CN110408609A - 一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物诱变育种技术领域，尤其是一种高产β‑法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法。该方法步骤包括：菌悬液的制备、等离子体‑紫外线复合诱变、平板初筛、摇瓶复筛和发酵罐验证。本发明的种高产β‑法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，通过等离子体‑紫外复合诱变后，再采用平板初筛和摇瓶复筛，最终选育出了的β‑法尼烯高产突变菌株在发酵罐中β‑法尼烯的发酵单位比出发菌株提高了169.10％，并且通过8次连续传代仍具有良好的遗传稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物诱变育种技术领域，尤其是一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法。
背景技术
β-法尼烯(β-Farnesene，又称β-金合欢烯)是一种由三个异戊二烯组成的链状倍半萜烯化合物，在日化、农业、化工、能源和医药等领域有着广泛应用。尤其在医药领域，β-法尼烯是合成维生素E的前体物质异植物醇的重要原料。维生素E是全球市场容量最大的维生素类产品之一，每年全球约生产6万吨，维生素E前体异植物醇的原料供应一直被德国巴斯夫和荷兰帝斯曼所垄断，他们以柠檬醛作为中间体合成异植物醇，进而采用全化学合成工艺将三甲基氢醌和异植物醇进行环合反应生成维生素E。但全化学合成技术具有污染大，成本高的问题，人们一直试图寻找一种更节能环保的方法来生产维生素E，而采用微生物法合成β-法尼烯，能够使得维生素E的生产过程具有高转化率、低成本、低能耗等优势，在很大程度上降低了维生素E的生产成本具有，并且生产过程也更加绿色环保，可减少碳排放60％，因此高产β-法尼烯菌种的选育是企业降低发酵成本、提高产品市场竞争力的有效手段之一。
传统菌种选育方法有化学诱变剂(烷化剂、碱基类似物及亚硝酸等)和物理诱变(紫外线、X射线及快中子等)。其中，紫外诱变是最常用的人工诱变方法之一，其光谱范围在40-390nm。DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，当其吸收紫外光后形成嘧啶二聚体，从而阻碍碱基间的正常配对和DNA的复制，最终导致微生物的突变或死亡。然而，长期重复使用传统的诱变手段，往往导致突变效率低、突变谱窄和抗性饱和等难题。而常压室温等离子体(ARTP)诱变技术是近年发展起来的新诱变技术，具有操作便捷、突变率高、安全性好等优点，广泛应用于工业微生物诱变育种领域。此方法以氦气为工作气体的离子体源中富含多种活性能量粒子，这些活性粒子能够对微生物的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制。SOS修复过程为一种高容错率修复，因此修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，克服前述现有技术的不足，以产β-法尼烯的大肠杆菌EC-16为出发菌株，通过采用常压室温等离子体(ARTP)诱变和紫外线诱变的复合诱变技术，并利用β-法尼烯代谢合成途径中的前体物质异戊烯焦磷酸(IPP)作为筛选压力进一步提高突变株正突变率，进行组合诱变筛选，最终获得遗传性状稳定的β-法尼烯高产突变株。
本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，包括如下步骤：
(1)菌悬液的制备：选取恒温培养箱内37℃下培养2天的EC-16斜面菌苔，用10mL无菌生理盐水将菌苔洗下，放入盛有玻璃珠的无菌锥形瓶中，无菌锥形瓶置于震荡装置中，在30℃、220-300r/min的条件下震荡5-15min，使菌体分散，菌体分散后于2500-5000r/min条件下离心10-20min，弃上清液，将菌体用生理盐水悬浮并洗涤2-3次，采用细菌计数板计数，调整菌悬液浓度约为106-109个/mL，备用；
