ES2849427T3 - Método de producción de bacterioclorofila A - Google Patents

Método de producción de bacterioclorofila A Download PDF

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Abstract

Un método de fermentación con alimentación discontinua para la producción de bacterioclorofila a (Bchla) a partir de Rhodovulum sulfidophilum, dicho método comprende: (i) cultivar células de Rhodovulum sulfidophilum en un recipiente de fermentador en un medio de crecimiento que contiene ácido cítrico, CaCl2*2H2O, MgSO4*7H2O, FeNH4citrato, ácido succínico, succinato disódico*6H2O, Na2SO4, K2CO3, extracto de levadura, NH4Cl, KH2PO4, K2HPO4*3H2O, NaCl, NaOH, KOH, un agente antiespumante y elementos traza; (ii) someter el cultivo a una fermentación con alimentación discontinua mientras se alimenta el medio con la fuente de carbono succinato, una fuente de nitrógeno de cloruro de amonio y una fuente de fósforo de depósitos externos conectados al recipiente del fermentador y manteniendo el nivel de oxígeno en o por debajo del 10 %; (iii) retirar las células del medio; y (iv) separar y recuperar Bchla de las células de la etapa (iii).

Description

DESCRIPCIÓN
Método de producción de bacterioclorofila A
Campo de la invención
La presente invención se dirige en general a métodos para producir bacterioclorofilas a partir de microorganismos y, en particular, a métodos de fermentación mejorados para la producción de bacterioclorofila a a partir de la bacteria púrpura Rhodovulum sulfidophilum.
Antecedentes de la invención
La terapia fotodinámica (PDT) se utiliza como tratamiento no quirúrgico de los tumores. Combina fármacos no tóxicos e iluminación fotosensibilizador no peligrosa, ambos agentes inocuos por sí mismos, para generar, en presencia de oxígeno molecular, especies reactivas de oxígeno (ROS) citotóxicas in situ que pueden matar o inactivar células. Al ser una modalidad de tratamiento binario, la PDT permite una mayor especificidad y tiene el potencial de ser más selectiva, pero no menos destructiva, en comparación con la quimioterapia o la radioterapia de uso común.
Las porfirinas se han empleado como agentes fotosensibilizadores de primera generación en clínica. El porfímero sódico (Photofrin®, una marca comercial de Axcan Pharma Inc.), el primer agente de terapia fotodinámica aprobado en el mundo, que se obtiene a partir de hematoporfirina-IX mediante tratamiento con ácidos y ha recibido la aprobación de la FDA para el tratamiento de los cánceres esofágico y de pulmón de células no pequeñas endobronquial, es una mezcla compleja e inseparable de monómeros, dímeros y oligómeros superiores.
Se ha dedicado una gran cantidad de trabajo a la síntesis de compuestos puros individuales - los llamados sensibilizadores de "segunda generación" - que absorben en longitudes de onda largas, tienen estructuras bien establecidas y exhiben una mejor diferenciación entre su retención en las células tumorales y su retención en la piel u otros tejidos normales. Con el fin de optimizar el rendimiento de los fármacos porfirínicos en terapéutica y diagnóstico, se han propuesto varios derivados de porfirina en los que, por ejemplo, hay un átomo metálico central (distinto del Mg) formando un complejo con los cuatro anillos pirrol, y/o los sustituyentes periféricos de los anillos pirrol están modificados y/o el macrociclo se dihidrogena a derivados de clorofila (clorinas) o se tetrahidrogena a derivados de bacterioclorofila (bacterioclorinas).
Debido a su intensa absorción en regiones espectrales favorables (650-850 nm) y su fácil eliminación después del tratamiento, los derivados de clorofila (Chl) y bacterioclorofila (Bchl) han sido identificados como excelentes sensibilizadores para la TFD de tumores, teniendo propiedades superiores en comparación con las porfirinas. Las bacterioclorofilas presentan una ventaja potencial en comparación con las clorofilas porque muestran bandas intensas en el infrarrojo cercano, es decir, en longitudes de onda considerablemente más largas que los derivados de la clorofila.
Las bacterioclorofilas son pigmentos fotosintéticos que se encuentran en varias bacterias fototróficas. Están relacionados con las clorofilas, que son los pigmentos primarios en plantas, algas y cianobacterias. Las bacterias que contienen bacterioclorofila (Bchl) realizan la fotosíntesis, pero no producen oxígeno. Utilizan longitudes de onda de luz que no son absorbidas por plantas o cianobacterias. Los diferentes grupos de bacterias producen diferentes tipos de bacterioclorofila:
Figure imgf000002_0001
Químicamente, las bacterioclorofilas a, b y g son bacterioclorinas, lo que significa que sus moléculas tienen un anillo de macrociclo de bacterioclorina con dos anillos de pirrol reducidos (B y D). La bacterioclorofila a (en la presente memoria Bchla) es un compuesto de la fórmula:
Figure imgf000003_0001
Las bacterioclorofilas c, d y e son clorinas, lo que significa que sus moléculas tienen un anillo de macrociclo de clorina con un solo anillo de pirrol reducido (D).
