BR112015022454B1 - Método de fermentação em batelada alimentada para a produção de bacterioclorofila a a partir de rhodovulum sulfidophilum - Google Patents
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Abstract
método para a produção de bacterioclorofila a. a presente invenção se refere a um método de fermentação de alimentação por lote para a produção de bacterioclorofila a (bchla) a partir de rhodovulum sulfidophilum, em que o meio de desenvolvimento contém um composto de nitrogênio inorgânico como a fonte d e nitrogênio e durante a fermentação o meio de desenvolvimento é suplementado com uma fonte de carbono succinato, uma fonte de nitrogênio de composto inorgânico e uma fonte de fósforo a partir de reservatórios externos conectados ao recipiente de fermentação, e após a conclusão da fermentação bchla é recuperada a partir das células separadas.
Description
[001] A presente invenção é direcionada em geral a métodos de produzir bacterioclorofilas a partir de micro-organismos e, em particular, a métodos de fermentação aprimorados para a produção de bacterioclorofila A a partir de bactéria púrpura.
[002] Terapia fotodinâmica (PDT) é usada como um tratamento não cirúrgico de tumores. A mesma combina fármacos não tóxicos e iluminação de fotossensibilização não perigosa, ambos os agentes são inócuos por si só, para gerar, na presença de oxigênio molecular, espécies citotóxicas reativas a oxigênio (ROS) in situ que pode exterminar ou inativas as células. Sendo uma modalidade de tratamento binário, PDT permite uma maior especificidade e tem o potencial de ser mais seletivo, mas ainda não menos destrutivo, quando comparado com a quimioterapia ou a radioterapia comumente usados.
[003] Porfirinas têm sido empregadas como a primeira geração de agentes de fotossensibilização em clínicas. Porfimer de sódio (Fotofrin®, uma marca registrada de Axcan Pharma Inc.), o primeiro agente de terapia fotodinâmica aprovado no mundo, que é obtido a partir de hematoporfirina-IX por tratamento com ácidos e recebeu a aprovação da FDA para o tratamento de cânceres esofágico e de pulmão e endobrônquico de célula não pequena, é uma mistura complexa e inseparável de monômeros, dímeros, e oligômeros superiores.
[004] Uma grande quantidade de trabalho foi empregada para a síntese de compostos simples e puros - os assim chamados "segunda geração" de sensibilizadores - que absorvem em comprimento de onda longo, têm estruturas bem estabelecidas e exibem melhor diferenciação entre sua retenção em células de tumor e sua retenção na pele ou outros tecidos normais. De modo a otimizar o desempenho dos fármacos de porfirina em terapêuticos e diagnósticos, diversos derivados de porfirina foram propostos nos quais, por exemplo, há um átomo de metal central (diferente de Mg) complexado para os quatro anéis pirrola, e/ou os substituintes periféricos dos anéis pirrola são modificados e/ou o macrociclo é dihidrogenado aos derivados de clorofila (clorinas) ou tetrahidrogenado para derivados de bacterioclorofila (bacterioclorinas).
[005] Em virtude de sua intensa absorção em regiões de espectro favorável (650 - 850 nm) e sua pronta eliminação após o tratamento, os derivados de clorofila (Chl) e bacterioclorofila (Bchl) foram identificados como excelentes sensibilizadores para PDT de tumores, tendo superiores propriedades em comparação às porfirinas. As bacterioclorofilas são de potencial vantagem comparadas às clorofilas pelo fato de que as mesmas mostram intensas faixas próximas do infravermelho, isto é, em comprimentos de onda consideravelmente mais longos do que os derivados de clorofila.
[006] As bacterioclorofilas são pigmentos fotossintéticos que ocorrem em várias bactérias fototróficas. As mesmas são relacionadas a clorofilas, que são os principais pigmentos nas plantas, algas, e cianobactérias. Bactérias que contêm bacterioclorofila (Bchl) realizam fotossíntese, mas não produzem oxigênio. As mesmas usam comprimentos de onda de luz não absorvida pelas plantas ou cianobactérias. Diferentes grupos de bactéria produzem diferentes tipos de bacterioclorofila:
[007] Quimicamente, as bacterioclorofilas a, b, e g sãobacterioclorinas, o que quer dizer que as suas moléculas têm um anel macrociclo de bacterioclorina com dois anéis pirrola reduzidos (B e D). Bacterioclorofila A (aqui Bchla) é um composto de fórmula:
[008] Bacterioclorofilas c, d e e sãoclorinas, o que quer dizer que as suas moléculas têm um anel macrociclo de clorina com apenas um anel de pirrola reduzido (D).
