CN101580858A - 一种dl-丙氨酸的酶法生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种DL－丙氨酸的酶法生产工艺，包括摇瓶种子培养和发酵，采用大肠杆菌，对其进行培养，产生氨基酸消旋酶，直接利用含有氨基酸消旋酶的细胞培养液，只通过一步反应即可生产出DL－丙氨酸。用本发明工艺生产DL－丙氨酸，转化效率达到99.6％以上，产品纯度99.0％以上，大大降低生产成本，适合大规模工业化生产。

Description

一种DL-丙氨酸的酶法生产工艺

技术领域

本发明属于氨基酸的生产技术领域，具体涉及一种DL-丙氨酸的酶法生产工艺。

背景技术

DL-丙氨酸是一种非天然氨基酸，是重要的有机手性源。主要应用于手性药物、手性添加剂、手性助剂等领域，在制药及食品行业作为手性合成的手性源。目前主要用于生产新型农药、氨基丙醇、化工中间体、食品添加剂。

目前DL-丙氨酸的制备包括Streck法、α-卤代酸法、相转移催化合成和冰醋酸消旋法四种工艺。其中

Streck法为：乙醛与氰化氢形成氰醇，除去其中过量氰化氢后，加入氨溶液内，生成氨基腈，加碱水解得到丙氨酸的钠盐，经离子交换树脂处理得到DL-丙氨酸，尽管原料价格便宜，但却存在着氨基腈水解后分离比较困难，特别是DL-丙氨酸与副产物分离比较复杂，稍有不当即影响产品质量，氨解反应条件苛刻，氰化氢的运输比氨更为困难。

α-卤代酸法为：以α-卤丙酸为原料，以乌洛托品位催化剂，与氨水进行氨化，制成α-丙氨酸和氯化铵混合物，粗制品进入醇溶液中进行醇析、离心、干燥得到工业级产品，再经离子交换树脂法或重结晶法得到DL-α-丙氨酸，尽管连连易得，对设备要求不高，但在生产过程中会产生大量副产物氯化铵，分离困难，精制成本高；要采用大量甲醇醇析，造成甲醇严重挥发排放，污染严重，且甲醇贮存场地和生产场地易燃易爆，生成安全性不高；催化剂用量很大，不能回收而造成浪费，未反应完原料不能回用，反映终点难以判断，难于降低原来的消耗。

冰醋酸消旋法为以L-丙氨酸为原料，加入催化剂，在冰醋酸溶液中加热80～110℃、溶解；温度保持在95～100℃进行蒸发浓缩得到消旋的DL-丙氨酸；将消旋的DL-丙氨酸母液降温至20～50℃冷却后，含杂质的DL-丙氨酸结晶析出，将该结晶进行离心甩干后，加热至100～120℃的温度下烘干再得粗品DL-丙氨酸；然后脱色、重结晶精制。该工艺能耗高，污染量大，冰醋酸易挥发、运输困难。

国内现有与DL-丙氨酸的生产方法相关的研究，研究单位有：冀州市华阳化工有限责任公司、广东工业大学化工系、新旗氨基酸有限公司。冀州市华阳化工有限责任公司的专利“一种DL-丙氨酸的制备工艺”，申请(专利)号：200610012947.X。其主要技术方案为：以L-丙氨酸为原料，加入催化剂，在冰醋酸溶液中加热、溶解、蒸发浓缩得到消旋的DL-丙氨酸；后再经降温、结晶、离心甩干和烘干等工序即可得到高含量的DL-丙氨酸。

(《广东化工》1999年26卷2期-23-24页)发表了“DL-丙氨酸合成方法的研究”，此文研究了以乙醛为原料，在相转移催化剂在下与氯仿，氨水作用，一步合成DL-丙氨酸的实验新方法，并对合成产物的熔点，红外光谱等进行了分析、鉴定。

上述现有技术中的工艺，其产品制备成本相对较高，转化效率较低，难以达到工业化生产的要求。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种DL-丙氨酸的酶法生产工艺，该工艺可适合大规模工业化生产且能显著降低生产成本。

本发明为实现其目的所采取的技术方案：一种DL-丙氨酸的酶法生产工艺，包括摇瓶种子培养和发酵，采用大肠杆菌在下述条件下培养和发酵：

a、种子培养基(质量百分比)和培养条件：蛋白胨0.6～0.8％，氯化钠0.4～0.6％，硫酸镁0.01～0.02％，磷酸二氢钾0.1～0.2％，L-丙氨酸1％，玉米浆1.5～1.8％，余量为纯净水，氨水调pH7.0～7.2。35～8℃培养24小时；摇床频率为105～110r/min；

b、发酵培养基：蛋白胨0.8～1.2％，玉米浆1.8～2.2％，硫酸镁0.01～0.02％，磷酸二氢钾0.05～0.2％，氯化钠0.1～0.2％，L-丙氨酸1％，余量为纯净水，配料完毕用氨水调pH至7.0～7.2。