Bacterias púrpuras fotosintéticas
Las bacterias púrpuras fotosintéticas son capaces de obtener su energía celular de la luz, compuestos orgánicos o compuestos inorgánicos, dependiendo del entorno químico y físico. Esta notable versatilidad generalmente significa que se utiliza un modo de metabolismo a la vez para evitar la biosíntesis innecesaria de sistemas de energía alternativos. Por lo tanto, el metabolismo fotosintético y, por lo tanto, la biosíntesis de pigmentos solo ocurre bajo un conjunto limitado de condiciones.
Con respecto a su capacidad para producir bacterioclorofila, parece haber dos grupos principales dentro de las bacterias púrpuras. El primer grupo incluye Rhodobacter (Rba.) spheroidedes, Rba. Capsulatus y Rhodospirilum rubrum, que fotosintetizan y, por lo tanto, producen bacterioclorofila anaeróbicamente en presencia de luz; también pueden sintetizar cantidades significativas de pigmento en la oscuridad, pero solo en condiciones de baja aireación. Esto indica un control dependiente del oxígeno y la luz sobre los genes que codifican las enzimas implicadas en la síntesis de estos pigmentos. El segundo grupo, que incluye Rhodovulum sulfidophilum, sp. y Rubrivivax (Rvi.) gelatinosus, es capaz de sintetizar pigmentos en la oscuridad y realizar la fotosíntesis tanto en condiciones anaeróbicas como aeróbicas.
La biosíntesis de Bchla en la bacteria aeróbica facultativa Rhodovulum sulfidophilum, anteriormente conocida como Rhodobacter sulfidophilus, fue descrita por Porra et al., 1998 (Porra, RJ, M. Urzinger, J. Winkler, C. Bubenzer y H. Scheer, Eur. J. Biochem. 257, 185-191).
La producción de bacterioclorofila a por Rhodobacter sulfidophilus ha sido reportada por Urakami y Yoshida, 1993 (Urakami T., Yoshida T.; Journal of Fermentation and Bioengineering, 76, 191-194).
Bchla obtenida de Rhodovulum sulfidophilum ha servido como base para derivaciones y modificaciones adicionales para producir derivados de Bchla mejorados empleados en PDT y PDT dirigida a los vasos (VTP) de tumores y otras afecciones patológicas como se describe, por ejemplo, en US 6.147.195, EP 863903, US 6.333.319, US 6.569.846, WO 2004/045492 y US 8.207.154.
El uso de derivados de Bchla para PDT y la investigación de PDT está aumentando; por lo tanto, existe una necesidad creciente de producir mayores cantidades de Bchla por fermentación.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un método de fermentación para producir bacterioclorofila a (Bchla) a partir de la bacteria fotosensibilizadora púrpura. Rhodovulum sulfidophilum, que comprende las etapas de hacer crecer las bacterias en un biorreactor y extraer la Bchla producida de las bacterias recogidas.
En particular, la presente invención se refiere a un método de fermentación con alimentación discontinua para la producción de bacterioclorofila a (Bchla) a partir de Rhodovulum sulfidophilum, dicho método comprende:
(i) cultivar células de Rhodovulum sulfidophilum en un recipiente de fermentador en un medio de crecimiento que contiene ácido cítrico, CaCl2*2H2O, MgSO4*7H2O, FeNH4 citrato, ácido succínico, succinato disódico*6H2O, Na2SO4, K2CO3, extracto de levadura, NH4Cl, KH2PO4, K2HPO4*3H2O, NaCl, NaOH, KOH, un agente antiespumante y elementos traza;
(ii) someter el cultivo a una fermentación con alimentación discontinua mientras se alimenta el medio con una fuente de carbono succinato, una fuente de nitrógeno de cloruro de amonio y una fuente de fósforo de depósitos externos conectados al recipiente del fermentador y manteniendo el nivel de oxígeno en o por debajo del 10 %;
(i) retirar las células del medio; y
(ii) separar y recuperar Bchla de las células de la etapa (iii).
Descripción detallada de la invención
En métodos descritos en la literatura, Bchla se obtuvo a partir de bacterias crecidas en un medio que contenía una fuente de nitrógeno orgánico tal como peptona, polipeptona o una mezcla de aminoácidos y péptidos pequeños obtenidos por hidrólisis ácida de caseína conocidos como casaminoácidos (Shioi, Yuzo, Plant Cell Phisiol .27 (3): 567­ 572, 1986; Porra et al., Eur. J. Biochem. 257, 185-191, 1998).
Se ha descubierto ahora que determinadas modificaciones del proceso de fermentación para crecer las bacterias púrpuras Rhodovulum sulfidophilum dieron lugar a un incremento de 12 veces en la mejora del rendimiento volumétrico de Bchla y redujeron sustancialmente los costes de producción.