[009] A bactéria fotossintética púrpura é capaz de derivar a sua energia celular a partir da luz, os compostos orgânicos ou compostos inorgânicos, dependendo do ambiente químico e físico. Essa versatilidade notável em geral quer dizer que um modo de metabolismo é utilizado de cada vez de modo a evitar a biossíntese desnecessária de sistemas de energia alternativos. Assim, o metabolismo fotossintético e assim a biossíntese de pigmento apenas ocorre sob um conjunto limitado de condições.
[010] Em relação a sua capacidade de produzir bacterioclorofila parece haver dois grupos principais dentro da bactéria púrpura. O primeiro grupo inclui Rhodobacter (Rba.) spheroidedes, Rba. Capsulatus e Rhodospirilum rubrum, que fotosintetiza e assim produz bacterioclorofila de modo anaeróbico na luz; os mesmos podem também sintetizar significantes quantidades de pigmento no escuro, mas apenas sob baixas condições de aeração. Isso indica um controle dependente de oxigênio e de luz sobre os genes que codificam as enzimas envolvidas na síntese dos referidos pigmentos. O segundo grupo, que inclui Rhodovulum sulfidophilum, sp. e Rubrivivax (Rvi.) gelatinosus, é capaz de sintetizar pigmentos no escuro e de fotosintetizar sob ambas as condições anaeróbica e aeróbica.
[011] A biossíntese de Bchla na bactéria aeróbica facultativa Rhodovulum sulfidophilum, antigamente conhecida como Rhodobacter sulfidophilus, foi descrita por Porra et al., 1998 (Porra, RJ, M. Urzinger, J. Winkler, C. Bubenzer, e H. Scheer, Eur. J. Biochem. 257, 185-191).
[012] Bchla obtida a partir de Rhodovulum sulfidophilum serviu como a base para a derivação adicional e modificação para produzir aprimorados derivados de Bchla empregados em PDT e PDT de alvo vascular (VTP) de tumores e outras condições patológicas como descrito, por exemplo, em US 6,147,195, EP 863903, US 6,333,319, US 6,569,846, WO 2004/045492 e US 8,207,154.
[013] O uso de derivados de Bchla para pesquisas de PDT e PDT está aumentando; portanto, há uma crescente necessidade de se produzir quantidades maiores de Bchla por fermentação.
[014] A presente invenção proporciona um método de fermentação para a produção de bacterioclorofila A (Bchla) a partir da fotossensibilização de bactéria púrpura Rhodovulum sulfidophilum, que compreende as etapas de desenvolver a bactéria em um biorreator e extrair a Bchla produzida a partir da bactéria coletada.
[015] Em particular, a presente invenção se refere a método de fermentação em batelada alimentada para a produção de bacterioclorofila A (Bchla) a partir de Rhodovulum sulfidophilum, o referido método compreendendo: (i) cultivar Rhodovulum sulfidophilum em um recipiente de fermentação em um meio de cultivo que contém um composto de nitrogênio inorgânico como a fonte de nitrogênio, uma fonte de carbono, uma fonte de fósforo, uma fonte de ferro, uma fonte de magnésio, extrato de levedura e NaCl; (ii) submeter a cultura a uma fermentação em batelada alimentada ao mesmo tempo em que se alimenta ao meio uma fonte de carbono succinato, uma fonte de nitrogênio de composto inorgânico e uma fonte de fósforo a partir de reservatórios externos conectados ao recipiente de fermentação e manter o nível de oxigênio em ou abaixo de 10%; (iii) remover as células a partir do meio; e (iv) separar e recuperar Bchla a partir das células a partir da etapa (iii).
[016] Em métodos descritos na literatura, Bchla foi obtida a partir de bactéria desenvolvida em um meio que contém uma fonte de nitrogênio orgânico tal como peptona, polipeptona ou uma mistura de amino ácidos e pequenos peptídeos obtidos pela hidrólise ácida de caseína conhecido como casamino ácidos (Shioi, Yuzo, Plant Cell Phisiol. 27(3): 567-572, 1986; Porra et al., Eur. J. Biochem. 257, 185-191, 1998).
[017] Foi agora observado que, de acordo com a presente invenção, que determinadas modificações do processo de fermentação para desenvolver a bactéria púrpura Rhodovulum sulfidophilum resulou em um aumento de 12 vezes de aprimoramento de Bchla de rendimento volumétrico e substancialmente custos de produção reduzidos.
[018] Assim, em um aspecto principal, a presente invenção proporciona um método de fermentação para a produção de Bchla a partir de Rhodovulum sulfidophilum cultivada em quantidades significantemente que excedem as quantidades produzidas usando os processos conhecidos de fermentação.
[019] Como usado aqui, os termos "fermentador", "recipiente de fermentação"e "biorreator"são usados de modo intercambiável para denotar o recipiente no qual o cultivo e a fermentação de Rhodovulum sulfidophilum ocorre de acordo com a presente invenção.
