CN104131061B - 一种土霉素季铵盐的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本案公开了一种土霉素季铵盐的制备方法，它包括孢子制备、种子制备、发酵、酸化、纯化、脱色、成盐、重结晶、过滤干燥等工艺步骤。本案通过对生产工艺的改进，可以在温和环保的条件下，将土霉素一步反应成季铵盐，并且其可以在反应体系中以沉淀形式析出，为后续分离提纯提供方便；同时，采用全新的重结晶体系，工艺简单，提纯效率高，避免了通过氨水调节pH至等电点来使产物沉淀的旧工艺。
Description
技术领域
本发明涉及抗生素的制备，特别涉及一种土霉素季铵盐的制备方法。
背景技术
土霉素，又称地霉素，氧四环素，化学名为(4s，4aR，5S，5aR，6S，12aS)-N-4-二甲胺基-1，4，4a，5，5a，6，11，12a-六羟基-6-甲基-1，11-二氧代并四苯-2-甲酰胺，是四环素类抗生素的一种，因结构上含有四并苯基的母核而得名。化学式如下：
本品为灰白色至黄色的结晶粉末，无臭，味苦，在空气中性质稳定，在日光下颜色变暗，在碱性条件下易失效。土霉素的盐酸盐为黄色结晶粉末，有吸湿性，但水分和光线不影响其效用，在室温下可保存一段时间不变质，不失效。
土霉素为四环类抗生素，生产工艺简单成熟，生产成本较低，它可以作为生产其它新型抗生素的原料，也可以作为饲料添加剂用于养殖业。土霉素对多数革兰氏阳性菌(如肺炎球菌，溶血性链球菌，草绿色链球菌以及部分葡萄糖球菌，炭疽杆菌)和革兰氏阴性菌(如大肠杆菌，产气杆菌，破伤风，肺炎杆菌，流感杆菌，百日咳杆菌等)均有抗菌作用。土霉素多采用微生物发酵法制得，通常由龟裂链丝菌发酵得到。
然而，最新的研究表明，较之于土霉素本身或其盐酸盐，土霉素季铵盐的抗菌活性、耐药性方面更胜一筹。尽管土霉素及其盐酸盐的制备工艺早已成熟，但这些工艺中难免用到一些如氰类、胺类等剧毒物质，并且土霉素季铵盐的制备工艺尚处在开发阶段，而能够运用于大规模生产的生产工艺则几乎没有，为此，本案旨在提供一个既环保又能够大批量生产的土霉素季铵盐的制备方法。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种土霉素季铵盐的制备方法，其技术方案概述如下：
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)孢子制备：将保存在砂土管的龟裂链丝菌种经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.5～36.8℃、55％的相对湿度条件下培养4～5天，并挑选菌落正常的孢子作为种子；
步骤2)种子制备：将步骤1)挑选到的孢子接入一级种子罐，在31℃下培养至培养液转为黄色，且培养液的pH值达到6.0～6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在31℃下扩大培养48h；
步骤3)发酵：将步骤2)得到的培养液在30～31℃下发酵194h，保持通氧量为0.9v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4～6.8之间；
步骤4)酸化、纯化：使用0.01M的盐酸与0.1M的草酸将步骤3)所得发酵液调节至pH＝1.75～1.80，随后向发酵液中加入0.15wt％硫酸锌、0.05wt％硼砂和0.25wt％的黄血盐以除去蛋白质、铁离子，过滤，得到滤液；
步骤5)脱色：将滤液通过122-2树脂进行脱色；
步骤6)成盐：将滤液溶液抽干，加入无水乙醇重新溶解，加入1.2当量的卤代烃，搅拌，加入10wt％的4A分子筛，在0℃下反应4h；
步骤7)重结晶：滤得粗品沉淀，洗涤，用正己烷∶无水乙醇＝1∶7的混合溶剂在37℃下溶解，随后静至冷却，直至析出沉淀；
步骤8)过滤干燥，称重。
优选的是，所述的土霉素季铵盐的制备方法，在步骤4)酸化时，发酵液温度小于10℃。
优选的是，所述的土霉素季铵盐的制备方法，在步骤6)中，所述卤代烃为CH3CH2Br或BrCH2COOEt。
