操作简单，易于重复，实现副球菌等甲基营养菌在工业化水平上生产PQQ，生产速度更快，产量更高，从而更高效的生产吡咯喹啉醌。

Description

一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法

技术领域

本发明涉及微生物学和生物工程技术领域，具体为一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法。

背景技术

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)，化学式为4， 5-二羰基-1-吡咯-2，3-f-喹啉-2，7，9-三羧酸，是继烟酰胺和核黄素之后第三类辅酶，可以从底物接受2个电子和2个质子，发挥辅酶的作用，2003年，PQQ被认定为水溶性B族维生素，PQQ具有独特的理化性质和生理作用，比如：

1、PQQ具有神经保护的作用，可以作为一种新型治疗抗神经退行性疾病的药物，对于肝损伤也同样有预防及治疗的作用；

2、PQQ还具有调节血糖水平、降低血脂指数等功效；

3、PQQ还具有抗氧化功能，消除人体自由基，免除因自由基过多引发的胃肠疾病、心脑血管疾病、癌症等作用；

4、PQQ亦可大幅增加Cu/Zn-SOD酶的超氧化物阴离子清除能力。

PQQ很容易被下部肠道吸收，在口服给药中没有毒性和遗传毒性，因此口服补充PQQ可以改善健康状况。

在生物界中仅有部分革兰氏阴性细菌能合成PQQ，其中以甲基营养菌的合成能力最强，如副球菌属(Paracoccus)、生丝微菌属 (Hyphomicrobium)、甲基菌属(Methylobacillus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilus)和甲基杆菌属 (Methylobacterium)等，PQQ随菌体生长在细胞质中合成，然后转运至细胞间质与甲醇脱氢酶结合氧化甲醇为细胞生长提供碳骨架，然而，PQQ与甲醇脱氢酶是通过Ca²⁺或Mg^{2 +}介导的配位键相连，结合力较弱，转运过程中容易游离至胞外，导致大量的PQQ排泄到培养基中。

目前，PQQ的生物合成途径已经解析清楚，不同于辅酶Q10等其他常见的从头合成辅因子，PQQ是一种仅需通过几步步酶促反应催化合成的翻译后蛋白修饰产物，PQQ生物合成起始于前体多肽PqqA绝对保守基序中谷氨酸与酪氨酸残基之间的C-C交联反应，该催化反应中，PqqA和伴侣蛋白PqqD以及S-腺苷甲硫氨酸自由基酶PqqE结合形成复合物进行催化，在Glu和Tyr残基C₉和C_9α形成碳碳键，催化后形成交联的PqqA多肽，被PqqF/PqqG等蛋白内切酶以及其它蛋白酶共同作用，水解生成交联的GluTyr，并进一步由PqqB编码的羟化酶催化氧气分子插入，生成AHQQ[3α-(2-氨基-2-碳氧基乙基)-4， 5-二氧代-4，6，7，9-六氢青蒿素-7，9-二甲酸]，最后一步反应， AHQQ由PqqC编码的氧化酶催化完成结构环化和八电子氧化生成PQQ，反应需要3摩尔的O₂和1摩尔的H₂O₂作为电子受体，由此可见，氧是PQQ生产的重要参数，因此，可以通过控制氧气供给，提高PQQ的产量。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，解决了传统合成方法合成量较低，合成难度较高，并且PQQ与甲醇脱氢酶是通过Ca²⁺或Mg²⁺介导的配位键相连，结合力较弱，转运过程中容易游离至胞外，导致大量的PQQ排泄到培养基中的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，包括以下步骤：

S1.活化菌株

将保藏的嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus LHS410)接种在活化培养基里，在适合菌株生长的条件下进行活化培养，成为活化菌液；