(2)等离子体-紫外线复合诱变：在超净工作台中取3mL步骤(1)制得的菌悬液加入到直径60mm带有磁力搅拌转子的无菌平皿中，在搅拌状态下用紫外灯照射20-120s，紫外灯功率为18W，灯距为30cm，紫外线诱变结束后，立即用移液枪移取20μL诱变后的菌悬液，涂布在无菌不锈钢载片上，并按照ARTP-M型诱变育种仪的操作流程进行处理，以氮气为工作气体，设定功率为120W，处理温度为室温，通气量为10SLPM，等离子体发射源与样品间的距离为5-20mm，处理时间设置为20-70s；
(3)平板初筛：将经过等离子体-紫外复合诱变处理的菌悬液用无菌的生理盐水稀释至10-6-10-8稀释度，然后涂布于含0.3-2.0g/L的异戊烯焦磷酸的分离筛选培养基上，置于37℃，避光培养1-2天，挑取平板上最先生长出的大肠杆菌单菌落接种于斜面培养基上，置于37℃，培养1-2天；
(4)摇瓶复筛：用接种铲刮取平板筛选出的EC-16的斜面菌苔1-2cm2接种于种子培养基中，37℃、220-300r/min条件下培养12-20h，取5mL培养菌液接种于100mL的发酵培养基中，37℃、220-300r/min条件下震荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷，随后加入正十二烷作为β-法尼烯的萃取剂，萃取剂的用量达到体积分数为10-35％(v/v)，设定培养温度为30℃，发酵72-96h，测定β-法尼烯的含量，然后挑选出发酵产物含量最高的突变株进行发酵罐验证；
(5)发酵罐验证：选取生长最好的斜面，用接种铲刮取1-2cm2的菌苔接种于种子培养基中，37℃、220-300r/min条件下培养12-20h，然后按照5-10％的接种量接种于15L发酵罐中，设置发酵工艺参数分别为：发酵温度20-30℃，初始转速220-300r/min，根据溶氧变化逐步调整至450-600r/min，通气量1:1VVM，发酵72-96h，最后测定β-法尼烯的含量，挑选出发酵产物含量最高的突变株。
优选的，所述菌悬液的制备过程中恒温培养箱为ZXMP-A1全温恒温恒湿箱，震荡装置为ZWY-B3222恒温培养震荡器，震荡速度为250r/min，震荡时间为10min，采用的离心装置为H165台式高速离心机，离心转速为3000r/min，离心时间为15min。
优选的，所述菌悬液的制备过程中通过细菌计数板计数，调整菌悬液浓度为106个/mL。
优选的，所述等离子体-紫外线复合诱变过程中等离子体发射源与样品间的距离为5mm，处理时间设置为30s，紫外灯照射时间为50s。
优选的，所述平板初筛过程中菌悬液用无菌的生理盐水稀释至10-7稀释度，分离筛选培养基中异戊烯焦磷酸的浓度为1.2g/L。
优选的，所述分离筛选培养基组分为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，NaCl10.0g/L，异戊烯焦磷酸1.5g/L，琼脂粉15.0g/L，pH 7.2。
优选的，所述7摇瓶复筛过程中刮取菌苔种于种子培养基中于250r/min培养12h后接种至发酵培养基，震荡速度为250r/min，加入正十二烷作为β-法尼烯的萃取剂，萃取剂的体积分数为20％(v/v)，发酵72h。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明的一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法具有以下优点：(1)由于等离子体和紫外线对DNA分子进行诱变的作用原理不同，因此引起的突变位点也就不同，因此采用等离子体-紫外复合诱变能够增大遗传物质的损伤程度，产生种类多样的错配位点，不仅可以弥补单因子诱变出现的热点饱和，还可以弥补DNA分子对单因子诱变的不亲和性而产生无增变效应，进而大大提高诱变的效果；(2)在经过等离子体-紫外复合诱变后，进而采用在分离培养基中添加β-法尼烯代谢合成途径中的前体物质异戊烯焦磷酸为筛选压力对高产突变菌株进行筛选，突变后的菌株能够在含最低致死剂量异戊烯焦磷酸的平板上正常生长，说明突变菌株对β-法尼烯代谢合成的前体物质异戊烯焦磷酸具有了一定耐受性，由此可以大大提高筛选得到高产β-法尼烯的大肠杆菌突变株的概率；(3)通过等离子体-紫外复合诱变后，再采用平板初筛和摇瓶复筛，最终选育出了的β-法尼烯高产突变菌株在发酵罐中β-法尼烯的发酵单位比出发菌株提高了169.10％，并且通过8次连续传代仍具有良好的遗传稳定性。