[020] Como usado aqui, os termos "meio de cultivo" e "meio de fermentação" são usados de modo intercambiável para denotar o meio no qual a bactéria Rhodovulum sulfidophilumsão desenvolvidas dentro do fermentador.
[021] O método da presente invenção envolve aprimoramentos não só no meio de cultivo bacteriano mas também no processo de fermentação.
[022] O aprimoramento relacionado ao meio de cultivo de acordo com a presente invenção consiste na substituição da fonte de nitrogênio peptona antieconômica, derivada de animal com uma fonte de nitrogênio inorgânico.
[023] O aprimoramento do método de fermentação de acordo com a presente invenção compreende o fornecimento contínuo ao biorreator de nutrientes frescos a partir de reservatórios externos que contêm fontes de soluções de alimentação de nitrogênio, carbono e fósforo ao mesmo tempo em que se monitora on-line os níveis dos nutrientes essenciais no meio de fermentação e fornecimento dos mesmos conforme necessário. De acordo com a referida técnica, conhecida como "fermentação em batelada alimentada”, os nutrientes são continuamente fornecidos à bactéria em cultivo no biorreator em quantidades e taxas de administração que dependem da taxa em que os referidos nutrientes são consumidos no biorreator pela bactéria durante o processo de fermentação.
[024] Embora fontes de nitrogênio inorgânico sejam algumas vezes usadas em meio de cultivo de bactéria, os inventores observaram inesperadamente que ao se usar cloreto de amônio como a única fonte de nitrogênio e o método de fermentação em batelada alimentada da presente invenção produziu 350% de aumento em peso de célula seca por litro e 335% de aumento na concentração de Bchla nas células, ou seja, 600 mg de Bchla por litro - quase 12 vezes mais do que nos processos comerciais conhecidos. Ademais, levou a uma redução de cerca de 15% do custo do meio comumente usado para desenvolver Rhodovulum sulfidophilum.
[025] Assim, a presente invenção se refere a um método de fermentação em batelada alimentada para a produção de bacterioclorofila A (Bchla) a partir de Rhodovulum sulfidophilum, o referido método compreendendo: (v) cultivar Rhodovulum sulfidophilum em um recipiente de fermentação em um meio de cultivo que contém um composto de nitrogênio inorgânico como uma fonte de nitrogênio, uma fonte de carbono, uma fonte de fósforo, uma fonte de ferro, uma fonte de magnésio, extrato de levedura e NaCl; (vi) submeter a cultura à fermentação em batelada alimentada ao mesmo tempo em que se alimenta o meio a fonte de carbono succinato, uma fonte de nitrogênio de composto inorgânico e uma fonte de fósforo a partir de reservatórios externos conectados ao recipiente de fermentação e manter o nível de oxigênio em ou abaixo de 10%; (vii) remover as células a partir do meio; e (viii) separar e recuperar Bchla a partir das células a partir da etapa (iii).
[026] O composto de nitrogênio inorgânico no meio de cultivo pode ser qualquer um dos compostos de nitrogênio inorgânicos usados em meio de cultivo de bactéria tal como, mas não limitado a, cloreto de amônio, sulfato de amônia, nitrato de amônia, fosfato de dihidrogênio de amônia, fosfato de hidrogênio de amônia, nitrato de potássio, e nitrato de sódio, ou qualquer combinação dos mesmos. Em determinadas modalidades, o composto de nitrogênio inorgânico preferido é cloreto de amônio (NH4Cl). A fonte de nitrogênio inorgânico é também fornecida à bactéria em cultivo por suplementar o meio de fermentação durante a fermentação em batelada alimentada como necessário.
[027] A fonte de carbono no meio de cultivo pode ser, por exemplo, mono- ou dissacarídeos, sacarose, ácidos dicarboxílicos tais como ácido málico, ácido succinico e succinato de sódio, glicerol, ácido cítrico, ou qualquer combinação dos mesmos. Além disso, a fonte de carbono que compreende ácido succínico e succinato de sódio é fornecida à bactéria em cultivo por suplementar o meio de fermentação durante a fermentação em batelada alimentada como necessário.
[028] A fonte de fósforo no meio de cultivo pode compreender um ou mais sais solúveis em água de fosfato de hidrogênio e fosfato de dihidrogênio tal como os fosfatos de sódio, potássio, e de amônia, assim como pirofosfato. Em determinadas modalidades, a fonte de fósforo compreende uma mistura de sais de fosfato K2HPO4*3H2O e KH2PO4. Adicionalmente, a fonte de fósforo que compreende os referidos dois sais de fosfato é fornecida à bactéria em cultivo por suplementar o meio de fermentação durante a fermentação em batelada alimentada como necessário.
[029] A fonte de ferro no meio de fermentação pode ser um ou mais sais férricos ou ferrosos solúveis em água tal como citrato férrico de amônia, cloreto ferroso, acetato ferroso e sulfato ferroso. Em determinadas modalidades, a fonte de ferro é citrato férrico de amônia (FeNH4 citrato).
