CN109749969A - 一种假单胞菌微生物的制备方法及抑藻应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种本发明提供的一种假单胞菌微生物的制备方法,通过人工配置假单胞菌培养基,加入一定体积比的EM原液,进行选择性培养,再取一定体积比的已培养的假单胞菌培养液加入至新的假单胞菌培养基,经复培后,获得假单胞菌的菌液。其应用于水体富营养化抑制藻类爆发,抑藻方式是直接攻击藻细胞和分泌抑藻物质;且假单胞菌的数量与抑藻效果有关。作为“抑藻剂”,采用天然生物材料,环境亲和性强,假单胞菌产生的物质能够被环境所自然降解,使用中无二次污染,操作简便,可实施性强,安全性能高,抑制效果良好;使用时不受地域、节气的影响,有利于实际应用,为利用生物方法处理水体藻华问题提供新的方法和方向。
Description
技术领域
本发明涉及一种假单胞菌微生物,具体涉及一种假单胞菌微生物的制备方法及抑藻应用,属于水体富营养化抑制藻类爆发技术领域。
背景技术
目前研究表明,菌类溶藻的作用方式,主要分为两大类:直接溶藻和间接溶藻。具体可以分为:
直接接触溶藻。某些细菌可以直接与藻细胞接触,通过释放可溶解纤维素的酶等物质消化藻细胞的细胞壁,然后逐步溶解整个藻细胞。
与藻营养竞争。某些细菌通过与藻类竞争C、N、P、K等营养物质,夺取藻类的营养,抑制藻类的生长。
形成菌胶膜。一些腐败菌、亚硝酸菌、大肠杆菌和枯草杆菌等会使藻类培养物颜色变暗黄并产生沉淀,同时发生腐败在作用生成异味。这些菌类还能在静态水面上集结形成菌胶膜,阻碍水体与环境之间的气体交换和光线投射,使水环境发生变化,不利于藻类的生长。
直接进入宿主藻细胞内杀死藻细胞。细菌可内生于不同种类的藻中,既可存在于细胞核,也可以在细胞质甚至细胞器中;但是,这种寄生一般对宿主细胞的影响不大。因此,能够入侵宿主细胞并使其溶解的细菌就有特殊意义。
释放抑藻物质。这是溶藻菌类最常见的抑藻方式。细菌可以通过释放特异性或非特异性地胞外物质来杀死藻细胞。而这些抑藻物质通常都存在于无菌滤液中。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种。
为了实现上述目标,本发明采用如下的技术方案:
一种假单胞菌微生物的培养方法,包括以下步骤:
S1、将假单胞菌培养基置于恒温振荡箱培,得假单胞菌液体培养基;
S2、取部分假单胞菌液体培养基,接入EM原液,按假单胞菌的培养条件进行培养,得假单胞菌培养液;
S3、将假单胞菌培养液加到新的假单胞菌培养基中培养;
S4、复壮:重复步骤S2-S3,得到假单胞菌的菌液。
上述假单胞菌培养基中包括乙酸钠、丙酸钠、酵母膏、(NH4)2HPO4、H2O。
上述恒温振荡箱的转速为130-180r·min-1。
上述步骤S2和S3的培养时间为48-96h,步骤S4的重复次数为4-5次。
上述步骤S2中接入的EM原液为假单胞菌液体培养基的体积的1%—10%
上述步骤S3中所取假单胞菌培养液的体积为步骤S2制备的假单胞菌培养液的1%—10%。
一种假单胞菌微生物的抑藻应用,包括以下步骤:
K1、取上述培养方法所制得的菌液,离心,得到下层的假单胞菌的菌体;
K2、清洗菌体后,加入BG-11培养液制成假单胞菌悬浊液;
K3、于假单胞菌悬浊液中加入藻液和BG-11培养液,得菌藻混合液。
上述步骤K2中,清洗液为BG-11培养液,清洗方式包括混匀、离心,清洗次数为2-5次。
上述步骤K1中菌液的体积为10-50mL;
步骤K2中假单胞菌悬浊液的配制体积为1-5mL;
步骤K3中菌藻混合液的体积为30-60mL。
本发明的有益之处在于:
本发明提供的一种假单胞菌微生物的制备方法,通过人工配置假单胞菌培养基,加入一定体积比的EM原液,进行选择性培养,再取一定体积比的已培养的假单胞菌培养液加入至新的假单胞菌培养基,经反复培养后,获得假单胞菌的菌液。其应用于水体富营养化抑制藻类爆发领域,通过对铜绿微囊藻和假单胞菌进行电镜扫描和假单胞菌无菌滤液对铜绿微囊藻的影响的研究,发现其抑藻方式有两种,一种是通过直接攻击藻细胞,另一种是通过分泌抑藻物质;且,假单胞菌的数量与抑藻效果有关。同时,利用叶绿素a和丙二醛的变化佐证假单胞菌的抑藻能力。