具体实施方式
实施例1
一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，包括如下步骤：
(1)菌悬液的制备：选取在ZXMP-A1全温恒温恒湿箱内37℃下培养2天的EC-16斜面菌苔，用10mL生理盐水将菌苔洗下，放入盛有玻璃珠的无菌锥形瓶中，置于ZWY-B3222恒温培养震荡器中30℃、250r/min震荡10min使菌体分散，将菌悬液3000r/min离心15min，弃上清液，菌体用生理盐水悬浮并洗涤2-3次，采用细菌计数板计数，调整菌悬液浓度约为108个/mL，备用；
(2)等离子体-紫外线复合诱变处理：在超净工作台中取3mL菌悬液加入到直径60mm带有磁力搅拌转子的无菌平皿中，在搅拌状态下用紫外灯(功率18W，灯距30cm)照射50s，紫外线诱变结束后，立即用移液枪移取20μL诱变后的菌悬液，涂布在无菌不锈钢载片上(ARTP仪专用配件)，严格按照ARTP-M型诱变育种仪的操作流程，以氮气为工作气体，设定功率为120W，处理温度为室温，通气量为10SLPM(Standard Liters Per Minute)，等离子体发射源与样品间的距离为5mm，处理时间设置为30s；
(3)平板初筛：将经过等离子体-紫外复合诱变处理的菌悬液用无菌的生理盐水至10-7稀释度，涂布于含1.2g/L异戊烯焦磷酸的分离筛选培养基上，置于37℃，避光培养2天，挑取平板上最先生长出的大肠杆菌单菌落接种于斜面培养基上，置于37℃，培养2天；
(4)摇瓶复筛：用接种铲刮取平板筛选出的EC-16的斜面菌苔1-2cm2接种于种子培养基中，37℃、250r/min条件下培养12h，取5mL培养菌液接种于100mL的发酵培养基中，37℃、250r/min震荡培养至OD600为0.7时，加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，随后加入体积分数为20％(v/v)的正十二烷作为β-法尼烯的萃取剂，设定培养温度为30℃，发酵72h，测定β-法尼烯的含量，然后挑选出发酵产物含量高的突变株接种于斜面培养基上，置于37℃，培养2天。
(5)发酵罐验证：选取生长良好的斜面，用接种铲刮取1-2cm2的菌苔接种于种子培养基中，37℃、250r/min，培养18h，然后按照8％的接种量接种于15L发酵罐中，设置发酵工艺参数分别为，发酵温度为30℃，初始转速250r/min，根据溶氧变化逐步调整至500r/min，通气量1:1(VVM)，发酵96h，最后测定β-法尼烯的含量，挑选出发酵产物含量最高的突变株。
本实施例中，斜面培养基组分为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，NaCl10.0g/L，琼脂粉15.0g/L，pH7.2。
本实施例中，分离筛选培养基组分为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，NaCl10.0g/L，异戊烯焦磷酸1.5g/L，琼脂粉15.0g/L，pH7.2。
本实施例中，种子培养基组分为：柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁胺0.3g/L，酵母抽提物5.0g/L，甘油20g/L，MgSO4 1.5g/L，K2HPO4·3H2O 9.8g/L，微量元素储液0.1％，pH 6.5。
本实施例中，发酵培养基组分为：柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁胺0.3g/L，酵母抽提物5.0g/L，甘油20g/L，葡萄糖5.0g/L，MgSO4 1.5g/L，K2HPO4·3H2O 9.8g/L，微量元素储液0.1％，pH 6.5。
通过本实施例最终选育出的β-法尼烯高产突变菌株，其产量高达267mg/g细胞干重，相比出发菌株提高了169.10％，，并且通过8次连续传代仍具有良好的遗传稳定性。
实施例2
一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，包括如下步骤：