[030] A fonte de magnésio no meio de fermentação pode ser um ou mais sais de magnésio solúveis em água tais como cloreto de magnésio, gliconato de magnésio, nitrato de magnésio, sulfato de magnésio, citrato de magnésio, acetato de magnésio ou succinato de magnésio. Em determinadas modalidades, a fonte de magnésio é sulfato de magnésio (MgSO4*7H2O).
[031] O meio de fermentação de Rhodovulum sulfidophilum pode compreender, de acordo com a presente invenção, uma fonte de carbono na quantidade de 30-45 g/L, a fonte de fósforo na quantidade de 0,4-0,7 g/L, a fonte de nitrogênio na quantidade 1,5-3,0 g/L, extrato de levedura na quantidade de 1,5-2,5 g/L, uma fonte de ferro na quantidade de 0,5-1,0 g/L, uma fonte de magnésio na quantidade de 0,15-0,3 g/L, NaCl na quantidade de 10-30 g/L e elementos de traços.
[032] Em determinadas modalidades, o meio de fermentação compreende uma mistura dos ingredientes a seguir: ácido cítrico, CaCl2*2H20, MgSO4*7H20, FeNH4 citrato, ácido succínico, disuccinato de sódio*6H2O, Na2SO4, K2CO3, extrato de levedura, NH4Cl, KH2PO4, K2HPO4*3H2O, NaCl, NaOH, KOH, agene antiespumante e elementos traços. Os elementos traços podem ser CoCl2*6H2O, NiCl2*6H2O, CuCl2*2H2O, MnCl2*4H2O, ZnSO4*7H2O, Na2MoO4*2H2O, H3BO3 e KI, e o agente antiespumante pode ser qualquer agente antiespumante usado nos métodos de fermentação tal como Y-30 ou Biospumex.
[033] Em determinadas modalidades, o meio de fermentação compreende as quantidades a seguir dos ingredientes a seguir: 30,0 - 40,0 g/L de ácido succínico; 2,0 - 4,0 g/L de Na2SO4; 0,5 - 1,0 g/L de CaCl2; 0,2 - 0,5 g/L de K2CO3; 0,5 - 1,0 g/L de citrato férrico de amônia; 1,5 - 2,5 g/L de extrato de levedura; 3,0 - 6,0 g/L de ácido cítrico; 0,15 - 0,3 g/L de MgSO4; 10 - 30 g/L de NaCl; 1,5 - 3,0 g/L de NH4Cl; 0,2 - 0,4 g/L de KH2PO4; e 2,0 - 3,0 g/L de K2HPO4.
[034] Durante o método de fermentação em batelada alimentada, soluções de carbono, nitrogênio e fontes de fósforo, algumas vezes referidas aqui também como "material de alimentação", são dispostos cada um em um reservatório externo conectado ao recipiente de fermentação. A fonte de carbono, aqui referida como "fonte de carbono succinato", é uma solução aquosa de ácido succínico e disuccinato de sódio; a fonte de nitrogênio de composto inorgânico é preferivelmente uma solução aquosa de NH4Cl; e a fonte de fósforo é uma solução aquosa de KH2PO4 e K2HPO4*3H2O.
[035] Os níveis de carbono são monitorados através de um processo de fermentação, e sempre que o nível do ácido succínico no meio alcança determinados níveis limiares, por exemplo 1-2 g/L, o ácido succínico é adicionado (bombeado a partir de) para o fermentador a partir do reservatório externo.
[036] Os níveis de fosforo são monitorados através de um processo de fermentação, e uma fonte de fósforo fresca é adicionada como necessário. Em determinadas modalidades, uma solução de fosfato fresca é bombeada a partir do reservatório externo para o fermentador logo 16 horas após a fermentação ter iniciado e então adicionalmente adicionado a cada período de 24 horas.
[037] Os níveis de amônia são monitorados através de um processo de fermentação, e uma fonte de nitrogênio fresco é adicionado como necessário. Em determinadas modalidades, uma solução de amônia fresca (NH4Cl 5 N) é bombeada a partir do reservatório externo para o fermentador logo 16 horas após a fermentação ter iniciado e então adicionalmente adicionado a cada período de 12 horas.
[038] O volume de materiais de alimentação deve minimizar o máximo possível de modo que a solução de succinato pode ser adicionada na extensão do curso da fermentação, como necessário. No início da fermentação, uma vez que o pH sobe para 8,6, ácido sulfúrico é usado para manter o pH = 7. Durante a fermentação, uma solução de NaOH é adicionada para manter o pH = 7. Durante esse período, a quantidade de ácido succínico é checada, e quando chega a uma quantidade de 1-2 g/L, ácido succínico deve ser adicionado a partir do reservatório externo (em vez de ácido sulfúrico).
