JP6517158B2 - バクテリオクロロフィルａの生成方法 - Google Patents

バクテリオクロロフィルａの生成方法 Download PDF

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Description

本発明は概して、微生物からバクテリオクロロフィルを生成する方法に関し、特に、紅色細菌からバクテリオクロロフィルａを生成する、改良された発酵法に関する。
光線力学的療法（ＰＤＴ）は、腫瘍の非外科的治療として用いられている。ＰＤＴは、毒性のない医薬品と無害な光増感性照射とを組み合わせたものであり、単独ではいずれも無害な２つの因子が、分子酸素の存在下において、細胞を死滅させたり不活性化することのできる活性酸素種（ＲＯＳ）をｉｎ ｓｉｔｕで生成するものである。ＰＤＴは二成分の治療法であり、一般に用いられている化学療法または放射線療法と比較して、より特異的であり、より高い選択性を得る見込みはあるが、破壊性も低くはないかもしれない。
ポルフィリンは、医療機関において第１世代光増感剤として使用されてきた。光線力学的療法剤として世界で初めて認可されたポルフィマーナトリウム（フォトフリン（登録商標）、Ａｘｃａｎ Ｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．）は、ヘマトポルフィリンＩＸを酸処理することによって得られ、食道および気管支内の非小細胞肺がんの治療用としてＦＤＡ（米国連邦食品医薬品局）の認可を得ている。このポルフィマーナトリウムは、モノマー、ダイマー、およびより高次のオリゴマーの複雑かつ分離不可能な混合物である。
長波長の吸収域を有し、十分に安定した構造を有し、かつ腫瘍細胞における滞留と皮膚またはその他の正常な組織における滞留とにより明確な差を示す、混じりけのない純粋な化合物、いわゆる「第２世代」増感剤の合成に、多大な努力が払われてきた。治療学および診断学におけるポルフィリン医薬品の性能を最適化するために、いくつかのポルフィリン誘導体、例えば、４つのピロール環と錯体を形成する中心金属原子（Ｍｇ以外）が存在する、かつ／またはピロール環の周辺置換基が修飾されている、かつ／または大員環が二水素化されてクロロフィル誘導体（クロリン）となっているか、大員環が四水素化されてバクテリオクロロフィル誘導体（バクテリオクロリン）となっているものなどが提案されている。
クロロフィル（Ｃｈｌ）誘導体およびバクテリオクロロフィル（Ｂｃｈｌ）誘導体は、好ましいスペクトル領域（６５０〜８５０ｎｍ）において強い吸収を示し、かつ治療後すぐに除去できることから、腫瘍に対するＰＤＴのための優れた増感剤であると見なされており、ポルフィリンと比較して優れた特性を有している。バクテリオクロロフィルは、近赤外波長帯を、すなわちクロロフィル誘導体に比べて大幅に長い波長の吸収域を強く示すため、クロロフィルと比較して潜在的に有利である。
バクテリオクロロフィルは、様々な光合成細菌に存在する光合成色素である。バクテリオクロロフィルは、植物、藻類、および藍色細菌中の基本的色素であるクロロフィルと関連している。バクテリオクロロフィル（Ｂｃｈｌ）を含む細菌は、光合成を行うが、酸素を生成しない。これらの細菌は、植物や藍色細菌によって吸収されない光の波長を使用する。細菌は、群ごとに種類の異なるバクテリオクロロフィルを生成する。
Figure 0006517158
化学的に言えば、バクテリオクロロフィルａ、ｂ、およびｇはバクテリオクロリンであり、これらのバクテリオクロロフィルの分子は、還元された２つのピロール環（ＢおよびＤ）を含むバクテリオクロリン大員環を有している。バクテリオクロロフィルａ（本明細書においてＢｃｈｌａ）は、下記式で表される化合物である。
Figure 0006517158
バクテリオクロロフィルｃ、ｄ、およびｅはクロリンであり、これらの分子の有するクロリン大員環に含まれる還元されたピロール環は、ただ１つ（Ｄのみ）である。
紅色光合成細菌
紅色光合成細菌は、化学的環境および物理的環境に依存して、光、有機化合物、または無機化合物から細胞エネルギーを得ることができる。この卓越した能力は通常、別のエネルギーシステムによる不必要な生合成を防ぐために、一度に利用される代謝方式が１つに限られていることを意味する。したがって、光合成代謝およびそれによる色素生合成は、一連の条件が重なった場合にのみ起こる。
バクテリオクロロフィルを生成する紅色細菌の能力に関して、この細菌には２つの主群があると考えられる。第１の群は、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ （Ｒｂａ．） ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｄｅｓ， Ｒｂａ． Ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、およびＲｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍを含む。これらは、光を受けて光合成を行い、嫌気的にバクテリオクロロフィルを生成する。これらは、暗闇においてもかなりの量の色素を合成できるが、合成が行われるのは低通気条件下に限られる。このことは、これらの色素の合成に関与する酵素をコード化する遺伝子が酸素および光によって制御されることを示している。第２の群は、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ， ｓｐ．およびＲｕｂｒｉｖｉｖａｘ （Ｒｖｉ．） ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓを含み、この群は暗闇で色素を合成することができ、嫌気条件下および好気条件下のいずれにおいても光合成を行うことができる。
