CN108841910B - 一种土霉素季铵盐的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土霉素季铵盐的制备方法，包括孢子、种子制备、发酵、酸化、纯化、脱色、干燥、溶解结晶等步骤，发酵步骤中加入烟酸和D‑氨基葡萄糖盐酸盐组成的复合活化剂，用硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷进行发酵液的纯化，脱色步骤选用复合脱色剂，制得的土霉素季铵盐产品不仅收率和纯度高，而且脱色效果好，同时缩短了发酵步骤的时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗生素的制备，特别涉及一种土霉素季铵盐的制备方法。
背景技术
土霉素，又称地霉素，氧四环素，化学名为(4s，4aR，5S，5aR，6S，12aS)-N-4-二甲胺基-1，4，4a，5，5a，6，11，12a-六羟基-6-甲基-1，11-二氧代并四苯-2-甲酰胺，是四环素类抗生素的一种，因结构上含有四并苯基的母核而得名。本品为黄色的结晶粉末，无臭，味苦，在空气中性质稳定，在日光下颜色变暗，在碱性条件下易失效。土霉素的盐酸盐为黄色结晶粉末，有吸湿性，但水分和光线不影响其效用，在室温下可保存一段时间不变质，不失效。
土霉素具有广谱抗病原微生物作用，为快速抑菌剂，高浓度时对某些细菌呈杀菌作用。其作用机制在于药物能特异性地与核糖体30S亚基的A位置结合，阻止氨基酰-tRNA在该位置上的联结，从而抑制肽链的增长和影响细菌或其他病原微生物的蛋白质合成。土霉素对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、化脓性链球菌、淋球菌、脑膜炎球菌、大肠杆菌、产气杆菌、贺菌属、耶尔森菌、单核细胞李斯特菌等有较强抗菌活性；此外，土霉素对立克次体、支原体、衣原体、放线菌等也有较强作用。
与土霉素或其盐酸盐相比，土霉素季铵盐的抗菌活性、耐药性方面更胜一筹。尽管土霉素及其盐酸盐的制备工艺早已成熟，但这些工艺中难免用到一些如氰类、胺类等剧毒物质，并且土霉素季铵盐的制备工艺尚处在开发阶段，得到的产品产率和纯度较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种土霉素季铵盐的制备方法，包括孢子、种子制备、发酵、酸化、纯化、脱色、干燥、溶解结晶等步骤，发酵步骤中加入活化剂，用多种纯化剂进行发酵液的纯化，脱色步骤选用复合脱色剂，制得的土霉素季铵盐产品不仅产率和纯度高，而且脱色效果高，缩短了发酵步骤的时间，满足制药领域的要求。
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)孢子制备：
将龟裂链霉菌经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.0-36.4℃的温度、56-60％的相对湿度条件下培养4-5天后，挑选菌落正常无污染的孢子作为种子；
(2)种子制备：
将步骤(1)挑选得到的孢子接入一级种子罐，在32-34℃下培养至培养液为黄色，且培养液的pH值达到6.0-6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在32-34℃下扩大培养38-42h；
(3)发酵：
将步骤(2)得到的培养液在32-33℃下发酵110-140h，通氧量为0.9-1.1v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4-6.8之间；
(4)酸化和纯化：
用0.01mol/L的盐酸与0.1mol/L的草酸将步骤(3)所得发酵液调节至pH为1.70-1.74，随后向发酵液中加入纯化剂，搅拌后过滤，得到滤液；
(5)脱色：
将滤液用复合脱色剂进行脱色处理20-40分钟，过滤；
(6)干燥：
将脱色后的滤液进行干燥，得到土霉素干品，控制水分为4％-7％；
(7)溶解结晶：
将蒸馏水搅拌并升温至55-60℃，加入盐酸调节pH值为6.0-6.5，继续升温至62-68℃，投入步骤(6)制得的土霉素干品，搅拌至土霉素全部溶解，再加入备好的DTAC，继续搅拌，继续加入称量好的氢氧化钙，料液pH值控制在9.0-10.0之间，结晶，静置，离心分离；
(8)干燥：
将步骤(7)得到的湿成品装入双锥干燥器内，控制烘干温度90±5℃，真空度≤-0.07MPa，进行干燥，粉碎过筛，称重，分装即得土霉素季铵盐。
在所述的步骤(1)中，斜面培养基的各组分的质量份数为：麸皮5-15份、琼脂5-10份、水80-100份。
在所述的步骤(3)中，在发酵的同时加入由烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的复合活性试剂，烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐的重量比为：3.5-4.5:1，复合活性试剂的添加量为培养液重量的0.2-0.6％。
在所述的步骤(4)中，纯化剂为硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷组成的复合试剂，硫酸锌、高铁酸钾、烷基糖苷的重量比为：2.5-3.0:5.3-5.7:1，纯化剂的添加量为发酵液重量的0.15-0.25％。
在所述的步骤(5)中，复合脱色剂各组分的质量份数为：活性炭25-35份、ADS-7大孔吸附树脂10-20份、D1400大孔吸附树脂10-20份、NKA-9型大孔吸附树脂8-12份，复合脱色剂的添加量为滤液重量的1.0-2.0％。
在所述的步骤(7)中，蒸馏水、土霉素干品、DTAC、氢氧化钙的重量比为：3.5-4.5:1:0.30-0.35:0.16-0.20。
龟裂链霉菌可以在中国普通微生物菌种保藏管理中心购买，保藏号为CGMCC4.748。
ADS-7大孔吸附树脂、D1400大孔吸附树脂、NKA-9型大孔吸附树脂可以在天津浩聚树脂科技有限公司购买。
DTAC为十二烷基三甲基氯化铵。
本发明的优点在于：
1、在土霉素发酵过程中加入烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的复合活化试剂，烟酸可以促进细胞的新陈代谢，D-氨基葡萄糖盐酸盐可以补充发酵过程中所需的氨基酸，两者共同作用促使发酵液中的龟裂链霉菌细胞进行生物代谢，产生大量土霉素，明显提高产品收率，同时还缩短了发酵时间，从原来的7-8天可以缩短至5天左右。