[039] O meio de fermentação no fermentador é preparado como a seguir: formar no recipiente de fermentação um meio de fermentação inicial ao se preparar a solução (daqui em diante "Solução 4") ao se adicionar a uma solução aquosa de ácido cítrico, CaCl2*2H20, MgSO4*7H20 e FeNH4 citrato (daqui em diante "Solução 1") uma solução aquosa de ácido succínico, Na2SO4, K2CO3 e extrato de levedura (daqui em diante "Solução 2"), seguido pela adição de NaCl, mistura, e adição de uma solução de NH4Cl (daqui em diante "Solução 3"), e ajustar o pH a 5 usando 10 N de NaOH, seguido de se adicionar à Solução 4 uma solução aquosa de um agente antiespumante, fechar o fermentador e esterilizar por autoclavagem (121°C, 20 min), e adicionalmente adicionar ao meio estéril uma solução aquosa dos elementos de traços CoCl2*6H2O, NiCl2*6H2O, CuCl2*2H2O, MnCl2*4H2O, ZnSO4*7H2O, Na2MoO4*2H2O, H3BO3 e KI, seguido pela adição de uma solução aquosa dos sais de fosfato KH2PO4, K2HPO4*3H2O. Um inóculo de Rhodovulum sulfidophilumé adicionado ao referido meio de fermentação inicial no fermentador e, durante a fermentação, quantidades frescas de uma fonte de carbono succinato, de cloreto de amônio, fonte de nitrogênio e de uma fonte de fosfato são adicionados ao meio de fermentação como necessário.
[040] A temperatura no fermentador antes de adicionar o inóculo de Rhodovulum sulfidophilum deve ser de cerca de 28°C e o pH = 7 (ajustado com NaOH e solução de succinato como necessário).
[041] Durante a fermentação, uma boa agitação e aeração devem ser mantidas, e a temperatura, o pH, o nível de oxigênio e o fornecimento de nitrogênio, carbono e fósforo deve ser monitorado. A temperatura deve ser mantida a um mínimo de 25°C e um mínimo de 31°C e os limites de controle de pH são 6,8 e 7,3.
[042] É muito importante se manter o oxigênio em ou abaixo de 10% após cerca de 10-20 horas de fermentação. Uma alta concentração de oxigênio acelera o cultivo da bactéria, mas as mesmas não produzem bacterioclorofila A, enquanto a concentração de 10% de oxigênio acelera a produção de bacterioclorofila A.
[043] A fermentação é continuada até que o volume do meio de fermentação no recipiente aumenta para cerca de sua capacidade total.
[044] Uma vez que a fermentação está concluída, o caldo é centrifugado, o sobrenadante é descartado, as células são liofilizadas e Bchla é extraída a partir de das células secas. A Bchla pode ser purificada e usada par derivação química em derivados de bacterioclorofila de interesse.
[045] A presente invenção será agora ilustrada pelos exemplos não limitantes a seguir.
[046] Rhodovulum sulfidophilum (DSM Strain 1374) foi obtida a partir de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, Germany.
[047] O fermentador BioFlo IV 20L foi a partir de New Brunswick Scientific (USA).
[048] Ácido succínico, disuccinato de sódio*6H2O, NH4Cl, FeNH4 citrato/ácido cítrico, K2HPO4, MgCl2 CoCl2*6H2O, NiCl2*6H2O, CuCl2*2H2O, MnCl2*4H2O, ZnSO4*7H2O e KI foram adquiridos a partir de Acros Organics (Geel, Belgium); KH2PO4, Na2SO4, KCl, CaCl2*2H2O, K2CO3, NaHCO3 MgSO4*7H2O e NaCl foram adquiridos a partir de Fisher (Fisher Scientific, Loughborough, UK); peptona de caseína e hidrolisado de caseína foram adquiridos a partir de Difco (Lawrence, KS, USA); extrato de levedura foi adquirido da Difco e Bio Springer (Montreal, Quebec, Canada); NH4Cl foi adquirido da Fluka (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel); KH2PO4 foi adquirido da Merck (Merck KGaA, Darmstadt Germany); KOH, H3BO3, antiespumante Y-30 e Na2MoO4*2H2O foram adquiridos da Sigma (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel).
[049] Bactérias Rhodovulum sulfidophilum (cepa DSM 1374) foram cultivadas em placas de Petri pré-revestidas com um substrato de cultivo que contém ágar misturado com meio aquoso preparado a partir dos ingredientes a seguir: ácido succínico (9 g). Na2SO4 (3g), KCl (750 mg), CaCl2 (750 mg), NaHCO3 (300 mg), FeNH4 citrato (150 mg), Extrato de levedura (3 g), Peptona de caseína (1,5 g), Hidrolisado de caseína (1,5 g), MgCl2 (7,5 g), NaCl (30 g), água desionizada (1500 mL).