优选的是，所述的土霉素季铵盐的制备方法，在步骤3)发酵时加入0.1wt％的消泡剂。
优选的是，所述的土霉素季铵盐的制备方法，在步骤1)孢子制备时，在水中加入0.003wt％的K2SO4、0.008wt％的KH2PO4及0.01wt％的(NH4)2HPO4。
本发明的有益效果是：1)本案通过对生产工艺的改进，可以在温和环保的条件下，将土霉素一步反应成季铵盐，并且其可以在反应体系中以沉淀形式析出，为后续分离提纯提供方便；2)采用全新的重结晶体系，工艺简单，提纯效率高，避免了通过氨水调节pH至等电点来使产物沉淀的旧工艺。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)孢子制备：将保存在砂土管的龟裂链丝菌种经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.5～36.8℃、55％的相对湿度条件下培养4～5天，并挑选菌落正常的孢子作为种子；若温度持续高于36.8℃2小时，则孢子的生产能力明显下降，不可用于继续生产。在制备孢子时，可在水中加入0.003wt％的K2SO4、0.008wt％的KH2PO4及0.01wt％的(NH4)2HPO4，这是一种稳定剂，用于保持水质质量稳定平衡，避免水质波动对孢子质量的影响，同时还可缩短孢子的成熟期。
步骤2)种子制备：将步骤1)挑选到的孢子接入一级种子罐，在31℃下培养至培养液转为黄色，且培养液的pH值达到6.0～6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在31℃下扩大培养48h。
步骤3)发酵：将步骤2)得到的培养液在30～31℃下发酵194h，保持通氧量为0.9v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4～6.8之间；由于在发酵过程中不断产生二氧化碳，加上培养液中有较多有机氮源含有蛋白质，在发酵时会产生大量泡沫，因此发酵时可加入0.1wt％的消泡剂。
步骤4)酸化、纯化：使用0.01M的盐酸与0.1M的草酸将步骤3)所得发酵液调节至pH＝1.75～1.80，随后向发酵液中加入0.15wt％硫酸锌、0.05wt％硼砂和0.25wt％的黄血盐以除去蛋白质、铁离子，过滤，得到滤液。
土霉素能和钙、镁等金属离子形成复合物沉淀，在发酵过程中，这些复合物积聚在菌丝中，因此需要对土霉素的发酵液进行酸化处理，使菌丝中的单位释放出来，以保证产品收率和质量。酸化剂一般可选用盐酸、硫酸、草酸或磷酸等，但草酸对钙离子的清除能力较好，去钙完全，同时析出的草酸钙还能促进蛋白质的凝结，提高滤液质量，但草酸属于弱酸，价格昂贵，且容易使土霉素发生异构化，鉴于这些因素，本案采用盐酸-草酸复合酸对体系进行酸化处理，且酸化时，控制发酵液温度小于10℃，以降低土霉素发生异构化概率。
发酵液中同时还存在着许多有机和无机的杂质，为了进一步提高滤液质量，可加入黄血盐-硫酸锌协调作用除去蛋白质及铁离子，并且可通过加入硼砂来提高所得滤液的质量。
步骤5)脱色：将滤液通过122-2树脂进行脱色，以除去滤液中的色素及有机杂质。
步骤6)成盐：将滤液溶液抽干，加入无水乙醇重新溶解，加入略过量的1.2当量的卤代烃R-X如CH3CH2Br或BrCH2COOEt，搅拌，加入10wt％的4A分子筛，在0℃下反应4h；4A分子筛实则是一种催化载体，通过提高分子间的接触几率来加速反应，精确控温在0℃是为了防止土霉素中的手性原子发生消旋化，同时也可有效降低副反应的发生。反应方程式如下：
步骤7)重结晶：滤得粗品沉淀，洗涤，用正己烷∶无水乙醇＝1∶7的混合溶剂在37℃下溶解，随后静至冷却，直至析出沉淀；得到的土霉素季铵盐在无水乙醇中析出，随后采用正己烷-无水乙醇体系进行重结晶，采用该体系无需抽干上步所用溶剂，因为两步所用溶剂相同，都是无水乙醇，工艺简化，且通过正己烷对极性的平衡，使得土霉素季铵盐能够高产高纯度的结晶出来。
步骤8)过滤干燥，称重。
实施例1
