CN108587975A - 一种沼泽红假单胞菌培养基及培养方法 - Google Patents

一种沼泽红假单胞菌培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种沼泽红假单胞菌培养基及培养方法，先进行培养基的配制，将沼泽红假单胞菌菌株进行活化后接种至配制好的培养液中在适宜的温度下培养3～5d后，在培养液中取少量进行镜检，镜检无杂菌且沼泽红假单胞菌的数量达到5*108～7*108个，得到沼泽红假单胞菌发酵液。本发明公开了一种成分简单且制备方法简便的液体培养基配方，用于富集沼泽红假单胞菌，除此之外，其培养过程条件简单，培养出的沼泽红假单胞菌活菌含量高，稳定性能较好，使用效果好且保存时间长。

Description

一种沼泽红假单胞菌培养基及培养方法
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，特别涉及一种沼泽红假单胞菌培养基及培养方法。
背景技术
光合细菌是自然界最广泛存在的比较古老的、能进行光合作用而不产氧的特殊生理类群的原核微生物的总称，具有原始光能合成体系，能在厌氧条件下进行不放氧的光合作用，是水体兼性厌氧层中主要的初级生产者，并在自然界的碳素、氮素、硫素转化循环中起重要作用。它包括有红螺菌科、着色菌科、绿杆菌科、绿色丝状菌科4科。光合细菌广泛分布于水田、湖沼、江河、海洋、活性污泥、土壤、极地或温泉(包括高热水体)以及高盐、高有机质含量等不同生态环境中，它可以光能异养、化能异养、光能自养方式生活，存在着好氧、厌氧和兼性厌氧类型，能利用多种基质。光合细菌细胞内含有细菌色素(如类胡萝卜素、菌绿素)、卟啉类化合物、泛醌等多种有效的自由基清除物质，可保护细胞膜、DN等自身细胞的重要组份不受损伤。光合细菌具有多重代谢方式，尤其在对高浓度有机废水的净化处理中，表现出负荷低、效率高及投资少的优点；在禽畜养殖方面，光合细菌可作为一种饲料蛋白补充，还可以起到益生菌的作用。在水产养殖方面，有改善水质，预防鱼病的作用，对产量和成活率均有显著的提高。在光合细菌中沼泽红假单胞菌的应用最为广泛，是我国农业部颁布12种允许在饲料中直接添加的活体微生物之一。
沼泽红假单胞菌是光合细菌的代表菌株之一，别名：红假菌。被应用于农业、渔业、环保、医药等领域。由于细菌菌体富含蛋白质、维生素、类胡萝卜素等营养物质，作为饲料添加剂可以有效地提高饲料效率，促进生长。同时，由于光合细菌体积小，适合在水产养殖业中作为开口饵料使用。此外，它作为益生菌对有害菌起到抑制和排斥作用，能保持正常的菌群，促进营养物质的消化吸收，参与消化酶生成及B族维生素的合成，减少氨及有害物质的产生，提高局部免疫力和抗病力。
沼泽红假单胞菌是研究和应用较为广泛的一种光合细菌，属于外硫红螺菌科红假单胞菌属，细胞直径0.6－0.9μm，极生鞭毛运动或不运动，生长有极性，不对称出芽分裂，革兰氏染色阴性，光合色素为叶绿素a、h和类胡萝卜素。其最佳生长方式是利用各种有机化合物作碳源和电子供体进行光照厌氧培养。在厌氧条件下以氢、硫代硫酸钠、硫化氢等作电子供体可光自养生长。G+Cmol％为64.8－66.4。以沼泽红假单胞菌液为添加剂的饲料产品是现代生物技术与动物微生态学、动物营养学相结合的产物。沼泽红假单胞菌作为微生态制剂的研究，将对推动我国养殖业向着高效、绿色、生态、健康的方向发展具有重要意义，其应用前景也十分广阔。
目前市面上的光合菌(沼泽红假单胞菌)由于生产设备、工艺要求高，操作复壮，导致成本较高，难以在养殖户中进行规模化推广。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种成分简单且制备方法简便的液体培养基配方，用于富集沼泽红假单胞菌，除此之外，其培养过程条件简单，培养出的沼泽红假单胞菌活菌含量高，稳定性能较好，使用效果好且保存时间长。为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种沼泽红假单胞菌培养方法，包括如下步骤：
(1)制备培养液：按照一定配比称量好培养基的成分，混合后按比例添加纯净水，加热溶解后搅拌均匀后调节PH值至7.2，冷却至40℃备用；