Por lo tanto, en un aspecto principal, la presente invención proporciona un método de fermentación para producir Bchla a partir de Rhodovulum sulfidophilum cultivada en cantidades que exceden significativamente las cantidades producidas usando los procesos de fermentación conocidos.
Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "fermentador", "recipiente del fermentador" y "biorreactor" se usan indistintamente para indicar el recipiente en el que se produce el crecimiento y la fermentación de Rhodovulum sulfidophilum según la presente invención.
Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "medio de crecimiento" y "medio de fermentación" se usan indistintamente para indicar el medio en el que se crecen las bacterias Rhodovulum sulfidophilum dentro del fermentador.
El método de la invención implica mejoras tanto en el medio de crecimiento bacteriano como en el proceso de fermentación.
La mejora relacionada con el medio de crecimiento según la presente invención consiste en la sustitución de la costosa peptona como fuente de nitrógeno de origen animal por una fuente de nitrógeno inorgánico.
La mejora del método de fermentación según la presente invención comprende el suministro continuo al biorreactor de nutrientes frescos de depósitos externos que contienen disoluciones de alimentación de las fuentes de nitrógeno, carbono y fósforo mientras se monitoriza en línea los niveles de los nutrientes esenciales en el medio de fermentación y suministrándolos según sea necesario. Según esta técnica, conocida como "fermentación con alimentación discontinua", los nutrientes se suministran continuamente a las bacterias en crecimiento en el biorreactor en cantidades y velocidades de administración que dependen de la velocidad a la que las bacterias consumen estos nutrientes en el biorreactor durante el proceso de fermentación. .
Aunque a veces se usan fuentes de nitrógeno inorgánico en el medio de crecimiento de las bacterias, los inventores han descubierto inesperadamente que el uso de cloruro de amonio como única fuente de nitrógeno y el método de fermentación con alimentación discontinua de la invención rindieron un incremento del 350 % en el peso seco de las células por litro y un incremento del 335 % en la concentración de Bchla en las células, a saber, 600 mg de Bchla por litro - casi 12 veces mayor que en los procesos comerciales conocidos. Además, dio lugar a una reducción de aproximadamente el 15 % del coste del medio usado comúnmente para crecer Rhodovulum sulfidophilum.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método de fermentación con alimentación discontinua para la producción de bacterioclorofila a (Bchla) a partir de Rhodovulum sulfidophilum, dicho método comprende:
(i) cultivar células de Rhodovulum sulfidophilum en un recipiente de fermentador en un medio de crecimiento que contiene ácido cítrico, CaCl2*2H2Ü, MgSÜ4*7H2O, FeNH citrato, ácido succínico, succinato disódico*6H2Ü, Na2SÜ4 , K2CO3 , extracto de levadura, NH4Cl, KH2 PO4, K2HPO4*3H2O, NaCl, NaOH, KOH, un agente antiespumante y elementos traza;
(ii) someter el cultivo a una fermentación con alimentación discontinua mientras se alimenta el medio con una fuente de carbono succinato, una fuente de nitrógeno de cloruro de amonio y una fuente de fósforo de depósitos externos conectados al recipiente del fermentador y manteniendo el nivel de oxígeno en o por debajo del 10 %;
(iii) retirar las células del medio; y
(iv) separar y recuperar Bchla de las células de la etapa (iii).
El compuesto de nitrógeno inorgánico en el medio de crecimiento es cloruro de amonio (NH4Cl). La fuente de nitrógeno inorgánico también se suministra a las bacterias en crecimiento suplementando el medio de fermentación durante la fermentación con alimentación discontinua según sea necesario.
La fuente de carbono en el medio de crecimiento es ácido succínico y succinato de sodio, o cualquier combinación de los mismos. Además, la fuente de carbono que comprende ácido succínico y succinato de sodio se suministra a las bacterias en crecimiento suplementando el medio de fermentación durante la fermentación con alimentación discontinua según sea necesario.
La fuente de fósforo en el medio de crecimiento puede comprender una o más sales solubles en agua de fosfato de hidrógeno y fosfato de dihidrógeno tales como fosfatos de sodio, potasio y amonio, así como pirofosfato. En determinadas realizaciones, la fuente de fósforo comprende una mezcla de las sales de fosfato K2HPO4*3H2O y KH2 PO4. Además, la fuente de fósforo que comprende estas dos sales de fosfato se suministra a las bacterias en crecimiento suplementando el medio de fermentación durante la fermentación con alimentación discontinua según sea necesario.
La fuente de hierro en el medio de fermentación puede ser una o más sales férricas o ferrosas solubles en agua tales como citrato de amonio férrico, cloruro ferroso, acetato ferroso y sulfato ferroso. En determinadas realizaciones, la fuente de hierro es citrato de amonio férrico (FeNH4citrato).