以前はＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして知られていた通性好気性細菌Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍにおけるＢｃｈｌａの生合成が、１９９８年にＰｏｒｒａらによって説明された（Ｐｏｒｒａ， ＲＪ， Ｍ． Ｕｒｚｉｎｇｅｒ， Ｊ． Ｗｉｎｋｌｅｒ， Ｃ． Ｂｕｂｅｎｚｅｒ， ａｎｄ Ｈ． Ｓｃｈｅｅｒ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５７， １８５−１９１）。
Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍから得られるＢｃｈｌａは、例えば米国特許第６，１４７，１９５号明細書、欧州特許出願公開第８６３９０３号明細書、米国特許第６，３３３，３１９号明細書、米国特許第６，５６９，８４６号明細書、国際公開２００４／０４５４９２号明細書、および米国特許第８，２０７，１５４号明細書に開示されているように、腫瘍およびその他の病態に対するＰＤＴおよび血管標的のＰＤＴ（ＶＴＰ）に使用される改良Ｂｃｈｌａ誘導体を生成するためのさらなる誘導および改良の基礎としての役割を果たしてきた。
ＰＤＴやその研究におけるＢｃｈｌａ誘導体の使用は増加している。そのため、発酵によってＢｃｈｌａをより多量に生成する必要性が高まっている。
本発明は、光増感性紅色細菌Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍからバクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌａ）を生成する発酵法であって、バイオリアクター内で細菌を増殖させる工程および生成されたＢｃｈｌａを採取した細菌から抽出する工程を含む発酵法を提供する。
本発明は特に、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍからバクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌａ）を生成するフェドバッチ発酵法であって、
（ｉ）発酵槽容器内のＲｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍを、窒素源としての無機窒素化合物、炭素源、リン源、鉄源、マグネシウム源、酵母エキス、およびＮａＣｌを含む増殖培地で培養する工程；
（ｉｉ）発酵槽容器に連結されている外部容器からコハク酸塩炭素源、無機化合物窒素源、およびリン源を培地に供給しながら、かつ酸素濃度を１０％以下に維持しながら、培養物をフェドバッチ発酵させる工程；
（ｉ）培地から細胞を分離する工程；ならびに
（ｉｉ）工程（ｉｉｉ）で得た細胞からＢｃｈｌａを分離、回収する工程
を含む発酵法に関する。
文献に記載された方法では、例えばペプトン、ポリペプトン、またはカゼインの酸加水分解物であるアミノ酸や小ペプチドの混合物（カザミノ酸として知られる）などの有機窒素源を含む培地で増殖した細菌からＢｃｈｌａを得ている。（Ｓｈｉｏｉ， Ｙｕｚｏ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｉｓｉｏｌ． ２７（３）： ５６７−５７２， １９８６； Ｐｏｒｒａら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５７， １８５−１９１， １９９８）。
本発明により、紅色細菌Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍを増殖させる発酵プロセスにおいて特定の改良を施すことにより、Ｂｃｈｌａの体積収率が１２倍に増加し、生産コストが実質的に削減されることが見出された。
したがって、本発明は、主要な一態様において、既知の発酵プロセスを用いて生成される量を著しく超過する量のＢｃｈｌａを、培養したＲｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍから生成する発酵法を提供する。
本明細書において、「発酵槽」、「発酵槽容器」、および「バイオリアクター」は、本発明によってＲｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの増殖および発酵が行われる容器を示すために同じ意味で用いられる。