(2)将沼泽红假单胞菌的原菌液进行菌种活化后，通过光照培养至红色单菌落出现，将单菌落按照10％的添加量添加到步骤(1)中制备的培养液中进行培养基接种；
(3)原菌液在培养基中稳定3～5h后使用白炽灯照射并保持温度在30～35℃进行密封培养3～5d；
(4)取步骤(3)中的培养液进行镜检，镜检无杂菌且沼泽红假单胞菌的数量达到5*108～7*108个，得到沼泽红假单胞菌发酵液。
进一步地，所述培养基由以下含量的原料配制而成：醋酸钠4～7g/L，碳酸氢钠1～3g/L，氯化铵0.5～2g/L，磷酸氢二钾0.1～1g/L，氯化镁0.1～1g/L，山梨酸钾0.1～1g/L，氯化钠3～5g/L，酵母膏0.1～1g/L，虾壳粉0.3～0.7g/L，柠檬酸0.05～0.2g/L，草木灰0.05～0.2g/L。
进一步地，所述加热搅拌的温度为65～80℃，所述调节PH值是通过碳酸氢钠调节。
进一步地，所述菌种活化为先取沼泽红假单胞菌菌株置于LB培养基中，在培养基的液面加入石蜡进行液面固封，保持温度在30～32℃，使用30瓦白炽灯近距离照射且厌氧培养6～8d后得到活化的沼泽红假单胞菌种。
进一步地，所述培养基接种为将培养液灭菌后，在60～75r/min的搅拌速度下将活化的菌种逐渐加入培养液中，在30℃下进行培养。
进一步地，所述白炽灯的光照强度为1000～1800Lx。
进一步地，所述富含沼泽红假单胞菌培养液在猪的饲料添加剂中的应用。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明公开的沼泽红假单胞菌培养方法通过菌种的活化接种等步骤将沼泽红假单胞菌置于配制的液体培养基中进行培养，该培养基克服了成本高、生产设备要求高、工艺操作过于复杂的缺点，其成分简单，方便操作，培养的沼泽红假单胞菌活菌含量高，平均可达到109cfu/mL，稳定性较好，保存时间相对较长，便于进行大规模培养及应用，且应用效果好，社会价值显著，属于绿色饲用添加剂，本发明公开的培养基中在光合细菌基础培养基中添加了虾壳粉、柠檬酸和草木灰，为光合细菌生长提供充足的矿质元素及维生素。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
实施例1
一种沼泽红假单胞菌培养方法，包括如下步骤：
(1)制备培养液：按照一定配比称量好培养基的成分，混合后按比例添加纯净水，加热至65～80℃溶解后搅拌均匀后调节PH值至7.2，冷却至40℃备用，培养基由以下含量的原料配制而成：醋酸钠4g/L，碳酸氢钠1g/L，氯化铵0.5g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，氯化镁0.1g/L，山梨酸钾0.1g/L，氯化钠3g/L，酵母膏0.1g/L，虾壳粉0.3g/L，柠檬酸0.05g/L，草木灰0.05g/L。
(2)将沼泽红假单胞菌的原菌液进行菌种活化后，通过光照培养至红色单菌落出现，将单菌落按照10％的添加量添加到步骤(1)中制备的培养液中进行培养基接种，所述菌种活化为先取沼泽红假单胞菌菌株置于LB培养基中，在培养基的液面加入石蜡进行液面固封，保持温度在30℃，使用30瓦白炽灯近距离照射且厌氧培养6d后得到活化的沼泽红假单胞菌种。培养基接种为将培养液灭菌后，在60r/min的搅拌速度下将活化的菌种逐渐加入培养液中，在30℃下进行培养。
(3)原菌液在培养基中稳定3h后使用白炽灯照射并保持温度在30℃进行密封培养3d，白炽灯的光照强度为1000Lx。
(4)取步骤(3)中的培养液进行镜检，镜检无杂菌且沼泽红假单胞菌的数量达到5*108个，得到沼泽红假单胞菌发酵液。
实施例2
一种沼泽红假单胞菌培养方法，包括如下步骤：
(1)制备培养液：按照一定配比称量好培养基的成分，混合后按比例添加纯净水，加热至80℃溶解后搅拌均匀后调节PH值至7.2，冷却至40℃备用，培养基由以下含量的原料配制而成：醋酸钠7g/L，碳酸氢钠3g/L，氯化铵2g/L，磷酸氢二钾0.1～1g/L，氯化镁1g/L，山梨酸钾1g/L，氯化钠5g/L，酵母膏1g/L，虾壳粉0.7g/L，柠檬酸0.2g/L，草木灰0.2g/L。