La fuente de magnesio es sulfato de magnesio (MgSO4*7H2O). La fuente de magnesio en el medio de fermentación puede ser adicionalmente una o más sales de magnesio solubles en agua tales como cloruro de magnesio, gluconato de magnesio, nitrato de magnesio, citrato de magnesio, acetato de magnesio o succinato de magnesio.
El medio de fermentación de Rhodovulum sulfidophilum puede comprender una fuente de carbono en la cantidad de 30-45 g/L, una fuente de fósforo en la cantidad de 0,4-0,7 g/L, una fuente de nitrógeno en la cantidad de 1,5-3,0 g/L, extracto de levadura en la cantidad de 1,5-2,5 g/L, una fuente de hierro en la cantidad de 0,5-1,0 g/L, una fuente de magnesio en la cantidad de 0,15-0,3 g/L, NaCl en la cantidad de 10-30 g/L y elementos traza.
En determinadas realizaciones, el medio de fermentación comprende una mezcla de los siguientes ingredientes: ácido cítrico, CaCl2*2H2O, MgSO4*7H2O, FeNH4citrato, ácido succínico, succinato disódico*6H2O, Na2SO4 , K2CO3 , extracto de levadura, NH4Cl, KH2 PO4, K2HPO4*3H2O, NaCl, NaOH, KOH, agente antiespumante y elementos traza. Los elementos traza pueden ser CoCl2*6H2O, NiCl2*6H2O, CuCl2*2 H2O, MnCl2*4H2O, ZnSO4*7H2O, Na2MoO4*2H2O, H3 BO3 y KI, y el agente antiespumante puede ser cualquier agente antiespumante usado en métodos de fermentación tales como Y-30 o Biospumex.
El medio de fermentación puede comprender las siguientes cantidades de los siguientes ingredientes: 30,0-40,0 g/L de ácido succínico; 2,0-4,0 g/L de Na2SO4 ; 0,5-1,0 g/L de CaCb ; 0,2-0,5 g/L de K2CO3 ; 0,5-1,0 g/L de citrato de amonio férrico; 1,5-2,5 g/L de extracto de levadura; 3,0-6,0 g/L de ácido cítrico; 0,15-0,3 g/L de MgSO4 ; 10-30 g/L de NaCl; 1,5-3,0 g/L de NH4Cl; 0,2-0,4 g/L de KH2 PO4 ; y 2,0-3,0 g/L de K2 HPO4.
Durante el método de fermentación con alimentación discontinua, las disoluciones de las fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo, algunas veces denominadas en la presente memoria también como "material de alimentación", se colocan cada una en un depósito externo conectado al recipiente del fermentador. La fuente de carbono, denominada en la presente memoria "fuente de carbono succinato", es una disolución acuosa de ácido succínico y succinato disódico; la fuente de nitrógeno del compuesto inorgánico es preferiblemente una disolución acuosa de NH4Cl; y la fuente de fósforo es una disolución acuosa de KH2 PO4 y K2HPO4*3H2O.
Los niveles de carbono se monitorizan durante todo el proceso de fermentación, y siempre que el nivel de ácido succínico en el medio llega a un cierto nivel umbral, por ejemplo, 1-2 g/L, se añade (bombea) ácido succínico al fermentador desde el depósito externo.
Los niveles de fósforo se monitorizan durante todo el proceso de fermentación y se añade una fuente de fósforo fresca según sea necesario. En determinadas realizaciones, se bombea una disolución de fosfato fresca desde el depósito externo al fermentador tan pronto como 16 horas después de que comience la fermentación y luego se añade cada periodo de 24 horas.
Los niveles de amoníaco se monitorizan durante todo el proceso de fermentación y se añade una fuente de nitrógeno fresca según sea necesario. En determinadas realizaciones, se bombea una disolución de amoniaco fresca (NH4Cl 5N) desde el depósito externo al fermentador tan pronto como 16 horas después de que comience la fermentación y luego se añade cada periodo de 12 horas.
El volumen de los materiales de alimentación debe minimizarse tanto como sea posible para que se pueda añadir una disolución de succinato para prolongar el curso de la fermentación, según sea necesario. Al comienzo de la fermentación, dado que el pH sube a 8,6, se usa ácido sulfúrico para mantener el pH = 7. Durante la fermentación, se añade disolución de NaOH para mantener el pH = 7. Durante este tiempo, se verifica la cantidad de ácido succínico y cuando se llega a la cantidad de 1 -2 g/L, se debe añadir ácido succínico desde el depósito externo (en lugar de ácido sulfúrico).