本明細書において、「増殖培地」および「発酵培地」は、発酵槽内で前記の細菌Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍを増殖させるための培地を示すために同じ意味で用いられる。
本発明の方法は、細菌増殖培地および発酵プロセスをいずれも改良することに関する。
本発明の増殖培地に関する改良とは、高価な動物由来の窒素源であるペプトンを無機窒素源に置き換えることである。
本発明の発酵法における改良は、窒素源、炭素源、およびリン源の供給溶液の入った外部容器から新たな該栄養素をバイオリアクターへと継続的に供給することを含み、この継続的供給は、発酵培地中の該必須栄養素それぞれの濃度をオンラインで監視し、必要に応じて供給しながら行われる。「フェドバッチ発酵」として知られている本技術によれば、発酵プロセスの間、これらの栄養素は、バイオリアクター内で増殖している細菌に対し、該細菌による消費速度に応じた量および投入速度で、継続的に供給される。
細菌増殖培地において、無機窒素源が使用されることがあるが、本発明者らは意外なことに、唯一の窒素源として塩化アンモニウムを使用し、かつ本発明のフェドバッチ発酵法を使用することで、１リットル当たり３５０％の細胞乾燥重量の増加および３３５％の細胞内Ｂｃｈｌａ濃度の増加がもたらされること、すなわち既知の商業的プロセスに比べて約１２倍である、１リットル当たり６００ｍｇのＢｃｈｌａがもたらされることを見出した。さらに、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍを増殖させるために一般に使用される培地のコストが約１５％削減された。
したがって、本発明は、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍからバクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌａ）を生成するフェドバッチ発酵法であって、
（ｉ）発酵槽容器内のＲｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍを、窒素源としての無機窒素化合物、炭素源、リン源、鉄源、マグネシウム源、酵母エキス、およびＮａＣｌを含む増殖培地で培養する工程；
（ｉｉ）発酵槽容器に連結されている外部容器からコハク酸塩炭素源、無機化合物窒素源、およびリン源を培地に供給しながら、かつ酸素濃度を１０％以下に維持しながら、培養物をフェドバッチ発酵させる工程；
（ｉｉｉ）培地から細胞を分離する工程；ならびに
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得た細胞からＢｃｈｌａを分離、回収する工程
を含む発酵法に関する。
増殖培地中の無機窒素化合物は、細菌増殖培地で使用される無機窒素化合物のいずれであってもよく、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウムなど、またはこれらの任意の組合せを使用できるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、無機窒素化合物は、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）であることが好ましい。この窒素源も、フェドバッチ発酵中に必要に応じて発酵培地に補充することによって増殖中の細菌に供給される。
増殖培地中の炭素源は、例えば、単糖類もしくは二糖類、スクロース、リンゴ酸、コハク酸、およびコハク酸ナトリウムなどのジカルボン酸、グリセロール、クエン酸、またはこれらの任意の組合せであってよい。また、コハク酸およびコハク酸ナトリウムを含む炭素源は、フェドバッチ発酵中に必要に応じて発酵培地に補充することによって増殖中の細菌に供給される。
増殖培地中のリン源は、ピロリン酸塩ならびにリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸アンモニウムなどのリン酸水素およびリン酸二水素の水溶性塩を１以上含んでもよい。いくつかの実施形態において、リン源は、リン酸塩であるＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２ＯとＫＨ２ＰＯ４との混合物を含む。また、これら２つのリン酸塩を含むリン源は、フェドバッチ発酵中に必要に応じて発酵培地に補充することによって増殖中の細菌に供給される。
発酵培地中の鉄源は、1以上の水溶性第一鉄塩または水溶性第二鉄塩、例えばクエン酸第二鉄アンモニウム、塩化第一鉄、酢酸第一鉄、および硫酸第一鉄などであってよい。いくつかの実施形態において、鉄源は、クエン酸第二鉄アンモニウムである。
発酵培地中のマグネシウム源は、塩化マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、コハク酸マグネシウムなどの、１以上の水溶性マグネシウム塩であってよい。いくつかの実施形態において、マグネシウム源は、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）である。
Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの発酵培地は、本発明によれば、３０〜４５ｇ／Ｌの炭素源、０．４〜０．７ｇ／Ｌのリン源、１．５〜３．０ｇ／Ｌの窒素源、１．５〜２．５ｇ／Ｌの酵母エキス、０．５〜１．０ｇ／Ｌの鉄源、０．１５〜０．３ｇ／Ｌのマグネシウム源、１０〜３０ｇ／ＬのＮａＣｌ、および微量元素を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、発酵培地は、クエン酸、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、クエン酸鉄アンモニウム、コハク酸、コハク酸二ナトリウム六水和物、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＣＯ３、酵母エキス、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、ＮａＣｌ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、消泡剤、および微量元素を原料とした混合物を含む。微量元素は、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、およびＫＩであってよく、消泡剤は、Ｙ−３０またはＢｉｏｓｐｕｍｅｘなど、発酵法で使用される任意の消泡剤であってよい。
いくつかの実施形態において、発酵培地は
３０．０〜４０．０ｇ／Ｌのコハク酸；
２．０〜４．０ｇ／ＬのＮａ２ＳＯ４；
０．５〜１．０ｇ／ＬのＣａＣｌ２；
０．２〜０．５ｇ／ＬのＫ２ＣＯ３；
０．５〜１．０ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム；
１．５〜２．５ｇ／Ｌの酵母エキス；
３．０〜６．０ｇ／Ｌのクエン酸；
０．１５〜０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４；
１０〜３０ｇ／ＬのＮａＣｌ；
１．５〜３．０ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ；
０．２〜０．４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４；および
２．０〜３．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４
を含む。
フェドバッチ発酵法を実施している間、本明細書において「供給材料」と呼ばれることもある炭素源、窒素源、およびリン源の溶液は、発酵槽容器に連結されている外部容器にそれぞれ入っている。本明細書において「コハク酸塩炭素源」と呼ばれる炭素源は、コハク酸およびコハク酸二ナトリウムの水溶液であり、無機化合物窒素源は、ＮＨ４Ｃｌ水溶液であることが好ましく、リン源は、ＫＨ２ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏの水溶液である。
炭素濃度を発酵プロセス全体を通して監視し、培地中のコハク酸濃度がある閾値濃度、例えば１〜２ｇ／Ｌにまで下がるたびに、コハク酸を外部容器から発酵槽に加える（ポンプで送り込む）。
リン濃度を発酵プロセス全体を通して監視し、必要に応じて新たなリン源を加える。いくつかの実施形態において、新たなリン酸塩溶液を、発酵が始まって１６時間後に外部容器から発酵槽にポンプで送り込み、その後さらに２４時間ごとに送り込む。
アンモニア濃度を発酵プロセス全体を通して監視し、必要に応じて新たな窒素源を加える。いくつかの実施形態において、新たなアンモニア溶液（５Ｎ ＮＨ４Ｃｌ）を、発酵が始まって１６時間後に外部容器から発酵槽にポンプで送り込み、その後さらに１２時間ごとに送り込む。
発酵を進行させるためにコハク酸塩溶液を必要に応じて加えられるよう、供給材料の体積は最小化する。発酵の開始時に、ｐＨは８．６まで上昇するため、硫酸を用いてｐＨを７に維持する。発酵中は、ＮａＯＨ溶液を加えてｐＨを７に維持する。発酵中、コハク酸の量を確認し、その量が１〜２ｇ／Ｌになると、コハク酸を外部容器から（硫酸の代わりに）加える。
発酵槽内の発酵培地は、以下のように調製する。発酵槽容器内において、クエン酸、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、およびクエン酸鉄アンモニウムの水溶液（以下「溶液１」）に、コハク酸、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＣＯ３、および酵母エキスの水溶液（以下「溶液２」）を加え、続いてＮａＣｌを加え、混合し、ＮＨ４Ｃｌ溶液（以下「溶液３」）を加え、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを５に調整することにより、溶液（以下「溶液４」）を調製する。続いて溶液４に消泡剤水溶液を加え、発酵槽を閉じ、高圧蒸気滅菌法（１２１℃、２０分）により滅菌し、無菌状態の培地に微量元素であるＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、およびＫＩの水溶液をさらに加え、続いてリン酸塩であるＫＨ２ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏの水溶液を加えることにより、初期発酵培地を形成する。発酵槽内のこの初期発酵培地にＲｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの接種原を加え、発酵中は、必要に応じて新たなコハク酸塩炭素源、塩化アンモニウム窒素源、およびリン酸塩源を発酵培地に加える。
Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの接種原を加える前の発酵槽内の温度は２８℃、ｐＨは７（必要に応じてＮａＯＨおよびコハク酸塩溶液で調整）とする。
発酵中は、良好な撹拌および通気を維持し、温度、ｐＨ、酸素濃度、ならびに窒素、炭素、およびリンの供給を監視する。温度は最低２５℃、最高３１℃の範囲内で維持し、ｐＨは６．８から７．３の範囲内であるように制御する。
約１０〜２０時間発酵させた後は、酸素を１０％以下に維持することが非常に重要である。酸素濃度が高いと、細菌の増殖は促進されるが、細菌はバクテリオクロロフィルａを生成しない。一方、酸素濃度が１０％であれば、バクテリオクロロフィルａの生成が促進される。
容器内の発酵培地の体積が概ね容器の満容量に達するまで発酵を続ける。
発酵が完了するとすぐに、培養液を遠心分離機にかけ、上澄みを廃棄する。細胞を凍結乾燥し、Ｂｃｈｌａを乾燥した細胞から抽出する。このＢｃｈｌａは、精製した後に目的のバクテリオクロロフィル誘導体への化学的誘導に使用することができる。
本発明を以下の実施例によって説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
材料および方法
Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（ＤＳＭ １３７４株）は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ社（ＤＳＭＺ）、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツから入手した。
ＢｉｏＦｌｏ ＩＶ ２０Ｌ 発酵槽は、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（米国）から入手した。
コハク酸、コハク酸二ナトリウム六水和物、ＮＨ４Ｃｌ、クエン酸鉄アンモニウム／クエン酸、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＣｌ２、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、およびＫＩは、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社 （Ｇｅｅｌ、ベルギー）から購入した。ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、Ｋ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、およびＮａＣｌは、Ｆｉｓｈｅｒ社（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、英国）から購入した。カゼインペプトンおよびカゼイン加水分解物は、Ｄｉｆｃｏ社（Ｌａｗｒｅｎｃｅ、ＫＳ、米国）から購入した。酵母エキスは、Ｄｉｆｃｏ社およびＢｉｏ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ社（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、カナダ）から購入した。ＮＨ４Ｃｌは、Ｆｌｕｋａ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）から購入した。ＫＨ２ＰＯ４は、Ｍｅｒｃｋ社（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ社、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から購入した。ＫＯＨ、Ｈ３ＢＯ３、Ｙ−３０消泡剤、およびＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏは、Ｓｉｇｍａ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）から購入した。
実施例１ 細菌Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍのワーキング細胞バンクの作成