(2)将沼泽红假单胞菌的原菌液进行菌种活化后，通过光照培养至红色单菌落出现，将单菌落按照10％的添加量添加到步骤(1)中制备的培养液中进行培养基接种，所述菌种活化为先取沼泽红假单胞菌菌株置于LB培养基中，在培养基的液面加入石蜡进行液面固封，保持温度在32℃，使用30瓦白炽灯近距离照射且厌氧培养8d后得到活化的沼泽红假单胞菌种。培养基接种为将培养液灭菌后，在75r/min的搅拌速度下将活化的菌种逐渐加入培养液中，在30℃下进行培养。
(3)原菌液在培养基中稳定5h后使用白炽灯照射并保持温度在35℃进行密封培养5d，白炽灯的光照强度为1800Lx。
(4)取步骤(3)中的培养液进行镜检，镜检无杂菌且沼泽红假单胞菌的数量达到7*108个，得到沼泽红假单胞菌发酵液。
实施例3
一种沼泽红假单胞菌培养方法，包括如下步骤：
(1)制备培养液：按照一定配比称量好培养基的成分，混合后按比例添加纯净水，加热至72℃溶解后搅拌均匀后调节PH值至7.2，冷却至40℃备用，培养基由以下含量的原料配制而成：醋酸钠6g/L，碳酸氢钠2g/L，氯化铵1.2g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化镁0.5g/L，山梨酸钾0.5g/L，氯化钠4g/L，酵母膏0.5g/L，虾壳粉0.4g/L，柠檬酸0.07g/L，草木灰0.07g/L。
(2)将沼泽红假单胞菌的原菌液进行菌种活化后，通过光照培养至红色单菌落出现，将单菌落按照10％的添加量添加到步骤(1)中制备的培养液中进行培养基接种，所述菌种活化为先取沼泽红假单胞菌菌株置于LB培养基中，在培养基的液面加入石蜡进行液面固封，保持温度在31℃，使用30瓦白炽灯近距离照射且厌氧培养7d后得到活化的沼泽红假单胞菌种。培养基接种为将培养液灭菌后，在70r/min的搅拌速度下将活化的菌种逐渐加入培养液中，在30℃下进行培养。
(3)原菌液在培养基中稳定4h后使用白炽灯照射并保持温度在32℃进行密封培养4d，白炽灯的光照强度为1500Lx。
(4)取步骤(3)中的培养液进行镜检，镜检无杂菌且沼泽红假单胞菌的数量达到6*108个，得到沼泽红假单胞菌发酵液。
实施例4
一种沼泽红假单胞菌培养方法，包括如下步骤：
(1)制备培养液：按照一定配比称量好培养基的成分，混合后按比例添加纯净水，加热至70℃溶解后搅拌均匀后调节PH值至7.2，冷却至40℃备用，培养基由以下含量的原料配制而成：醋酸钠5g/L，碳酸氢钠1.5g/L，氯化铵0.8g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，氯化镁0.3/L，山梨酸钾0.5g/L，氯化钠3.5g/L，酵母膏0.3g/L，虾壳粉0.5g/L，柠檬酸0.09g/L，草木灰0.09g/L。
(2)将沼泽红假单胞菌的原菌液进行菌种活化后，通过光照培养至红色单菌落出现，将单菌落按照10％的添加量添加到步骤(1)中制备的培养液中进行培养基接种，所述菌种活化为先取沼泽红假单胞菌菌株置于LB培养基中，在培养基的液面加入石蜡进行液面固封，保持温度在31℃，使用30瓦白炽灯近距离照射且厌氧培养6d后得到活化的沼泽红假单胞菌种。培养基接种为将培养液灭菌后，在65r/min的搅拌速度下将活化的菌种逐渐加入培养液中，在30℃下进行培养。
(3)原菌液在培养基中稳定3h后使用白炽灯照射并保持温度在32℃进行密封培养3d，白炽灯的光照强度为1200Lx。
(4)取步骤(3)中的培养液进行镜检，镜检无杂菌且沼泽红假单胞菌的数量达到5*108个，得到沼泽红假单胞菌发酵液。
实施例5
一种沼泽红假单胞菌培养方法，包括如下步骤：
(1)制备培养液：按照一定配比称量好培养基的成分，混合后按比例添加纯净水，加热至78℃溶解后搅拌均匀后调节PH值至7.2，冷却至40℃备用，培养基由以下含量的原料配制而成：醋酸钠6.5g/L，碳酸氢钠2.5g/L，氯化铵1.8g/L，磷酸氢二钾0.8g/L，氯化镁0.6g/L，山梨酸钾0.6g/L，氯化钠4.5g/L，酵母膏0.8g/L，虾壳粉0.6g/L，柠檬酸0.12g/L，草木灰0.12g/L。