El medio de fermentación en el fermentador se prepara de la siguiente manera: formando en el recipiente del fermentador un medio de fermentación inicial mediante la preparación de una disolución (en adelante en la presente memoria "disolución 4") añadiendo a una disolución acuosa de ácido cítrico, CaCh *2H2O, MgSO4*7H2O y FeNH4citrato (en adelante en la presente memoria "disolución 1 ") una disolución acuosa de ácido succínico, Na2SO4 , K2CO3 y extracto de levadura (en adelante en la presente memoria "disolución 2"), seguido de la adición de NaCl, mezclado y adición de una disolución de NH4CI (en adelante en la presente memoria "disolución 3'), y ajustando el pH a 5 usando NaOH 10N, seguido de la adición a la disolución 4 de una disolución acuosa de un agente antiespumante, cerrando el fermentador y esterilizando en autoclave (121 °C, 20 min), y añadiendo adicionalmente al medio estéril una disolución acuosa de los elementos traza CoCl2*6H2O, NiCl2*6H2O, CuCl2*2H2O, MnCl2*4H2O, ZnSO4*7H2O, Na2MoO4*2H2O, H3 BO3 y KI, seguido de la adición de una disolución acuosa de las sales de fosfato KH2 PO4, K2HPO4*3H2O. Se añade un inóculo de Rhodovulum sulfidophilum a este medio de fermentación inicial en el fermentador y, durante la fermentación, se añaden al medio de fermentación cantidades frescas de la fuente de carbono succinato, de la fuente de nitrógeno de cloruro de amonio y de la fuente de fosfato, según sea necesario. La temperatura en el fermentador antes de añadir el inóculo de Rhodovulum sulfidophilum debe ser de aproximadamente 28 °C y el pH = 7 (ajustado con NaOH y disolución de succinato según se requiera).
Durante la fermentación, se debe mantener una buena agitación y aireación, y se debe monitorizar la temperatura, el pH, el nivel de oxígeno y el suministro de nitrógeno, carbono y fósforo. La temperatura debe mantenerse a un mínimo de 25 °C y un máximo de 31 °C y los límites de control del pH son 6,8 y 7,3.
Es muy importante mantener el oxígeno al 10 % o menos después de aproximadamente 10 a 20 horas de fermentación. Una alta concentración de oxígeno acelera el crecimiento de las bacterias, pero no producen bacterioclorofila a, mientras que una concentración del 10 % de oxígeno acelera la producción de bacterioclorofila a. La fermentación continúa hasta que el volumen del medio de fermentación en el recipiente aumenta hasta aproximadamente su capacidad total.
Una vez finalizada la fermentación, se centrifuga el caldo, se desecha el sobrenadante, se liofilizan las células y se extrae Bchla de las células secas. La Bchla se puede purificar y usar para la derivación química a derivados de bacterioclorofila de interés.
La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Material y métodos
Rhodovulum sulfidophilum (Cepa DSM 1374) se obtuvo de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, Alemania.
El fermentador BioFlo IV 20L era de New Brunswick Scientific (EE. UU.).
El ácido succínico, succinato disódico*6H2O, NH4Cl, FeNH4 citrato/ácido cítrico, K2 HPO4, MgCl2 CoCk *6H2O, NiCl2*6H2O, CuCl2*2H2O, MnCl2*4H2O, ZnSO4*7H2O y KI se adquirieron en Acros Organics (Geel, Bélgica); el KH2 PO4, Na2SO4, KCl, CaCl2*2H2O, K2CO3, NaHCO3 MgSO4*7H2O y NaCl se adquirieron en Fisher (Fisher Scientific, Loughborough, Reino Unido); la peptona de caseína y el hidrolizado de caseína se adquirieron en Difco (Lawrence, KS, EE. UU.); el extracto de levadura se adquirió en Difco y Bio Springer (Montreal, Quebec, Canadá); el NH4Cl se adquirió en Fluka (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel); el KH2 PO4 se adquirió en Merck (Merck KGaA, Darmstadt Alemania); el KOH, H3 BO3 , antiespumante Y-30 y Na2MoO4*2H2O se adquirieron en Sigma (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel).
Ejemplo 1. Preparación de un banco de células de trabajo de bacterias Rhodovulum sulfidophilum
Las bacterias Rhodovulum sulfidophilum (Cepa DSM 1374) se sembraron en placas de Petri recubiertas previamente con un sustrato de crecimiento que contenía agar mezclado con medio acuoso preparado a partir de los siguientes ingredientes: ácido succínico (9 g), Na2SO4 (3 g), KCl (750 mg), CaCl2 (750 mg), NaHCO3 (300 mg), FeNH4 citrato (150 mg), extracto de levadura (3 g), peptona de caseína (1,5 g), hidrolizado de caseína (1,5 g), MgCl2 (7,5 g), NaCl (30 g), agua desionizada (1.500 ml).
El pH del medio se ajustó a 7 usando NaOH 10N y HCl 1M. Se añadió agar al medio (7,5 g de agar por 500 ml de medio) para obtener el sustrato de crecimiento. Las placas de Petri recubiertas con el sustrato de crecimiento se esterilizaron en autoclave (121 °C, 30 min) y las bacterias se sembraron sobre ellas.