コハク酸（９ｇ）、Ｎａ２ＳＯ４（３ｇ）、ＫＣｌ（７５０ｍｇ）、ＣａＣｌ２（７５０ｍｇ）、ＮａＨＣＯ３（３００ｍｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（１５０ｍｇ）、酵母エキス（３ｇ）、カゼインペプトン（１．５ｇ）、カゼイン加水分解物（１．５ｇ）、ＭｇＣｌ２（７．５ｇ）、ＮａＣｌ（３０ｇ）、および脱イオン水（１５００ｍＬ）を原料として水性培地を調製し、この培地と寒天との混合物を含む増殖基質であらかじめコートしたペトリ皿に、細菌Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（ＤＳＭ １３７４株）を接種した。
培地のｐＨは、１０Ｎ ＮａＯＨおよび１Ｍ ＨＣｌを用いて７に調整した。培地に寒天（培地５００ｍＬに対し寒天７．５ｇ）を加え、増殖基質を得た。増殖基質でコートしたペトリ皿を高圧蒸気滅菌法（１２１℃、３０分）によって滅菌し、その上に細菌を接種した。
３０℃で３日間培養した後、この細菌の接種原を２５０ｍＬの三角フラスコに移し、有機窒素源であるカゼインペプトン（ペトリ皿での細菌増殖に使用）を無機源である塩化アンモニウムと置き換えた接種培地で増殖させた。培養物の光学密度（ＯＤ、５４０ｎｍ）が１０を超える値に達するまで、細菌を増殖させた。８ｍＬずつに分けた接種源を無菌状態の低温凍結用１５ｍＬ管に移し、５０％の滅菌グリセリン溶液２ｍＬを加え、使用するまで−８０℃で保管した。
実施例２ 発酵培地用溶液およびその調製
以下の溶液を調製した。
溶液１
発酵槽容器内の脱イオン水４．５Ｌに以下の原料を下記の順に加え、溶解した。
Figure 0006517158
溶液２
温水４００ｍＬに以下の原料を下記の順に加えて溶解し、脱イオン水を加えて０．５Ｌとした。
Figure 0006517158
溶液３：５Ｎ 塩化アンモニウム
ＮＨ４Ｃｌ（約２６８ｇ）を水９００ｍＬに溶解し、体積を１Ｌとした。サンプル８０ｍＬを、溶液３として発酵槽へ添加するために１００ｍＬボトルに移し、残りは、発酵中に補充用窒素源として使用するために、溶液３とラベル付けした１Ｌボトルに移した。両ボトルを高圧蒸気滅菌器で滅菌（１２１℃、２０分）した。
溶液４
発酵槽容器に既に入っている４．５Ｌの溶液１に４５０ｍＬの溶液２を加え、続いて１７０ｇのＮａＣｌを加え、混合し、その後８０ｍＬの溶液３（５Ｎ ＮＨ４Ｃｌ、培地１Ｌ中、ＮＨ４ ＋１ｇ）を加えることにより、溶液４を発酵槽内で調製した。ｐＨは、１０Ｎ ＮａＯＨを用いて５に調整した。
溶液５
微量元素溶液（ＴＥＳ）である溶液５は、水０．５Ｌ中に、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（約５０ｍｇ）、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（約５０ｍｇ）、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（約１００ｍｇ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（約１５０ｍｇ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（約２００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（約１０００ｍｇ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（約５０ｍｇ）、およびＫＩ（約５００ｍｇ）を原料として含むものであった。３５ｍＬずつに分けた溶液５を１００ｍＬボトルに移し、高圧蒸気滅菌法（１２１℃、２０分）によって滅菌した。
溶液６
リン酸塩溶液である溶液６は、２５０ｍＬの脱イオン水に３０ｇのＫＨ２ＰＯ４および５ｇのＫ２ＨＰＯ４を溶解することによって調製した。ｐＨは、１０Ｎ ＫＯＨ溶液を用いて７に調整した。この溶液の５５ｍＬを１００ｍＬボトルに移し、発酵槽へ添加するために溶液６とラベル付けした。残りを５００ｍＬボトルに移し、発酵中に補充用リン源として使用するために溶液６とラベル付けした。両ボトルを高圧蒸気滅菌器で滅菌（１２１℃、２０分）した。
溶液７
消泡剤溶液である溶液７は、脱イオン水に約２５ｍｇのケイ素ベースの消泡剤Ｙ−３０を加え最終体積を２５０ｍＬとし、続いて高圧蒸気滅菌器で滅菌（１２１℃、２０分）することによって、または基礎発酵培地中の濃度が０．２〜０．５ｍＬ／Ｌとなるように消泡剤Ｂｉｏｓｐｕｍｅｘを加えることによって調整した。一般に、発酵槽へ導入される消泡剤の量は、培地中に形成される泡の量によって決まる。
溶液８
炭素源として、かつｐＨ調整剤として機能するコハク酸塩溶液である溶液８は、２５０ｇのコハク酸二ナトリウムを４Ｌの脱イオン水に溶解し、４５０ｇのコハク酸を加え、加温して溶解させ、脱イオン水を加えて最終体積を５Ｌとし、これを高圧蒸気滅菌法により滅菌（１２１℃、２０分）することによって調製した。
溶液９
１０Ｎ ＮａＯＨである溶液９は、脱イオン水２５０ｍＬを５００ｍＬボトルに入れ、高圧蒸気滅菌法によって滅菌（１２１℃、２０分）し、ボトルを冷却した後、１００ｇのＮａＯＨを加え、混合することによって調製した。
実施例３ Ｂｃｈｌａ生成のためのフェドバッチ発酵