(2)将沼泽红假单胞菌的原菌液进行菌种活化后，通过光照培养至红色单菌落出现，将单菌落按照10％的添加量添加到步骤(1)中制备的培养液中进行培养基接种，所述菌种活化为先取沼泽红假单胞菌菌株置于LB培养基中，在培养基的液面加入石蜡进行液面固封，保持温度在32℃，使用30瓦白炽灯近距离照射且厌氧培养8d后得到活化的沼泽红假单胞菌种。培养基接种为将培养液灭菌后，在72r/min的搅拌速度下将活化的菌种逐渐加入培养液中，在30℃下进行培养。
(3)原菌液在培养基中稳定5h后使用白炽灯照射并保持温度在33℃进行密封培养4d，白炽灯的光照强度为1600Lx。
(4)取步骤(3)中的培养液进行镜检，镜检无杂菌且沼泽红假单胞菌的数量达到7*108个，得到沼泽红假单胞菌发酵液。
分别取上述实施例制备的含沼泽红假单胞菌的培养液进行镜检，其中沼泽红假单胞菌的个数分别为1*1010cfu/mL、3*109cfu/mL、6*109cfu/mL、4*109cfu/mL、5*109cfu/mL。
从以上数据可以看出，根据本发明的方法制备出来的沼泽红假单胞菌活菌含量高，达到109cfu/mL，稳定性较好，而且整个培养基的制备操作方便，成分简单，有利于大规模培养。
实施例6
将实施例5中制备的沼泽红假单胞菌以2.5％的添加量添加至育肥猪饲料中，喂养30天，另外设立一组空白组，使用不添加沼泽红假单胞菌的饲料进行喂养，两组中喂养的时间、饲料量等均一致，观察两组猪的生产情况及测量其体重变化情况如下表所示：
由上表可知，沼泽红假单胞菌在猪饲料添加剂的应用中对育肥猪的增重效果显著，可广泛推广并应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种沼泽红假单胞菌培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)制备培养液：按照一定配比称量好培养液的各原料，混合后按照比例加入纯净水，加热溶解后搅拌均匀后调节PH值至7.2，冷却至40℃备用；
(2)将沼泽红假单胞菌的原菌液进行菌种活化后，通过光照培养至红色单菌落出现，将单菌落按照10％的添加量添加到步骤(1)中制备的培养液中进行培养基接种；
(3)原菌液在培养基中稳定3～5h后使用白炽灯照射并保持温度在30～35℃进行密封培养3～5d；
(4)取步骤(3)中的培养液进行镜检，镜检无杂菌且沼泽红假单胞菌的数量达到5*108～7*108个，得到沼泽红假单胞菌发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种沼泽红假单胞菌培养基，特征在于：所述培养液由以下含量的原料配制而成：醋酸钠4～7g/L，碳酸氢钠1～3g/L，氯化铵0.5～2g/L，磷酸氢二钾0.1～1g/L，氯化镁0.1～1g/L，山梨酸钾0.1～1g/L，氯化钠3～5g/L，酵母膏0.1～1g/L，虾壳粉0.3～0.7g/L，柠檬酸0.05～0.2g/L，草木灰0.05～0.2g/L。
3.根据权利要求1所述的一种沼泽红假单胞菌培养方法，特征在于：所述加热搅拌的温度为65～80℃，所述调节PH值是通过碳酸氢钠调节。
4.根据权利要求1所述的一种沼泽红假单胞菌培养方法，特征在于：所述菌种活化为先取沼泽红假单胞菌菌株置于LB培养基中，在培养基的液面加入石蜡进行液面固封，保持温度在30～32℃，使用30瓦白炽灯近距离照射且厌氧培养6～8d后得到活化的沼泽红假单胞菌种。
5.根据权利要求1所述的一种沼泽红假单胞菌培养方法，特征在于：所述培养基接种为将培养液灭菌后，在60～75r/min的搅拌速度下将活化的菌种逐渐加入培养液中，在30℃下进行培养。
6.根据权利要求1所述的一种沼泽红假单胞菌培养方法，特征在于：所述白炽灯的光照强度为1000～1800Lx。
7.根据权利要求1所述的一种沼泽红假单胞菌培养基，特征在于：所述富含沼泽红假单胞菌培养液在猪的饲料添加剂中的应用。
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