本发明的假单胞菌作为一种基本细菌,原料易得,成本低廉,同时也拓展了假单胞菌的使用范围;作为“抑藻剂”,采用天然生物材料,环境亲和性强,假单胞菌产生的物质能够被环境所自然降解,使用中无二次污染,操作简便,可实施性强,安全性能高,抑制效果良好;使用时不受地域、节气的影响,能在较长时间内保持一定的抑藻效率,抑制藻类爆发,有利于实际应用,为利用生物方法处理水体藻华问题提供新的方法和方向。
附图说明
图1为本发明的不同体积的假单胞菌对铜绿微囊藻的相对抑制率;
图2为本发明的不同体积的假单胞菌无菌滤液对铜绿微囊藻的影响;
图3为本发明的铜绿微囊藻在培养48h后的电镜扫描图;
图4为本发明的加入假单胞菌后培养48h的菌藻混合液的电镜扫描图;
图5为本发明的假单胞菌对铜绿微囊藻中叶绿素a含量的影响;
图6为本发明的假单胞菌对铜绿微囊藻中丙二醛含量的影响。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种假单胞菌微生物的培养方法,包括以下步骤:
S1、将假单胞菌培养基置于转速为130-180r·min-1的恒温振荡箱中培养,得假单胞菌液体培养基;
S2、取部分假单胞菌液体培养基,按1%—10%的体积比接入EM原液,按假单胞菌的培养条件进行培养48-96h,得假单胞菌培养液;
S3、再按1%—10%的体积比,取假单胞菌培养液加到新的假单胞菌培养基中培养72h;
S4、复壮:重复4-5次步骤S2-S3,得到假单胞菌的菌液。
假单胞菌培养基中包括乙酸钠0.45g,丙酸钠2.7g,酵母膏0.5g,(NH4)2HPO4 1.2g,H2O 1L。
培养实施例:
以实施例1所制备的菌液做假单胞菌微生物的抑藻应用,包括以下步骤:
K1、取一定体积所制得的菌液,离心(8000r·min-1,20min),得到下层的假单胞菌的菌体;
K2、用BG-11培养液清洗菌体(混匀-离心)2次后后,加入BG-11培养液制成5mL的假单胞菌悬浊液;
K3、于假单胞菌悬浊液中加入初始浓度在(2-4)×106cells·mL-1的铜绿微囊藻液和BG-11培养液,得50mL的菌藻混合液。
A、对铜绿微囊藻的相对抑制率
将菌藻混合液放置于光照培养箱中培养7d左右,每24h于显微镜下计数,记录7d内藻类生长情况,根据藻密度,计算对铜绿微囊藻的相对抑制率。
如图1所示,为分别取体积为5mL、10mL、15mL、25mL、30mL的菌液经过离心后的菌体投加到铜绿微囊藻中,经步骤K1-K3制得总体积为50mL的菌藻混合液(藻的初始浓度在2~4×106cells·mL-1);研究不同体积的假单胞菌对铜绿微囊藻的相对抑制率。
从图1可见,假单胞菌对藻是有抑制作用的。
B、假单胞菌滤液对铜绿微囊藻的影响
利用改进的细菌滤液检验方法。
取10mL步骤K3制备的菌藻混合液(含25mL的菌液),用0.22μm玻璃纤维膜(使用前450℃灼烧4h)过滤其中的菌和藻,过滤两次,在平板上划线确定没有细菌生长之后,将所得的无菌滤液按不同体积(3ml、6ml、9ml)分别投加到25ml的铜绿微囊藻(藻的初始浓度在2~4×106cells·mL-1)中,测定藻的抑制率IR。
如图2所示,为本实验确定的无菌滤液投加体积对铜绿微囊藻的抑制率。假单胞菌的无菌滤液对铜绿微囊藻表现出了一定的抑制作用,抑制率都随着投加的滤液体积的增大而增大,并且随着作用时间的延长而增大,表明假单胞菌能分泌抑制铜绿微囊藻的活性物质。
C、假单胞菌对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响
取50mL步骤K3制备的菌藻混合液,在8000r·min-1下离心10min,弃去上清液,使用蒸馏水洗涤两次后,用95%乙醇定容至5mL,避光,置于4℃下提取24h。再取上清液放入1cm比色杯,以95%乙醇为空白,用分光光度计测定波长665nm和750nm处的吸光值。
根据叶绿素在95%乙醇吸收吸光系数建立相关公式,如下:
Ca=13.95A665–6.88A649
Cb=24.96A649–7.32A665
因铜绿微囊藻不含叶绿素b,所以令Cb=0,反解得:
Ca=11.93(A665–A750)