S2.种子液培养

将步骤S1中得到的活化菌液接种于种子培养基，在适合菌株生长的条件下培养，成为种子液；

S3.罐上发酵

将步骤S2中得到的种子液转接入含有发酵培养基的发酵罐中扩大培养，发酵培养基中碳源为甲醇，氮源为硫酸铵，发酵过程中采用三阶段供氧策略；

S4.收获发酵液

将步骤S3中的发酵液进行收获，收获的发酵液中就含有PQQ。

优选的，所述步骤S1中的培养温度为25～35℃，培养时间为1～2 天，其中活化培养基的组分及配比如下：

活化培养基(以1L计)

胰蛋白胨 5-10g

酵母提取物 3-5g

NaCl 5-10g

pH自然，湿热灭菌。

优选的，所述步骤S2中的具体操作为：将1-2mL种子液接种于 100mL种子培养基中，在相同条件下继续扩大培养，直至得到菌体密度(OD₆₀₀)为1.0～1.5的种子液，其中种子培养基的组分及配比如下：

种子培养基(以1L计)

pH 6.5-7.0，湿热灭菌后加入无菌甲醇5-15g。

优选的，所述步骤S3中接种的种子液与发酵培养基的体积比为1:100～1:5，培养温度为25～35℃，培养时间为6～8天，发酵培养基的组分及配比如下：

发酵培养基(以1L计)

pH 6.5-7.0，湿热灭菌后加入无菌甲醇20-40g。

优选的，所述种子培养基和发酵培养基中的微量元素液组成含有硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜、氯化钴、硼酸、钼酸铵、碘化钾中的一种或多种。

优选的，所述种子培养基和发酵培养基中的维生素辅液组成含有核黄素、吡哆素、硫胺素、泛酸钙、烟酸、对氨基苯甲酸、生物素、叶酸、肌醇中的一种或多种。

优选的，所述步骤S3中的三阶段供氧策略具体为：

(1)前期，种子液接种后，转速控制在200rpm，发酵罐通气量控制在0.1～5vvm之间，不联动转速控制溶解氧水平，通过控制发酵罐通气量，将溶解氧水平维持在饱和溶解氧水平的30％以上；

(2)中期，当发酵罐通气量达到5vvm，溶氧水平难以维持在 30％以上时，联动转速控制溶解氧水平，将溶解氧水平维持在饱和溶解氧水平的50-60％，转速范围为200～800rpm，通气量为5～10vvm；

(3)后期，当菌体生物量(OD₆₀₀)达到5时，将溶解氧水平维持在饱和溶解氧水平的30-40％。

优选的，所述步骤S3中利用磷酸或氨水维持pH值在5.5～7.0，并且在发酵过程中间歇性补加甲醇，每升发酵液补加5～15g甲醇。

优选的，所述吡咯喹啉醌由权利要求1～8中任意一项的所述方法生产获得。

优选的，所述方法说明了甲基营养型菌株在生产制备吡咯喹啉醌中的应用。

(三)有益效果

本发明提供了一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法。具备以下有益效果：

1、本发明提供的通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，该方法利用副球菌等甲基营养型菌株进行吡咯喹啉醌的生产制备，操作简单，易于重复，实现副球菌等甲基营养菌在工业化水平上生产PQQ，生产速度更快，产量更高，从而更高效的生产吡咯喹啉醌。

2、本发明提供的通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，随着菌体的生长，发酵罐内部的溶氧值会下降，通过主动提高发酵罐内部的通气量，保证溶氧值大于30％，当发酵罐通气量达到5vvm时，将pH 设定在6.5，开启搅拌与溶氧联动，保证溶氧值处于50-60％，转速范围为200～800rpm，通气量为5～10vvm，每隔4小时取样，测菌体的生物量OD600，当菌体OD600达到5时，将pH设定在6.0，每升发酵液流加10g甲醇，设定溶氧值处于30-40％，继续培养，直至6～8 天结束，在这种发酵条件下，PQQ的最终产量将超过1g/L，大大增加PQQ的生产效率。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下列实施例中药品购置于阿拉丁或国药集团；发酵罐型号为 Winpact FS-05-220；未注明具体条件的实验仪器和方法，通常按照常规条件进行,嗜氨副球菌(Paracoccusaminophilus LHS410)，保藏编号为，CCTCC NO: M 2021560，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏时间为：2021 年5月19日。