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)孢子制备：将保存在砂土管的1000g龟裂链丝菌种经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，水中加有0.03gK2SO4、0.08gKH2PO4及0.1g(NH4)2HPO4，在36.5～36.8℃、55％的相对湿度条件下培养4～5天，并挑选菌落正常的孢子作为种子。
步骤2)种子制备：称取100g步骤1)挑选到的孢子接入一级种子罐，在31℃下培养至培养液转为黄色，且培养液的pH值达到6.0～6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在31℃下扩大培养48h。
步骤3)发酵：将步骤2)得到的培养液在30.5℃下发酵194h，发酵液中加有0.1g消泡剂，保持通氧量为0.9v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4～6.8之间。
步骤4)酸化、纯化：控制上述发酵液温度小于10℃，使用0.01M的盐酸与0.1M的草酸将发酵液调节至pH＝1.75～1.80，随后向发酵液中加入0.15g硫酸锌、0.05g硼砂和0.25g的黄血盐以除去蛋白质、铁离子，过滤，得到滤液。
步骤5)脱色：将滤液通过122-2树脂进行脱色。
步骤6)成盐：将滤液溶液抽干，加入200g无水乙醇重新溶解，精确控温在0℃，加入26gCH3CH2Br和10g4A分子筛，搅拌反应4h。
步骤7)重结晶：滤得粗品沉淀127g，洗涤，用正己烷∶无水乙醇＝1∶7的混合溶剂在37℃下溶解，随后静至冷却，直至析出沉淀。
步骤8)过滤干燥，称重得92g最终产品，经1H NMR、13C NMR和质谱表征后证实该产品就是土霉素季铵盐。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (4)
1.一种土霉素季铵盐的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)孢子制备：将保存在砂土管的龟裂链丝菌种经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.5～36.8℃、55％的相对湿度条件下培养4～5天，并挑选菌落正常的孢子作为种子；
步骤2)种子制备：将步骤1)挑选到的孢子接入一级种子罐，在31℃下培养至培养液转为黄色，且培养液的pH值达到6.0～6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在31℃下扩大培养48h；
步骤3)发酵：将步骤2)得到的培养液在30～31℃下发酵194h，保持通氧量为0.9v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4～6.8之间；
步骤4)酸化、纯化：使用0.01M的盐酸与0.1M的草酸将步骤3)所得发酵液调节至pH＝1.75～1.80，随后向发酵液中加入0.15wt％硫酸锌、0.05wt％硼砂和0.25wt％的黄血盐以除去蛋白质、铁离子，过滤，得到滤液；
步骤5)脱色：将滤液通过122-2树脂进行脱色；
步骤6)成盐：将滤液溶液抽干，加入无水乙醇重新溶解，加入1.2当量的卤代烃，搅拌，加入10wt％的4A分子筛，在0℃下反应4h；
步骤7)重结晶：滤得粗品沉淀，洗涤，用正己烷∶无水乙醇＝1∶7的混合溶剂在37℃下溶解，随后静置冷却，直至析出沉淀；
步骤8)过滤干燥，称重；
在步骤6)中，所述卤代烃为CH3CH2Br。
2.根据权利要求1所述的土霉素季铵盐的制备方法，其特征在于，在步骤4)酸化时，发酵液温度小于10℃。
3.根据权利要求1所述的土霉素季铵盐的制备方法，其特征在于，在步骤3)发酵时加入0.1wt％的消泡剂。
4.根据权利要求1所述的土霉素季铵盐的制备方法，其特征在于，在步骤1)孢子制备时，在水中加入0.003wt％的K2SO4、0.008wt％的KH2PO4及0.01wt％的(NH4)2HPO4。
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