c、发酵培养条件：罐温30℃±5℃，通风比1∶0.2。培养终点pH值7.0～8.5。

本发明从自然界筛选产对L-丙氨酸有消旋作用的微生物——大肠杆菌，通过物理或化学的方法诱变，提高其氨基酸消旋酶的生产能力和活性。培养上述微生物，产生氨基酸消旋酶，生产原料是L-丙氨酸，L-丙氨酸直接作为酶转化的底物，而不是培养基，转化过程是把L-丙氨酸流加进预先培养好的含有氨基酸消旋酶的细胞悬液中。生产条件利用的是生物催化剂，生产过程无高温高压反应，无有毒化学品，常温、常压操作。通过转化过程不断流加L-丙氨酸。L-丙氨酸积累浓度增加，累积到一定程度可以以结晶体的形式与反应液分离，只需要经过简单的溶解、脱色、重结晶就可以得到精制品，生产效率高。

本发明的有益效果：采用微生物酶法转化L-丙氨酸规模化生产DL-丙氨酸，转化效率达到99.6％以上，产品纯度99.0％以上，大大降低生产成本，适合大规模工业化生产。

附图说明

以下结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。

图1为本发明工艺流程图。

具体实施方式

参见图1，对本发明工艺过程描述如下：

1、菌种培养：

将斜面菌种接种到摇瓶液体培养基中，在震荡培养器上连续培养24小时左右后，转移到发酵罐通风培养。在特定工艺条件下发酵20小时左右后，检测发酵液OD值、pH值、酶活力等参数。培养结束，把上述含有氨基酸消旋酶的细胞悬液转移至反应罐。

2、酶促反应：

细胞悬液在反应罐升到一定温度后，通入无菌空气，流加底物L-丙氨酸，反应体系中的L-丙氨酸消旋酶消旋L-丙氨酸。随着底物流加量的不断增加，DL-丙氨酸的浓度不断增加，积累到一定程度，DL-丙氨酸从反应体系中结晶出来，通过离心分离得到粗品。离心后的酶反应液可以回收反复套用多次，直到酶活力降低到没有利用价值。丧失酶活力的酶反应液中含有一定浓度的DL-丙氨酸，这部分产品可以通过浓缩的方式结晶出来。

3、产品精制

粗品DL-丙氨酸，含有一定量的色素、蛋白质等有机杂质，投入脱色罐中加水升温溶解，加入活性碳脱色，溶液经活性碳过滤机、50μm膜过滤机过滤，净化后的过滤清液经真空浓缩结晶，可以得到化学纯度超过98.5％，光学纯度超过99％的产品。

主要技术参数：

本发明利用现有L-丙氨酸生产装置，适当增加设备。进行了多个批次的工业化实验，取得了系列适合工业化生产的技术参数。

1、一级种子工艺技术参数

硫酸镁0.02％，蛋白胨0.7％，氯化钠0.5％，牛肉膏1％，琼脂2％，磷酸二氢钾0.1％，反丁烯二酸1％，余量为纯净水，氨水调pH7.0～7.2。

试管空消120℃，灭菌30分钟，实消120℃，灭菌30分钟。37℃恒温培养24～36小时。

一级种子培养基配方和培养条件：

蛋白胨0.7％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.1％，反丁烯二酸1％，玉米浆1.8％，余量为纯净水，氨水调pH7.0～7.2。

1000ml三角瓶装液量200ml，0.1MPa灭菌20分钟，37℃培养24小时。摇床条件：冲程6.5～7cm，频率为105～110r/min。

2、发酵罐发酵产酶工艺技术参数

(1)OD值净长大于0.35；

(2)培养周期不超过20小时；

(3)培养条件：

罐温30℃±1℃，通风比1∶0.2。培养终点pH值8.0；

(4)发酵罐培养基配方：

种子罐定容500L，其中加蛋白胨1.0％，玉米浆1.8-2.2％，七水硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.145％，反丁烯二酸1％，泡敌150ml左右，配料完毕用氨水调pH至7.0～7.2。

3、转化工艺技术参数

(1)对L-丙氨酸消旋率99.5％以上；

(2)转化时间小于12小时；

(3)转化温度控制在37℃～40℃之间，含酶发酵液体加入量0.4％。

(4)转化体系配方：硫酸镁2.2kg，L-丙氨酸(含量≥99％)1200kg，含酶发酵液0.4％，水定容10m³，用液氨调pH值为8.0左右。

4、提取过程工艺技术参数

(1)脱色温度80℃；

(2)活性炭加量30～50kg；

(3)静止20～30分钟；

(4)滤液澄清无杂质，透光率≥99％；

(5)脱色液浓缩温度：≤60℃，真空度≤0.07MPa；

(6)浓缩比：≥1/0.3有大量晶体出现，pH值5.5～6.5；

(7)结晶温度：≤20℃；

(8)离心终点：出水成滴不成线；

(9)干燥温度：60～70℃，干燥失重≤0.2％。

本发明主要技术指标酶活力2800μmol/g.h；操作稳定性7天；转化率≥98.5％；产品对底物质量收率≥95％；化学纯度≥98.5％；光学纯度≥99％。以上几项要求，在本发明生物酶生产DL-丙氨酸技术生产中都得到了良好的体现。