实施例：

本发明实施例提供一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，包括以下步骤：

S1.活化菌株

取保藏的嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus LHS410)甘油管或冻干管(复溶后)100μL，接种在5mL的活化培养基里，在 28℃、200rpm条件下进行活化培养，培养时间为1～2天，成为活化菌液，其中活化培养基的组分及配比如下：

活化培养基(以1L计)

胰蛋白胨 5-10g

酵母提取物 3-5g

NaCl 5-10g

pH自然，湿热灭菌；

S2.种子液培养

取步骤S1中得到的活化菌液2mL，接种于含有100mL种子培养基的500mL的三角瓶中，在28℃、200rpm下培养，每隔1小时测量菌体密度(OD₆₀₀)，直至OD₆₀₀达到1.5，即为完成种子液的制备，其中种子培养基的组分及配比如下：

种子培养基(以1L计)

pH 6.5-7.5，湿热灭菌后加入无菌甲醇10g；

S3.在3L发酵罐上发酵

取200mL步骤S2中得到的种子液，转接入含有发酵培养基的发酵罐中扩大培养，10L发酵罐中装有1.8L发酵培养基，接种比例为1：10，接种后发酵罐通气量为1vvm，搅拌转速设定在200rpm， pH值设定在7.0，培养温度为28℃，培养时间为6～8天，发酵培养基中碳源为甲醇，氮源为硫酸铵，发酵过程中采用三阶段供氧策略，其中发酵培养基的组分及配比如下：

发酵培养基(以1L计)

pH 6.5-7.0，湿热灭菌后加入无菌甲醇25g；

随着菌体的生长，溶氧值会下降，此时需要手动提高发酵罐通气量，保证溶氧值大于30％，当发酵罐通气量达到5vvm时，将pH设定在6.5，开启搅拌与溶氧联动，保证溶氧值处于50-60％，转速范围为200～800rpm，通气量为5～10vvm，每隔4小时取样，测菌体的生物量OD₆₀₀，当菌体OD₆₀₀达到5时，将pH设定在6.0，每升发酵液流加10g甲醇，设定溶氧值处于30-40％，继续培养，直至6～8天结束，在这种发酵条件下，甲基营养型菌株在3L发酵罐上培养6～8天，最终PQQ产量超过1g/L。

S4.收获发酵液

将步骤S3中的发酵液进行收获，收获的发酵液中就含有PQQ。

种子培养基和发酵培养基中微量元素液的配方为：FeSO₄·7H₂O 5g、CoCl·6H₂O2g、ZnSO₄·7H₂O 1.4g、MnSO₄·H₂O 1.6g、CuSO₄·5H₂O 200mg、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 40mg、KI20mg、H₃BO₃ 60mg、2M HCl 5mL，加纯净水定容至1L，4℃保存。

种子培养基和发酵培养基中维生素辅液的配方为：核黄素0.2g、吡哆素0.4g、硫胺素0.4g、泛酸钙0.4g、烟酸0.4g、对氨基苯甲酸0.2g、生物素0.02g、叶酸0.02g、肌醇2g，加纯净水定容至1L，4℃保存。

步骤S3中的三阶段供氧策略具体为：

(1)前期，种子液接种后，转速控制在200rpm，发酵罐通气量控制在0.1～5vvm之间，不联动转速控制溶解氧水平，通过控制发酵罐通气量，将溶解氧水平维持在饱和溶解氧水平的30％以上；

(2)中期，当发酵罐通气量达到5vvm，溶氧水平难以维持在 30％以上时，联动转速控制溶解氧水平，将溶解氧水平维持在饱和溶解氧水平的50-60％，转速范围为200～800rpm，通气量为5～10vvm；