ｐＨ電極を較正し、発酵槽容器に連結した。ＤＯ（溶存酸素）電極を同容器に連結した。発酵槽容器を閉じる直前に、この容器内のｐＨ５の溶液４に消泡剤２ｍＬを加え、滅菌処理は、２５分間１サイクルにセットした。
初期発酵培地は、以下の原料を含むものであった。
Figure 0006517158
本発明の培地は複数の工程によって調製した。最初に初期発酵培地をバイオリアクター内で調製し、その他の原料は、発酵プロセス開始時に、バイオリアクターに連結された外部容器内の供給溶液によって添加し、発酵中も、増殖培地中の各栄養素濃度をオンラインで監視しながら、継続的に添加した。リン供給溶液はＫＨ２ＰＯ４（１２．０〜１４．５ｇ／Ｌ）およびリＫ２ＨＰＯ４（１．０〜３．０ｇ／Ｌ）を含み、炭素供給溶液はコハク酸（８０．０〜１００．０ｇ／Ｌ）およびコハク酸二ナトリウム（４０．０〜６０．０ｇ／Ｌ）を含み、窒素供給溶液は２００〜３００ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌを含むものであった。これらの溶液のｐＨは、いずれも７．０に調整されていた。
発酵を開始するために、滅菌ＴＥＳ溶液（溶液５）３５ｍＬを、滅菌した溶液４が既に入っている発酵槽に加えた。その後、滅菌リン酸塩溶液（溶液６）５５ｍＬを、撹拌速度５００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ（８Ｌ／分）で通気撹拌しながら加え、発酵槽内の温度を２８℃に保った。
炭素供給溶液（コハク酸塩溶液８）をフィードポンプにつなぎ、続いて溶液７（消泡剤溶液）をフィードポンプにつないだ。必要に応じて１０Ｎ 滅菌ＮａＯＨ（溶液９）および滅菌コハク酸塩溶液を用い、増殖培地のｐＨを７に調整した。ＤＯ（溶存酸素）電極を較正した。
細菌接種原をフィードポンプを用いて発酵槽に加えた。細胞濃度は、２．３〜３．２ＯＤ／Ｌであった。最後に、リン酸塩溶液（溶液６）および塩化アンモニウム溶液（溶液３）をフィードポンプにつないだ。
フェドバッチ発酵中は、温度を最低２５℃、最高３１℃の範囲内で維持し、酸素濃度を１０％以下に維持した。ｐＨを最低６．８、最高７．３の範囲内であるよう制御した。ｐＨが７．１を超えるたびに、コハク酸塩溶液を加えた。ｐＨが６．８未満に低下するたびに、１０Ｎ ＮａＯＨ（溶液９）を加えた。
１６時間発酵させた後、溶液３（５Ｎ ＮＨ４Ｃｌ）８０ｍＬを蠕動ポンプ（ポンプ速度１ｍＬ／分）を介して発酵槽へ送り込むこと、および溶液６（リン酸塩溶液）２０ｍＬを発酵槽へポンプで送り込むことによって、増殖培地へ窒素およびリンを補給した。その後、９０ｍＬのＮＨ４Ｃｌを１２時間ごとに加え、２０ｍＬのリン酸塩を２４時間ごとに加えた（ポンプで送り込んだ）。発酵中はアンモニアおよびリンの濃度を監視し、この監視の解析結果に依存して溶液３および溶液６を加えた。
増殖培地中のコハク酸濃度が１〜２ｇ／Ｌまで低下するたびに、コハク酸（溶液８）を添加することにより炭素を補給した。約１０〜２０時間発酵させた後、酸素濃度を１０％以下に維持した。この酸素濃度であれば、バクテリオクロロフィルの生成が促進される。
増殖培地の初期体積は、バイオリアクター容量の約半分であった。発酵は１２０時間続き、増殖培地の体積はバイオリアクターのほぼ満容量まで増加した。
実施例４ バクテリオクロロフィルａの抽出
発酵が完了した後、細菌を４５００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離により分離し、培養上清を廃棄した。浸った細胞を凍結乾燥した。乾燥した（凍結乾燥した）細胞からメタノールを用いてＢｃｈｌａを抽出した。Ｂｃｈｌａの収率は、０．１５〜０．３ｇ／Ｌであった。

Claims (7)

  1. Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍからバクテリオクロロフィルａ（Ｂｃｈｌａ）を生成するフェドバッチ発酵法であって、
    （ｉ）発酵槽容器内のＲｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍを、クエン酸、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、クエン酸鉄アンモニウム、コハク酸、コハク酸二ナトリウム六水和物、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＣＯ３、酵母エキス、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、ＮａＣｌ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、消泡剤、ならびに微量元素を含む増殖培地で培養する工程；
    （ｉｉ）発酵槽容器に連結されている外部容器からコハク酸塩炭素源、塩化アンモニウム窒素源、およびリン源を培地に供給しながら、かつ酸素濃度を１０％以下に維持しながら、培養物をフェドバッチ発酵させる工程；
    （ｉｉｉ）培地から細胞を分離する工程；ならびに