Después de incubar a 30 °C durante tres días, se transfiere un inóculo de las bacterias a un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se crece en un medio de inoculación en el que la peptona de caseína, fuente de nitrógeno orgánico (usada para el crecimiento de las bacterias en placas de Petri) se reemplazó con cloruro de amonio como fuente inorgánica. Las bacterias se crecieron hasta que la densidad óptica (DO 540 nm) del cultivo alcanzó un valor superior a 10. Se transfirieron partes alícuotas de ocho ml de la fuente de inóculo a tubos de congelación criogénicos estériles de 15 ml, se añadieron 2 ml de disolución de glicerol estéril al 50 % y los tubos se almacenaron a -80 °C hasta su uso.
Ejemplo 2. Disoluciones para el medio de fermentación y su preparación
Se prepararon las siguientes disoluciones:
Disolución 1. Los siguientes ingredientes se añadieron en el siguiente orden y se disolvieron en 4,5 L de agua desionizada en el recipiente del fermentador:
Figure imgf000007_0001
Disolución 2. Los siguientes ingredientes se añadieron en el siguiente orden y se disolvieron en 400 ml de agua tibia y se añadió agua desionizada para completar 0,5 L:
Figure imgf000007_0002
Disolución 3. Se disolvió cloruro de amonio 5N - NH4Cl (aproximadamente 268 g) en 900 ml de agua y se completó el volumen a 1 L. Una muestra de 80 ml se transfirió a una botella de 100 ml para su adición al fermentador como disolución 3 y el resto se transfirió a una botella de 1 L etiquetada como disolución 3 para su uso como reserva de fuente de nitrógeno durante la fermentación. Ambas botellas se esterilizaron en autoclave (121 °C, 20 min).
La disolución 4 se formó en el fermentador añadiendo 450 ml de disolución 2 a los 4,5 L de disolución 1 ya en el recipiente del fermentador, seguido de la adición de 170 g de NaCl y mezclado, y luego la adición de 80 ml de disolución 3 (NH4Cl 5N, 1 g de NH4+ en medio litro). El pH se ajustó a 5 usando NaOH 10 N.
La disolución 5, la disolución de elementos traza (TES), contenía los siguientes ingredientes: CoCl2*6H2O (aproximadamente 50 mg), NiCl2*6H2O (aproximadamente 50 mg), CuCl2*2H2O (aproximadamente 100 mg), MnCl2*4H2O (aproximadamente 150 mg), ZnSO4*7H2O (aproximadamente 200 mg), H3 BO3 (aproximadamente 1.000 mg), Na2MoO4*2H2O) (aproximadamente 50 mg) y KI (aproximadamente 500 mg) en 0,5 L de agua. Se transfirieron partes alícuotas de 35 ml de disolución 5 a botellas de 100 ml y se esterilizaron en autoclave (121 °C, 20 min).
La disolución 6, la disolución de sales de fosfato, se preparó disolviendo 30 g de KH2 PO4 y 5 g de K2 HPO4 en 250 ml de agua desionizada. El pH se ajustó a 7 usando una disolución de KOH 10N. Se transfirió una parte alícuota de 55 ml a una botella de 100 ml y se etiquetó como disolución 6 para añadir al fermentador. El resto se transfirió a una botella de 500 ml y se etiquetó como disolución 6 para su uso como reserva de fuente de fósforo durante la fermentación. Ambas botellas se esterilizaron en autoclave (121 °C, 20 min).
La disolución 7, la disolución de antiespumante, se preparó añadiendo aproximadamente 25 mg de antiespumante Y-30 a base de silicio a agua desionizada hasta un volumen final de 250 ml, seguido de esterilización en autoclave (121 °C, 20 min), o añadiendo el antiespumante Biospumex de tal manera que su concentración en el medio de fermentación básico varía de 0,2 a 0,5 mL/L. Generalmente, la cantidad de antiespumante introducida en el fermentador viene dictada por la cantidad de espuma formada en el medio.
La disolución 8, la disolución de succinato que sirve como fuente de carbono así como adaptador del pH, se preparó disolviendo 250 g de succinato disódico en 4 L de agua desionizada, añadiendo 450 g de ácido succínico, calentando para disolverlo y luego añadiendo agua desionizada hasta un volumen final de 5 L , seguido de esterilización de la disolución en autoclave (121 °C, 20 min).
La disolución 9, NaOH 10N, se preparó colocando 250 ml de agua desionizada en una botella de 500 ml, esterilizando en autoclave (121 °C, 20 min), añadiendo 100 g de NaOH a la botella enfriada y mezclando.
Ejemplo 3. Fermentación con alimentación discontinua para la producción de Bchla
El electrodo de pH se calibró y se conectó al recipiente del fermentador. El electrodo de OD (oxígeno disuelto) se conectó al recipiente. Se añadieron dos ml de antiespumante, disolución 4, a pH 5 en el recipiente del fermentador justo antes de su cierre, y la esterilización se fijó en un ciclo de 25 minutos.