(1)菌悬液的制备：选取在ZXMP-A1全温恒温恒湿箱内37℃下培养2天的EC-16斜面菌苔，用10mL生理盐水将菌苔洗下，放入盛有玻璃珠的无菌锥形瓶中，置于ZWY-B3222恒温培养震荡器中30℃、220r/min震荡6min使菌体分散，将菌悬液2500r/min离心10min，弃上清液，菌体用生理盐水悬浮并洗涤2-3次，采用细菌计数板计数，调整菌悬液浓度约为106个/mL，备用；
(2)等离子体-紫外线复合诱变处理：在超净工作台中取3mL菌悬液加入到直径60mm带有磁力搅拌转子的无菌平皿中，在搅拌状态下用紫外灯(功率18W，灯距30cm)照射20s，紫外线诱变结束后，立即用移液枪移取20μL诱变后的菌悬液，涂布在无菌不锈钢载片上(ARTP仪专用配件)，严格按照ARTP-M型诱变育种仪的操作流程，以氮气为工作气体，设定功率为120W，处理温度为室温，通气量为10SLPM(Standard Liters Per Minute)，等离子体发射源与样品间的距离为10mm，处理时间设置为50s；
(3)平板初筛：将经过等离子体-紫外复合诱变处理的菌悬液用无菌的生理盐水至10-6稀释度，涂布于含0.5g/L异戊烯焦磷酸的分离筛选培养基上，置于37℃，避光培养1天，挑取平板上最先生长出的大肠杆菌单菌落接种于斜面培养基上，置于37℃，培养1天；
(4)摇瓶复筛：用接种铲刮取平板筛选出的EC-16的斜面菌苔1-2cm2接种于种子培养基中，37℃、220r/min条件下培养16h，取5mL培养菌液接种于100mL的发酵培养基中，37℃、220r/min震荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，随后加入体积分数为10％(v/v)的正十二烷作为β-法尼烯的萃取剂，设定培养温度为30℃，发酵80h，测定β-法尼烯的含量，然后挑选出发酵产物含量高的突变株接种于斜面培养基上，置于37℃，培养2天。
(5)发酵罐验证：选取生长良好的斜面，用接种铲刮取1-2cm2的菌苔接种于种子培养基中，37℃、220r/min，培养12h，然后按照5％的接种量接种于15L发酵罐中，设置发酵工艺参数分别为，发酵温度为30℃，初始转速220r/min，根据溶氧变化逐步调整至450r/min，通气量1:1(VVM)，发酵72h，最后测定β-法尼烯的含量，挑选出发酵产物含量最高的突变株。
本实施例中，斜面培养基组分为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，NaCl10.0g/L，琼脂粉15.0g/L，pH7.2。
本实施例中，分离筛选培养基组分为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，NaCl10.0g/L，异戊烯焦磷酸1.5g/L，琼脂粉15.0g/L，pH7.2。
本实施例中，种子培养基组分为：柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁胺0.3g/L，酵母抽提物5.0g/L，甘油20g/L，MgSO4 1.5g/L，K2HPO4·3H2O 9.8g/L，微量元素储液0.1％，pH 6.5。
本实施例中，发酵培养基组分为：柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁胺0.3g/L，酵母抽提物5.0g/L，甘油20g/L，葡萄糖5.0g/L，MgSO4 1.5g/L，K2HPO4·3H2O 9.8g/L，微量元素储液0.1％，pH 6.5。
通过本实施例最终选育出的β-法尼烯高产突变菌株，其产量高达258mg/g细胞干重，相比出发菌株提高了162.73％，并且通过8次连续传代仍具有良好的遗传稳定性。
实施例3
一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，包括如下步骤：
(1)菌悬液的制备：选取在ZXMP-A1全温恒温恒湿箱内37℃下培养2天的EC-16斜面菌苔，用10mL生理盐水将菌苔洗下，放入盛有玻璃珠的无菌锥形瓶中，置于ZWY-B3222恒温培养震荡器中30℃、300r/min震荡15min使菌体分散，将菌悬液5000r/min离心20min，弃上清液，菌体用生理盐水悬浮并洗涤2-3次，采用细菌计数板计数，调整菌悬液浓度约为109个/mL，备用；