[050] O pH do meio foi ajustado a 7 usando NaOH 10 N e HCl 1 M. Ágar foi adicionado ao meio (7,5 g ágar por 500 mL de meio) para se obter o substrato de cultivo. Placas de Petri revestidas com o substrato de cultivo foram esterilizados por autoclavagem (121°C, 30 min) e as bactérias foram semeados nos mesmos.
[051] Após incubação a 300°C por três dias, um inóculo da bactéria é transferido a um frasco de 250 mL de Erlenmeyer e desenvolvida em meio de inoculação no qual a fonte de nitrogênio orgânico peptona de caseína (usada para o cultivo de bactéria em placas de Petri) foi substituído com a fonte inorgânica de cloreto de amônio. As bactérias foram desenvolvidas até que a densidade ótica (OD 540 nm) da cultura alcançou um valor acima de 10. Alíquotas de oito mL da fonte de inóculo foram transferidas a tubos de congelamento criogênico estéreis de 15 mL, 2 mL de 50% de solução de glicerol estéril foram adicionados e os tubos foram armazenados a -800°C até o uso.
[052] As soluções a seguir foram preparadas:
[053] Solução 1. Os ingredientes a seguir foram adicionados na ordem abaixo e dissolvidos em 4.5 L de água desionizada no recipiente de fermentação:
[054] Solução 2. Os ingredientes a seguir foram adicionados na ordem abaixo e dissolvidos em 400 mL de água morna e água desionizada foi adicionada até completar 0,5 L:
[055] Solução 3. Cloreto de amônio 5N - NH4Cl (cerca de 268 g) foi dissolvido em 900 mL de água e o volume completado a 1L. Uma amostra de 80 mL foi transferida a um frasco de 100 mL para a adição ao fermentador como a Solução 3 e o restante foi transferido para um frasco de 1 L marcado como Solução 3 para uso como a reserva de fonte de nitrogênio durante a fermentação. Ambos os frascos foram esterilizados em uma autoclave (12K, 20 min).
[056] Solução 4 foi formada no fermentador ao se adicionar 450 ml de Solução 2 a 4,5 L Solução 1 já no recipiente de fermentação, seguido pela adição de 170 g NaCl e mistura, e então adição de 80 mL de Solução 3 (NH4Cl 5 N, 1 g NH4+ em meio litro). O pH foi ajustado a 5 usando 10 N NaOH.
[057] Solução 5, a solução de elementos de traços (TES), conteve os ingredientes a seguir: CoCl2*6H2O (cerca de 50 mg), NiCl2*6H2O (cerca de 50 mg), CuCl2*2H2O (cerca de 100 mg), MnCl2*4H2O (cerca de 150 mg), ZnSO4*7H2O (cerca de 200 mg), H3BO3 (cerca de 1000 mg), Na2MoO4*2H2O) (cerca de 50 mg), e KI (cerca de 500 mg) em 0,5 L água. Alíquotas de 35 mL solução 5 foram transferidas a frascos de 100 mL e esterilizadas por autoclavagem (121OC, 20 min).
[058] Solução 6, a solução de sais de fosfato, foi preparada ao se dissolver 30 g KH2PO4 e 5 g K2HPO4 em 250 mL de água desionizada. O pH foi ajustado a 7 usando uma solução de 10 N KOH. Uma alíquota de 55 mL foi transferida a um frasco de 100 mL e marcada como a solução 6 para adição ao fermentador. O restante foi transferido a um frasco de 500 mL e marcado como a solução 6 para uso como uma reserva de fonte de fósforo durante a fermentação. Ambos os frascos foram esterilizados em uma autoclave (12K, 20 min).
[059] Solução 7, a solução antiespumante, foi preparada ao se adicionar cerca de 25 mg de antiespumante Y-30 com base em silicone à água desionizada ao volume final de 250 mL, seguido por esterilização em uma autoclave (121OC, 20 min), ou adicionar o antiespumante Biospumex de modo que a sua concentração no meio de fermentação básico varia a partir de 0,2 a 0,5 mL/L. Em geral, a quantidade de antiespumante introduzido para o fermentador é ditada por uma quantidade de espuma formada no meio.
[060] Solução 8, a solução de succinato serve como a fonte de carbono assim como o adaptador de pH, foi preparado por dissolver 250 g de disuccinato de sódio em 4 L de água desionizada, adicionando 450 g de ácido succínico, aquecer para dissolver a mesma e então adicionar água desionizada a um volume final de 5 L, seguido por esterilização da solução por autoclavagem (121OC, 20 min).
[061] Solução 9, NaOH 10 N, foi preparado ao dispor 250 mL de água desionizada em um frasco de 500 mL, esterilizar por autoclavagem (121OC, 20 min), adicionar 100 g NaOH ao frasco e mistura resfriados.