    （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得た細胞からＢｃｈｌａを分離、回収する工程
    を含むことを特徴とする発酵法。
  2. 請求項１に記載の発酵法であって、工程（ｉｉ）において、
    前記コハク酸塩炭素源が、コハク酸およびコハク酸二ナトリウムの水溶液であること、
    前記無機化合物窒素源が、ＮＨ４Ｃｌ水溶液であること、ならびに
    前記リン源が、ＫＨ２ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏの水溶液であること
    を特徴とする発酵法。
  3. 請求項１に記載の発酵法であって、
    （ａ）発酵槽容器内において、クエン酸、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、およびクエン酸鉄アンモニウムの水溶液に、コハク酸、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＣＯ３、および酵母エキスの水溶液を加え、続いてＮａＣｌを加え、混合し、ＮＨ４Ｃｌ溶液を加え、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを５に調整することにより培養液を調製し、続いて該培養液に消泡剤水溶液を加え、発酵槽を閉じ、高圧蒸気滅菌法により滅菌し、無菌状態の培地に微量元素であるＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、およびＫＩの水溶液をさらに加え、続いてリン酸塩であるＫＨ２ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏの水溶液を加えることにより、初期発酵培地を形成すること、ならびに
    （ｂ）（ａ）の初期発酵培地にＲｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの接種原を加えた後、発酵中、必要に応じて新たなコハク酸塩炭素源、塩化アンモニウム窒素源、およびリン酸塩源を発酵培地に加えること
    によって増殖培地を調製することを特徴とする発酵法。
  4. 請求項３に記載の発酵法であって、
    （ｉ）発酵槽容器内で前記の培養液を調製し、ＮａＯＨを用いてｐＨを５に調整する工程；
    （ｉｉ）ｐＨ電極を較正し、発酵槽容器にｐＨ電極およびＤＯ電極を連結する工程；
    （ｉｉｉ）ｐＨ調整後の上記の培養液に消泡剤水溶液を加える工程；
    （ｉｖ）発酵槽を閉じ、高圧蒸気滅菌法によって培地を滅菌する工程；
    （ｖ）無菌状態の培地に微量元素であるＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、およびＫＩの水溶液を加え、続いてリン酸塩であるＫＨ２ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏの水溶液を加える工程；
    （ｖｉ）通気攪拌下、コハク酸塩溶液および消泡剤溶液をフィードポンプにつなぐ工程；
    （ｖｉｉ）発酵槽内の温度を２８℃に保ち、必要に応じてＮａＯＨおよびコハク酸塩溶液を用いてｐＨを７に調整する工程；
    （ｖｉｉｉ）Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍの接種原を発酵槽に加える工程；
    （ｉｘ）リン酸塩であるＫＨ２ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏの水溶液ならびに塩化アンモニウム溶液をフィードポンプにつなぐ工程；
    （ｘ）温度、ｐＨ、酸素濃度、ならびに窒素、炭素、およびリンの供給を監視しながら発酵を進める工程；ならびに
    （ｘｉ）容器内の発酵培地の体積が概ね容器の満容量に達するまで発酵を続ける工程
    を含む発酵法。
  5. 請求項４に記載の発酵法であって、工程（ｘ）において、
    温度を最低２５℃、最高３１℃の範囲内で維持すること、
    ｐＨを６．８から７．３の範囲内であるように制御すること、
    １０〜２０時間発酵させた後、酸素濃度を１０％以下とすること、ならびに
    コハク酸塩炭素源溶液、塩化アンモニウム溶液、およびリン酸塩源溶液を、培地の解析結果に依存して必要に応じて外部容器から加えること
    を特徴とする発酵法。
  6. 請求項５に記載の発酵法であって、１６時間発酵させた後、塩化アンモニウム溶液およびリン酸塩溶液をポンプで送り込み、塩化アンモニウム溶液はその後１２時間ごとに、リン酸塩溶液はその後２４時間ごとに送り込むことを特徴とする発酵法。
  7. 請求項１に記載の発酵法であって、微量元素がＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、Ｈ３ＢＯ３、およびＫＩならびにこれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする発酵法。
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