(2)等离子体-紫外线复合诱变处理：在超净工作台中取3mL菌悬液加入到直径60mm带有磁力搅拌转子的无菌平皿中，在搅拌状态下用紫外灯(功率18W，灯距30cm)照射120s，紫外线诱变结束后，立即用移液枪移取20μL诱变后的菌悬液，涂布在无菌不锈钢载片上(ARTP仪专用配件)，严格按照ARTP-M型诱变育种仪的操作流程，以氮气为工作气体，设定功率为120W，处理温度为室温，通气量为10SLPM(Standard Liters PerMinute)，等离子体发射源与样品间的距离为20mm，处理时间设置为70s；
(3)平板初筛：将经过等离子体-紫外复合诱变处理的菌悬液用无菌的生理盐水至10-8稀释度，涂布于含2g/L异戊烯焦磷酸的分离筛选培养基上，置于37℃，避光培养2天，挑取平板上最先生长出的大肠杆菌单菌落接种于斜面培养基上，置于37℃，培养2天；
(4)摇瓶复筛：用接种铲刮取平板筛选出的EC-16的斜面菌苔1-2cm2接种于种子培养基中，37℃、300r/min条件下培养20h，取5mL培养菌液接种于100mL的发酵培养基中，37℃、300r/min震荡培养至OD600为0.8时，加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，随后加入体积分数为35％(v/v)的正十二烷作为β-法尼烯的萃取剂，设定培养温度为30℃，发酵96h，测定β-法尼烯的含量，然后挑选出发酵产物含量高的突变株接种于斜面培养基上，置于37℃，培养2天。
(5)发酵罐验证：选取生长良好的斜面，用接种铲刮取1-2cm2的菌苔接种于种子培养基中，37℃、300r/min，培养20h，然后按照10％的接种量接种于15L发酵罐中，设置发酵工艺参数分别为，发酵温度为25℃，初始转速300r/min，根据溶氧变化逐步调整至600r/min，通气量1:1(VVM)，发酵80h，最后测定β-法尼烯的含量，挑选出发酵产物含量最高的突变株。
本实施例中，斜面培养基组分为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，NaCl10.0g/L，琼脂粉15.0g/L，pH7.2。
本实施例中，分离筛选培养基组分为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，NaCl10.0g/L，异戊烯焦磷酸1.5g/L，琼脂粉15.0g/L，pH7.2。
本实施例中，种子培养基组分为：柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁胺0.3g/L，酵母抽提物5.0g/L，甘油20g/L，MgSO4 1.5g/L，K2HPO4·3H2O 9.8g/L，微量元素储液0.1％，pH 6.5。
本实施例中，发酵培养基组分为：柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁胺0.3g/L，酵母抽提物5.0g/L，甘油20g/L，葡萄糖5.0g/L，MgSO4 1.5g/L，K2HPO4·3H2O 9.8g/L，微量元素储液0.1％，pH 6.5。
通过本实施例最终选育出的β-法尼烯高产突变菌株其产量高达261mg/g细胞干重，相比出发菌株提高了164.32％，并且通过8次连续传代仍具有良好的遗传稳定性。
上述具体实施方式仅是本发明的具体个案，本发明的专利保护范围包括但不限于上述具体实施方式的产品形态和式样，任何符合本发明权利要求书且任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应落入本发明的专利保护范围。
Claims (7)
1.一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)菌悬液的制备：选取恒温培养箱内37℃下培养2天的EC-16斜面菌苔，用10mL无菌生理盐水将菌苔洗下，放入盛有玻璃珠的无菌锥形瓶中，无菌锥形瓶置于震荡装置中，在30℃、220-300r/min的条件下震荡5-15min，使菌体分散，菌体分散后于2500-5000r/min条件下离心10-20min，弃上清液，将菌体用生理盐水悬浮并洗涤2-3次，采用细菌计数板计数，调整菌悬液浓度约为106-109个/mL，备用；