[062] O eletrodo de pH foi calibrado e conectado ao recipiente de fermentação. O eletrodo de DO (oxigênio dissolvido) foi conectado ao recipiente. Dois mL de antiespumante foram adicionados à Solução 4 a pH 5 no recipiente de fermentação logo antes do seu fechamento, e a esterilização foi ajustada a um ciclo de 25 minutos.
[063] O meio de fermentação inicial conteve os ingredientes a seguir:
[064] O referido meio foi preparado em diversas etapas, em que um meio de fermentação inicial foi primeiro preparado no biorreator e os outros ingredientes foram adicionados com o início de um processo de fermentação a partir de soluções de alimentação em reservatórios externos conectados ao biorreator, e então continuamente durante a fermentação, subsequente ao monitoramento em linha os níveis de nutriente no meio de cultivo. A solução de alimentação de fosforo conteve KH2PO4 (12,0-14,5 g/L) e K2HPO4 (1.0-3,0 g/L), a solução de alimentação de carbono conteve ácido succínico (80,0-100,0 g/L) e disuccinato de sódio (40,0-60,0 g/L), e a solução de alimentação de nitrogênio conteve 200-300 g/L de NH4Cl. O pH de todas as soluções acima foi ajustado a 7,0.
[065] Para iniciar a fermentação, 35 mL de solução TES estéril (solução 5) foi adicionado para o fermentador que já contém a solução 4 esterilizada. Então, 55 mL de solução de fosfato estéril (solução 6) foi adicionado sob agitação (500 rpm) e aeração a 1 VVM (8 litros/min) e a temperatura no fermentador foi estabelecida a 28OC.
[066] A solução de alimentação de carbono (solução de succinato 8) foi conectada às bombas de alimentação, seguido por conectar solução 7 (solução de antiespumante) às bombas de alimentação. O pH do meio de cultivo foi ajustado a pH 7 com solução de NaOH 10 N estéril (solução 9) e solução de succinato estéril como necessário. O eletrodo de DO (oxigênio dissolvido) foi calibrado.
[067] O inóculo de bactéria foi adicionado ao fermentador usando a bomba de alimentação. A concentração das células foi 2,3-3,2 OD/L. Finalmente, a solução de fosfato (solução 6) e a solução de cloreto de amônio (solução 3) foram conectadas às bombas de alimentação.
[068] Durante a fermentação em batelada alimentada a temperatura foi mantida dentro de um mínimo de 25°C e máximo de 31OC e o nível de oxigênio foi mantido em ou abaixo de 10%. O pH foi controlado entre mínimo 6,8 e máximo 7,3. A solução de succinato foi adicionada sempre que o pH aumentou acima de 7,1. NaOH 10 N (solução 9) foi adicionado sempre que o pH desceu abaixo de 6,8.
[069] Após 16 horas de fermentação, o fornecimento de nitrogênio e o fornecimento de fosforo ao meio de cultivo foram renovados por bombeamento de 80 mL de solução 3 (NH4Cl 5 N) por meio de uma bomba peristáltica (velocidade da bomba 1 mL/min) e 20 mL de solução 6 (solução de fosfato) dentro do fermentador. Então, 90 mL de NH4Cl foram adicionados a cada período de 12 horas, e 20 mL de fosfato foram adicionados (bombeado em) a cada período de 24 horas. Os níveis de amônia e de fósforo foram monitorados durante a fermentação e a adição de soluções 3 e 6 dependeu dos resultados da análise do referido monitoramento.
[070] O fornecimento de carbono foi renovado pela adição de ácido succínico (solução 8) sempre que o nível de ácido succínico no meio de cultivo reduziu a 1-2 g/L. O nível de oxigênio foi mantido a ou abaixo de 10% após cerca de 10-20 horas de fermentação. O referido nível de oxigênio acelera a produção de bacterioclorofila.
[071] O volume inicial do meio de cultivo foi cerca de metade do volume do biorreator. A fermentação continuou por cerca de 120 horas, e o volume aumentou a cerca da capacidade total do biorreator.
[072] Após a conclusão da fermentação, as bactérias foram removidas por centrifugação a 4500 rpm por 15 minutos, e o sobrenadante da cultura foi descartado. As células imersas foram liofilizadas. Bchla foi extraída a partir das (liofilizadas) células secas usando metanol. O rendimento de Bchla foi 0,15 - 0,3 gr/litro.