El medio de fermentación inicial contenía los siguientes ingredientes:
Figure imgf000008_0001
Este medio se preparó en varias etapas, en donde primero se preparó un medio de fermentación inicial en el biorreactor y los otros ingredientes se añadieron al inicio del proceso de fermentación a partir de disoluciones de alimentación en depósitos externos conectados al biorreactor, y luego de forma continua durante la fermentación, después de la monitorización en línea de los niveles de nutrientes en el medio de crecimiento. La disolución de alimentación de fósforo contenía KH2 PO4 (12,0-14,5 g/L) y K2 HPO4 (1,0-3,0 g/L), la disolución de alimentación de carbono contenía ácido succínico (80,0-100,0 g/L) y succinato disódico (40,0-60,0 g/L), y la disolución de alimentación de nitrógeno contenía 200-300 g/L de NH4CL El pH de todas las disoluciones anteriores se ajustó a 7,0.
Para iniciar la fermentación, se añadieron 35 ml de disolución de TES estéril (disolución 5) al fermentador que ya contenía disolución 4 esterilizada. Después, se añadieron 55 ml de disolución de fosfato estéril (disolución 6) con agitación (500 rpm) y aireación a 1 VVM (8 litros/min) y la temperatura en el fermentador se estableció en 28 °C.
La disolución de alimentación de carbono (succinato, disolución 8) se conectó a las bombas de alimentación, seguido de la conexión de la disolución 7 (disolución de antiespumante) a las bombas de alimentación. El pH del medio de crecimiento se ajustó a pH 7 con NaOH 10N estéril (disolución 9) y disolución de succinato estéril según se requiera. Se calibró el electrodo de OD (oxígeno disuelto).
El inóculo de bacterias se añadió al fermentador usando una bomba de alimentación. La concentración celular fue de 2,3-3,2 OD/L. Finalmente, la disolución de fosfato (disolución 6) y la disolución de cloruro de amonio (disolución 3) se conectaron a las bombas de alimentación.
Durante la fermentación con alimentación discontinua, la temperatura se mantuvo entre un mínimo de 25 °C y un máximo de 31 °C y el nivel de oxígeno se mantuvo en o por debajo del 10 %. El pH se controló entre un mínimo de 6,8 y un máximo de 7,3. Se añadió disolución de succinato siempre que el pH aumentara por encima de 7,1. Se añadió NaOH 10N (disolución 9) siempre que el pH descendiera por debajo de 6,8.
Después de 16 horas de fermentación, se renovó el suministro de nitrógeno y el suministro de fósforo al medio de cultivo bombeando 80 ml de disolución 3 (NH4Cl 5N) a través de una bomba peristáltica (velocidad de la bomba 1 ml/min) y 20 ml de disolución 6 (disolución de fosfato) en el fermentador. Después, se añadieron 90 ml de NH4Cl cada período de 12 horas, y se añadieron (bombearon) 20 ml de fosfato cada período de 24 horas. Los niveles de amoniaco y fósforo se monitorizaron durante la fermentación y la adición de las disoluciones 3 y 6 dependió de los resultados del análisis de esta monitorización.
El suministro de carbono se renovó mediante la adición de ácido succínico (disolución 8) siempre que el nivel de ácido succínico en el medio de crecimiento se redujera a 1-2 g/L. El nivel de oxígeno se mantuvo en o por debajo del 10 % después de aproximadamente 10-20 horas de fermentación. Este nivel de oxígeno acelera la producción de bacterioclorofila.
El volumen inicial del medio de crecimiento fue aproximadamente la mitad del volumen del biorreactor. La fermentación continuó durante hasta 120 horas y el volumen aumentó hasta aproximadamente la capacidad total del biorreactor.
Ejemplo 4. Extracción de bacterioclorofila a
Una vez completada la fermentación, se retiraron las bacterias mediante centrifugación a 4.500 rpm durante 15 minutos y se desechó el sobrenadante del cultivo. Las células sumergidas se liofilizaron. Se extrajo Bchla de las células secas (liofilizadas) usando metanol. El rendimiento de Bchla fue de 0,15 a 0,3 g/litro.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un método de fermentación con alimentación discontinua para la producción de bacterioclorofila a (Bchla) a partir de Rhodovulum sulfidophilum, dicho método comprende:
(i) cultivar células de Rhodovulum sulfidophilum en un recipiente de fermentador en un medio de crecimiento que contiene ácido cítrico, CaCh*2H2O, MgSO4*7H2O, FeNH4citrato, ácido succínico, succinato disódico*6H2O, Na2SO4, K2CO3, extracto de levadura, NH4Cl, KH2PO4, K2HPO4*3H2O, NaCl, NaOH, KOH, un agente antiespumante y elementos traza;
(ii) someter el cultivo a una fermentación con alimentación discontinua mientras se alimenta el medio con la fuente de carbono succinato, una fuente de nitrógeno de cloruro de amonio y una fuente de fósforo de depósitos externos conectados al recipiente del fermentador y manteniendo el nivel de oxígeno en o por debajo del 10 %;
(iii) retirar las células del medio; y
(iv) separar y recuperar Bchla de las células de la etapa (iii).