实施例1

配种子液2000ml，种子液配比为蛋白胨0.7％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.1％，L-丙氨酸1％，玉米浆1.8％，余量为纯净水，氨水调pH7.0。分装在5只1000ml三角瓶灭菌后，37℃接种斜面，摇床培养24h，摇床转速为105r/min，接种100L发酵液，发酵液配比为蛋白胨1.0％，玉米浆1.8～2.2％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.145％，L-丙氨酸1％，泡敌30ml，配料完毕用氨水调pH至7.0。发酵培养条件：培养温度30℃，通风比1∶0.2，罐压0.05MPa，培养18h。OD值净长大于0.35后，取发酵液配制500L转化液，L-丙氨酸60kg，酶液2000ml，余量为纯净水，用液氨调pH值为8.0左右。转化温度38℃，转化12h。80℃脱色，活性炭加量1kg，过滤后浓缩，65℃干燥。得到产品59.6kg，产品含量99.5％，比旋光度[α]_DL ²⁰为0，透光率99.8％。

实施例2

配种子液1000ml，种子液配比为蛋白胨0.6％，氯化钠0.6％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.2％，L-丙氨酸1％，玉米浆2.0％，余量为纯净水，氨水调pH7.5.分装在10只1000ml三角瓶灭菌后，37℃接种斜面，摇床培养20h，摇床转速为110r/min，接种100L发酵液，发酵液配比为蛋白胨1.2％，玉米浆2.4％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.2％，氯化钠0.2％，L-丙氨酸1％，泡敌30ml，配料完毕用氨水调pH至7.5。发酵培养条件：培养温度32℃，通风比1∶0.2，罐压0.05MPa，培养20h。OD值净长大于0.35后，取发酵液配制500L转化液，硫酸镁0.2kg，L-丙氨酸60kg，酶液1000ml，用液氨调pH值为8.5。转化温度40℃，转化12h。85℃脱色，活性炭加量1.2kg，过滤后浓缩，70℃干燥。得到产品59.4kg，产品含量99.3％，比旋光度[α]_DL ²⁰为0，透光率99.2％。

实施例3

配种子液800ml，种子液配比为蛋白胨0.6％，氯化钠0.4％，七水硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.05％，L-丙氨酸1％，玉米浆1.5％，余量为纯净水，氨水调pH6.5。分装在4只1000ml三角瓶灭菌后，37℃接种斜面，摇床培养24h，摇床转速为100r/min，接种100L发酵液，发酵液配比为蛋白胨0.8％，玉米浆1.8％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.05％，氯化钠0.1％，L-丙氨酸1％，泡敌20ml，配料完毕用氨水调pH至6.5。发酵培养条件：培养温度30℃，通风比1∶0.2，罐压0.05MPa，培养18h。OD值净长大于0.35后，取发酵液配制500L转化液，硫酸镁0.1kg，L-丙氨酸60kg，酶液800ml，用液氨调pH值为7.5。转化温度35℃，转化12h。70℃脱色，活性炭加量0.8kg，过滤后浓缩，60℃干燥。得到产品59.2kg，产品含量99.4％，比旋光度[α]_DL ²⁰为0，透光率99.4％。

本发明采用的“生物酶”，直接利用含有氨基酸消旋酶的细胞培养液，只通过一步反应即可生产出DL-丙氨酸，生产成本大幅度下降，可以做到3万元以下。按目前产品市场价格3.75万元，有很大的获利空间。

自然界中多数微生物具有分解氨基酸的能力，本发明利用的微生物是大肠杆菌，通过发酵培养产生L-丙氨酸消旋酶生产DL-丙氨酸。

Claims (1)

1、一种DL-丙氨酸的酶法生产工艺，包括摇瓶种子培养和发酵，其特征在于采用大肠杆菌在下述条件下培养和发酵：

a、种子培养基(质量百分比)和培养条件：蛋白胨0.6～0.8％，氯化钠0.4～0.6％，硫酸镁0.01～0.02％，磷酸二氢钾0.1～0.2％，L-丙氨酸1％，玉米浆1.5～1.8％，余量为纯净水，氨水调pH7.0～7.2。35～38℃培养24小时；摇床频率为105～110r/min；

b、发酵培养基：蛋白胨0.8～1.2％，玉米浆1.8～2.2％，硫酸镁0.01～0.02％，磷酸二氢钾0.05～0.2％，氯化钠0.1～0.2％，L-丙氨酸1％，余量为纯净水，配料完毕用氨水调pH至7.0～7.2。

c、发酵培养条件：罐温30℃±5℃，通风比1∶0.2。培养终点pH值7.0～8.5。