Claims (7)
1. Método de fermentação em batelada alimentada para a produção de bacterioclorofila A (Bchla) a partir de Rhodovulum sulfidophilum, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) cultivar células de Rhodovulum sulfidophilum em um recipiente de fermentação em um meio de cultivo contendo ácido cítrico, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, FeNH4 citrato, ácido succínico, succinato dissódico.6H2O, Na2SO4, K2CO3, extrato de levedura, NH4Cl, KH2PO4, K2HPO4.3H2O, NaCl, NaOH, KOH, um agente antiespumante e elementos traços; (ii) submeter a cultura a uma fermentação em batelada alimentada enquanto alimenta o meio com uma fonte de carbono de succinato, uma fonte de nitrogênio de cloreto de amônio e uma fonte de fósforo a partir de reservatórios externos conectados ao recipiente de fermentação e manter o nível de oxigênio igual ou inferior a 10%; (iii) remover as células a partir do meio; e (iv) separar e recuperar Bchla a partir das células da etapa (iii).
2. Método de fermentação em batelada alimentada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (ii) a referida fonte de carbono de succinato é uma solução aquosa de ácido succínico e succinato dissódico; a referida fonte de nitrogênio de composto inorgânico é uma solução aquosa de NH4Cl; e a referida fonte de fósforo é uma solução aquosa de KH2PO4 e K2HPO4.3H2O.
3. Método de fermentação em batelada alimentada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultivo é preparado da seguinte forma: (a) formar no recipiente de fermentação um meio de fermentação inicial através da preparação de uma solução de cultivo pela adição de uma solução aquosa de ácido cítrico, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O e FeNH4 citrato uma solução aquosa de ácido succínico, Na2SO4, K2CO3 e extrato de levedura, seguido pela adição de NaCl, misturar, e adicionar uma solução de NH4Cl, e ajustar o pH a 5 usando NaOH 10N, seguido pela adição à solução de cultivo de uma solução aquosa de um agente antiespumante, fechar o fermentador e esterilizar por autoclavação, e ainda adicionar ao meio estéril uma solução aquosa de elementos traços CoCl2.6H2O, NiCl2.6H2O, CuCl2.2H2O, MnCl2.4H2O, ZnSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, H3BO3 e KI, seguido pela adição de uma solução aquosa dos sais de fosfato KH2PO4 , K2HPO4.3H2O; (b) após adição de um inóculo de Rhodovulum sulfidophilum ao meio de fermentação inicial de (a), adicionar durante a fermentação quantidades frescas de uma fonte de carbono de succinato, da fonte de nitrogênio de cloreto de amônio e da fonte de fosfato ao meio de fermentação conforme necessário.
4. Método de fermentação em batelada alimentada de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas: (i) formar a solução de cultivo no recipiente de fermentação, e ajustar o pH a 5 usando NaOH; (ii) calibrar o eletrodo de pH e conectar ao recipiente de fermentação o eletrodo de pH e o eletrodo de DO; (iii) adicionar à solução de cultivo uma solução aquosa de um agente antiespumante; (iv) fechar o fermentador e esterilizar o meio por autoclavação; (v) adicionar ao meio estéril uma solução aquosa de elementos traços CoCl2.6H2O, NiCl2.6H2O, CuCl2.2H2O, MnCl2.4H2O, ZnSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, H3BO3 e KI, seguido pela adição de uma solução aquosa dos sais de fosfato KH2PO4 e K2HPO4.3H2O; (vi) sob agitação e aeração conectar a solução de succinato e a solução de antiespumante às bombas de alimentação; (vii) estabelecer uma temperatura de 28°C no fermentador e ajustar o pH a 7 com NaOH e solução de succinato conforme necessário; (viii) adicionar um inóculo de Rhodovulum sulfidophilum ao fermentador; (ix) conectar a solução aquosa dos sais de fosfato KH2PO4 e K2HPO4.3H2O e a solução de cloreto de amônio às bombas de alimentação; (x) proceder a fermentação enquanto se monitora a temperatura, o pH, o nível de oxigênio e o fornecimento de nitrogênio, carbono e fósforo; e (xi) continuar a fermentação até que o volume do meio de fermentação no recipiente aumente para cerca de sua capacidade total.
5. Método de fermentação em batelada alimentada de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que na etapa (x) a temperatura é mantida a um mínimo de 25°C e um máximo de 31°C; os limites de controle de pH são 6,8 e 7,3; o nível de oxigênio é 10% ou menos após 10-20 horas de fermentação; e fonte de carbono de succinato, soluções de fonte de cloreto de amônio e de fosfato são adicionadas a partir dos reservatórios externos conforme necessário dependendo dos resultados da análise do meio.
6. Método de fermentação em batelada alimentada de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a solução de cloreto de amônio é bombeada após 16 horas de fermentação e então a cada 12 horas, e a solução de fosfato é bombeada após 16 horas de fermentação e então a cada 24 horas.
7. Método de fermentação em batelada alimentada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os elementos traços são selecionados a partir do grupo que consiste em CoCl2.6H2O, NiCl2.6H2O, CuCl2.2H2O, MnCl2.4H2O, ZnSO4.7H2O, Na2MoO4.2H2O, H3BO3, KI e combinações dos mesmos.
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