(2)等离子体-紫外线复合诱变：在超净工作台中取3mL步骤(1)制得的菌悬液加入到直径60mm带有磁力搅拌转子的无菌平皿中，在搅拌状态下用紫外灯照射20-120s，紫外灯功率为18W，灯距为30cm，紫外线诱变结束后，立即用移液枪移取20μL诱变后的菌悬液，涂布在无菌不锈钢载片上，并按照ARTP-M型诱变育种仪的操作流程进行处理，以氮气为工作气体，设定功率为120W，处理温度为室温，通气量为10SLPM，等离子体发射源与样品间的距离为5-20mm，处理时间设置为20-70s；
(3)平板初筛：将经过等离子体-紫外复合诱变处理的菌悬液用无菌的生理盐水稀释至10-6-10-8稀释度，然后涂布于含0.3-2.0g/L的异戊烯焦磷酸的分离筛选培养基上，置于37℃，避光培养1-2天，挑取平板上最先生长出的大肠杆菌单菌落接种于斜面培养基上，置于37℃，培养1-2天；
(4)摇瓶复筛：用接种铲刮取平板筛选出的EC-16的斜面菌苔1-2cm2接种于种子培养基中，37℃、220-300r/min条件下培养12-20h，取5mL培养菌液接种于100mL的发酵培养基中，37℃、220-300r/min条件下震荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷，随后加入正十二烷作为β-法尼烯的萃取剂，萃取剂的用量达到体积分数为10-35％(v/v)，设定培养温度为30℃，发酵72-96h，测定β-法尼烯的含量，然后挑选出发酵产物含量最高的突变株进行发酵罐验证；
(5)发酵罐验证：选取生长最好的斜面，用接种铲刮取1-2cm2的菌苔接种于种子培养基中，37℃、220-300r/min条件下培养12-20h，然后按照5-10％的接种量接种于15L发酵罐中，设置发酵工艺参数分别为：发酵温度20-30℃，初始转速220-300r/min，根据溶氧变化逐步调整至450-600r/min，通气量1:1VVM，发酵72-96h，最后测定β-法尼烯的含量，挑选出发酵产物含量最高的突变株。
2.根据权利要求1所述的一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，其特征在于：所述菌悬液的制备过程中恒温培养箱为ZXMP-A1全温恒温恒湿箱，震荡装置为ZWY-B3222恒温培养震荡器，震荡速度为250r/min，震荡时间为10min，采用的离心装置为H165台式高速离心机，离心转速为3000r/min，离心时间为15min。
3.根据权利要求1所述的一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，其特征在于：所述菌悬液的制备过程中通过细菌计数板计数，调整菌悬液浓度为108个/mL。
4.根据权利要求1所述的一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，其特征在于：所述等离子体-紫外线复合诱变过程中等离子体发射源与样品间的距离为5mm，处理时间设置为30s，紫外灯照射时间为50s。
5.根据权利要求1所述的一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，其特征在于：所述平板初筛过程中菌悬液用无菌的生理盐水稀释至10-7稀释度，分离筛选培养基中异戊烯焦磷酸的浓度为1.2g/L。
6.根据权利要求1所述的一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，其特征在于：所述分离筛选培养基组分为：胰蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，NaCl 10.0g/L，异戊烯焦磷酸1.5g/L，琼脂粉15.0g/L，pH 7.2。
7.根据权利要求1所述的一种高产β-法尼烯突变菌株的复合诱变育种方法，其特征在于：所述7摇瓶复筛过程中刮取菌苔种于种子培养基中于250r/min培养12h后接种至发酵培养基，震荡速度为250r/min，加入正十二烷作为β-法尼烯的萃取剂，萃取剂的体积分数为20％(v/v)，发酵72h。
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