2. El método de fermentación según la reivindicación 1, en donde en la etapa (ii) dicha fuente de carbono succinato es una disolución acuosa de ácido succínico y succinato disódico; dicha fuente de nitrógeno de cloruro de amonio es una disolución acuosa de NH4Cl; y dicha fuente de fósforo es una disolución acuosa de KH2PO4 y foHPO4*3H2O.
3. El método de fermentación según la reivindicación 1, en donde el medio de crecimiento se prepara como sigue: (a) formar en el recipiente del fermentador un medio de fermentación inicial mediante la preparación de una disolución de cultivo mediante la adición a una disolución acuosa de ácido cítrico, CaCh*2H2O, MgSO4*7H2O y FeNH4citrato, una disolución acuosa de ácido succínico, Na2SO4, K2CO3 y extracto de levadura, seguido de la adición de NaCl, mezclado y adición de una disolución de NH4Cl, y ajuste del pH a 5 usando NaOH 10N, seguido de la adición a la disolución de cultivo de una disolución acuosa de un agente antiespumante, cerrar el fermentador y esterilizar en autoclave, y añadir además al medio estéril una disolución acuosa de los elementos traza CoCl2*6H2O, NiCl2*6H2O, CuCl2*2H2O, MnCl2*4H2O, ZnSO4*7H2O, Na2MoO4*2H2O, H3BO3 y KI, seguido de la adición de una disolución acuosa de las sales de fosfato KH2PO4 y K2HPO4*3H2O;
(b) después de la adición de un inóculo de Rhodovulum sulfidophilum al medio de fermentación inicial de (a), añadir durante la fermentación cantidades frescas de la fuente de carbono succinato, de la fuente de nitrógeno de cloruro de amonio y de la fuente de fosfato al medio de fermentación según sea necesario.
4. El método de fermentación según la reivindicación 2, que comprende las etapas:
(i) formar la disolución de cultivo en el recipiente del fermentador y ajustar el pH a 5 usando NaOH;
(ii) calibrar el electrodo de pH y conectar al recipiente del fermentador el electrodo de pH y el electrodo de OD; (iii) añadir a la disolución de cultivo una disolución acuosa de un agente antiespumante;
(iv) cerrar el fermentador y esterilizar el medio mediante autoclave;
(v) añadir al medio estéril una disolución acuosa de los elementos traza CoCl2*6H2O, NiCl2*6H2O, CuCl2*2H2O, MnCl2*4H2O, ZnSO4*7H2O, Na2MoO4*2H2O, H3BO3 y KI, seguido de la adición de una disolución acuosa de las sales de fosfato KH2PO4 y K2HPO4*3H2O;
(vi) bajo agitación y aireación conectar la disolución de succinato y la disolución de antiespumante a las bombas de alimentación;
(vii) establecer una temperatura de 28 °C en el fermentador y ajustar el pH a 7 con NaOH y disolución de succinato según se requiera;
(viii) añadir un inóculo de Rhodovulum sulfidophilum al fermentador;
(ix) conectar la disolución acuosa de las sales de fosfato KH2PO4 y K2HPO4*3H2O y la disolución de cloruro de amonio a las bombas de alimentación;
(x) proceder a la fermentación mientras se monitoriza la temperatura, el pH, el nivel de oxígeno y el suministro de nitrógeno, carbono y fósforo; y
(xi) continuar la fermentación hasta que el volumen del medio de fermentación en el recipiente aumente hasta su capacidad total.
5. El método de fermentación según la reivindicación 4, en donde en la etapa (x) la temperatura se mantiene a un mínimo de 25 °C y un máximo de 31 °C; los límites de control del pH son 6,8 y 7,3; el nivel de oxígeno es del 10 % o menos después de 10-20 horas de fermentación; y las disoluciones de fuente de carbono succinato, fuente de cloruro de amonio y de fosfato se añaden desde los depósitos externos según sea necesario dependiendo de los resultados del análisis del medio.
6. El método de fermentación según la reivindicación 5, en donde la disolución de cloruro de amonio se bombea después de 16 horas de fermentación y luego cada 12 horas, y la disolución de fosfato se bombea después de 16 horas de fermentación y luego cada 24 horas.
7. El método según la reivindicación 1, en donde los elementos traza se seleccionan del grupo que consiste en CoCl2*6H2O, NiCl2*6H2O, CuCl2*2H2O, MnCl2*4H2O, ZnSO4*7H2O, Na2MoO4*2H2O, H3 BO3 , KI y combinaciones de los mismos.
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