(3)后期，当菌体生物量(OD₆₀₀)达到5时，将溶解氧水平维持在饱和溶解氧水平的30-40％。

步骤S3中利用磷酸或氨水维持pH值在5.5～7.0，并且在发酵过程中间歇性补加甲醇，每升发酵液补加5～15g甲醇。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.活化菌株

将保藏的嗜氨副球菌(Paracoccus aminophilus LHS410)接种在活化培养基里，在适合菌株生长的条件下进行活化培养，成为活化菌液；

S2.种子液培养

将步骤S1中得到的活化菌液接种于种子培养基，在适合菌株生长的条件下培养，成为种子液；

S3.罐上发酵

将步骤S2中得到的种子液转接入含有发酵培养基的发酵罐中扩大培养，发酵培养基中碳源为甲醇，氮源为硫酸铵，发酵过程中采用三阶段供氧策略；

S4.收获发酵液

将步骤S3中的发酵液进行收获，收获的发酵液中就含有PQQ。

2.根据权利要求1所述的一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，其特征在于：所述步骤S1中的培养温度为25～35℃，培养时间为1～2天，其中活化培养基的组分及配比如下：

活化培养基(以1L计)

胰蛋白胨 5-10g

酵母提取物 3-5g

NaCl 5-10g

pH自然，湿热灭菌。

3.根据权利要求1所述的一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，其特征在于：所述步骤S2中的具体操作为：将1-2mL种子液接种于100mL种子培养基中，在相同条件下继续扩大培养，直至得到菌体密度(OD₆₀₀)为1.0～1.5的种子液，其中种子培养基的组分及配比如下：

种子培养基(以1L计)

pH 6.5-7.0，湿热灭菌后加入无菌甲醇5-15g。

4.根据权利要求1所述的一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，其特征在于：所述步骤S3中接种的种子液与发酵培养基的体积比为1:100～1:5，培养温度为25～35℃，培养时间为6～8天，发酵培养基的组分及配比如下：

发酵培养基(以1L计)

pH 6.5-7.0，湿热灭菌后加入无菌甲醇20-40g。

5.根据权利要求3或4所述的一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，其特征在于：所述种子培养基和发酵培养基中的微量元素液组成含有硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜、氯化钴、硼酸、钼酸铵、碘化钾中的一种或多种。

6.根据权利要求3或4所述的一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，其特征在于：所述种子培养基和发酵培养基中的维生素辅液组成含有核黄素、吡哆素、硫胺素、泛酸钙、烟酸、对氨基苯甲酸、生物素、叶酸、肌醇中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，其特征在于：所述步骤S3中的三阶段供氧策略具体为：

(1)前期，种子液接种后，转速控制在200rpm，发酵罐通气量控制在0.1～5vvm之间，不联动转速控制溶解氧水平，通过控制发酵罐通气量，将溶解氧水平维持在饱和溶解氧水平的30％以上；

(2)中期，当发酵罐通气量达到5vvm，溶氧水平难以维持在30％以上时，联动转速控制溶解氧水平，将溶解氧水平维持在饱和溶解氧水平的50-60％，转速范围为200～800rpm，通气量为5～10vvm；

(3)后期，当菌体生物量(OD₆₀₀)达到5时，将溶解氧水平维持在饱和溶解氧水平的30-40％。

8.根据权利要求1所述的一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，其特征在于：所述步骤S3中利用磷酸或氨水维持pH值在5.5～7.0，并且在发酵过程中间歇性补加甲醇，每升发酵液补加5～15g甲醇。

9.根据权利要求1所述的一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，其特征在于：所述吡咯喹啉醌由权利要求1～8中任意一项的所述方法生产获得。

10.根据权利要求1所述的一种通过嗜氨副球菌发酵合成PQQ的方法，其特征在于：所述方法说明了甲基营养型菌株在生产制备吡咯喹啉醌中的应用。