式中,浓度单位为mg·L-1,Ca、Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度。计算时,以单个细胞内叶绿素a浓度为单位作图,即将每毫升藻液所含叶绿素a浓度除以每毫升藻液所含的藻个数。
利用上述公式计算叶绿素a的含量。
如图5所示,为每日分别取含0mL、5mL、15mL、25mL菌液的菌藻混合液,并测定其中叶绿素a的含量。通过从叶绿素a含量的变化,证明了假单胞菌能够抑制铜绿微囊藻的生长。
图6是假单胞菌对铜绿微囊藻丙二醛含量的影响
D、假单胞菌对铜绿微囊藻丙二醛含量的影响
取50mL步骤K3制备的菌藻混合液,在8000r·min-1离心10min,用pH=7.8的磷酸缓冲溶液清洗藻体两次,离心弃去上清液,取下层藻体;
向藻体中加入2mL 10%质量浓度的三氯乙酸,冰浴下超声破碎;待成匀浆后,再加8mL TCA进一步破碎;然后用冷冻离心机离心,取上清液2mL,加入2mL 0.67%质量浓度的硫代巴比妥酸溶液,混匀后于沸水浴上反应30min,迅速冷却后,再在8000r·min-1下离心10min,取上清液测定在532nm、600nm和450nm波长下的吸光度,计算MDA浓度。
如图6所示,为分别取含0mL、5mL、15mL、25mL菌液的菌藻混合液,并测定其中丙二醛的含量。
E、如图3所示,为铜绿微囊藻(含0mL菌液)在培养48h后的电镜扫描照片;如图4所示,为加入25mL菌液后培养48h的菌藻混合液的电镜扫描照片。利用JEOL(日本电子株式会社)的JSM5610LV型扫描电子显微镜。
从图3可以看出,正常条件下生长的铜绿微囊藻呈球形或椭球形,个体分明,轮廓清晰,表面光滑。经过假单胞菌作用后的铜绿微囊藻细胞形态发生了变化,一部分由原本的椭球形变成了不规则形态,有类细菌颗粒物质粘附其上,推测假单胞菌是能够通过直接攻击藻细胞实现抑藻。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,上述实施例不以任何形式限制本发明,凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种假单胞菌微生物的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将假单胞菌培养基置于恒温振荡箱培养,得假单胞菌液体培养基;
S2、取部分假单胞菌液体培养基,接入EM原液,按假单胞菌的培养条件进行培养,得假单胞菌培养液;
S3、取部分假单胞菌培养液加到新的假单胞菌培养基中培养;
S4、复壮:重复步骤S2-S3,得到假单胞菌的菌液。
2.根据权利要求1所述的一种微生物的培养方法,其特征在于,所述假单胞菌培养基中的配方为乙酸钠0.45g,丙酸钠2.7g,酵母膏0.5g,(NH4)2HPO4 1.2g,H2O 1L。
3.根据权利要求1所述的一种微生物的培养方法,其特征在于,所述恒温振荡箱的转速为130-180r·min-1。
4.根据权利要求1所述的一种微生物的培养方法,其特征在于,所述步骤S2和S3的培养时间为48-96h,步骤S4的重复次数为4-5次。
5.根据权利要求1所述的一种微生物的培养方法,其特征在于,所述步骤S2中,接入的EM原液为假单胞菌液体培养基的体积的1%—10%。
6.根据权利要求1所述的一种微生物的培养方法,其特征在于,所述步骤S3中所取假单胞菌培养液的体积为步骤S2制备的假单胞菌培养液的1%—10%。
7.一种假单胞菌微生物的抑藻应用,其特征在于,包括以下步骤:
K1、取权利要求1-5任一所述的假单胞菌微生物的培养方法,所制得的菌液,离心,得到下层的假单胞菌的菌体;
K2、利用BG-11培养液清洗菌体后,加入BG-11培养液制成假单胞菌悬浊液;
K3、于假单胞菌悬浊液中加入藻液和BG-11培养液,得菌藻混合液。
8.根据权利要求7所述的一种假单胞菌微生物的抑藻应用,其特征在于,所述步骤K2中,清洗液为BG-11培养液,清洗方式包括混匀、离心,清洗次数为2-5次。
9.根据权利要求7所述的一种假单胞菌微生物的抑藻应用,其特征在于,所述步骤K1中菌液的体积为10-50mL;
步骤K2中假单胞菌悬浊液的配制体积为1-5mL;
步骤K3中菌藻混合液的体积为30-60mL。
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