2、选择硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷组成的复合纯化剂对发酵液进行纯化，不仅可以去除蛋白质和各种金属离子，还可以除去有机物，使得产品杂质含量大大减少。
3、采用复合脱色剂进行脱色，脱色效果好，脱色率高。
综上所述，本发明在制备土霉素季铵盐的过程中，发酵步骤中加入活化剂，用硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷进行发酵液的纯化，脱色步骤选用复合脱色剂，共同作用，制得的土霉素季铵盐产品不仅收率和纯度高，而且脱色效果高，同时缩短了发酵步骤的时间，满足制药领域的要求。
具体实施方式
实施例1
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)孢子制备：
将龟裂链霉菌经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.0℃的温度、56％的相对湿度条件下培养4天后，挑选菌落正常无污染的孢子作为种子；
斜面培养基的各组分的质量份数为：麸皮5份、琼脂5份、水80份。
(2)种子制备：
将步骤(1)挑选得到的孢子接入一级种子罐，在32℃下培养至培养液为黄色，且培养液的pH值达到6.0-6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在32℃下扩大培养38h；
(3)发酵：
将步骤(2)得到的培养液在32℃下发酵110h，通氧量为0.9v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4-6.8之间；
在发酵的同时加入由烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的复合活性试剂，烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐的重量比为：3.5:1，复合活性试剂的添加量为培养液重量的0.2％。
(4)酸化和纯化：
用0.01mol/L的盐酸与0.1mol/L的草酸将步骤(3)所得发酵液调节至pH为1.70-1.74，随后向发酵液中加入纯化剂，搅拌后过滤，得到滤液；
纯化剂为硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷组成的复合试剂，硫酸锌、高铁酸钾、烷基糖苷的重量比为：2.5:5.3:1，纯化剂的添加量为发酵液重量的0.15％。
(5)脱色：
将滤液用复合脱色剂进行脱色处理20分钟，过滤；
复合脱色剂各组分的质量份数为：活性炭25份、ADS-7大孔吸附树脂10份、D1400大孔吸附树脂10份、NKA-9型大孔吸附树脂8份，复合脱色剂的添加量为滤液重量的1.0％。
(6)干燥：
将脱色后的滤液进行干燥，得到土霉素干品，控制水分为4％；
(7)溶解结晶：
将蒸馏水搅拌并升温至55℃，加入盐酸调节pH值为6.0-6.5，继续升温至62℃，投入步骤(6)制得的土霉素干品，搅拌至土霉素全部溶解，再加入备好的DTAC，继续搅拌，继续加入称量好的氢氧化钙，料液pH值控制在9.0-10.0之间，结晶，静置，离心分离；
蒸馏水、土霉素干品、DTAC、氢氧化钙的重量比为：3.5:1:0.30:0.16。
(8)干燥：
将步骤(7)得到的湿成品装入双锥干燥器内，控制烘干温度90±5℃，真空度≤-0.07MPa，进行干燥，粉碎过筛，称重，分装即得土霉素季铵盐。
实施例2
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)孢子制备：
将龟裂链霉菌经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.2℃的温度、58％的相对湿度条件下培养4.5天后，挑选菌落正常无污染的孢子作为种子；
斜面培养基的各组分的质量份数为：麸皮10份、琼脂8份、水90份。
(2)种子制备：
将步骤(1)挑选得到的孢子接入一级种子罐，在33℃下培养至培养液为黄色，且培养液的pH值达到6.0-6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在33℃下扩大培养40h；
(3)发酵：
将步骤(2)得到的培养液在32.5℃下发酵120h，通氧量为1.0v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4-6.8之间；
在发酵的同时加入由烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的复合活性试剂，烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐的重量比为：4.0:1，复合活性试剂的添加量为培养液重量的0.4％。
(4)酸化和纯化：
用0.01mol/L的盐酸与0.1mol/L的草酸将步骤(3)所得发酵液调节至pH为1.70-1.74，随后向发酵液中加入纯化剂，搅拌后过滤，得到滤液；
纯化剂为硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷组成的复合试剂，硫酸锌、高铁酸钾、烷基糖苷的重量比为：2.8:5.5:1，纯化剂的添加量为发酵液重量的0.20％。
(5)脱色：
将滤液用复合脱色剂进行脱色处理30分钟，过滤；
复合脱色剂各组分的质量份数为：活性炭30份、ADS-7大孔吸附树脂15份、D1400大孔吸附树脂15份、NKA-9型大孔吸附树脂10份，复合脱色剂的添加量为滤液重量的1.5％。
(6)干燥：
将脱色后的滤液进行干燥，得到土霉素干品，控制水分为5％；
(7)溶解结晶：
将蒸馏水搅拌并升温至58℃，加入盐酸调节pH值为6.0-6.5，继续升温至65℃，投入步骤(6)制得的土霉素干品，搅拌至土霉素全部溶解，再加入备好的DTAC，继续搅拌，继续加入称量好的氢氧化钙，料液pH值控制在9.0-10.0之间，结晶，静置，离心分离；
蒸馏水、土霉素干品、DTAC、氢氧化钙的重量比为：4.0:1:0.32:0.18。
(8)干燥：
将步骤(7)得到的湿成品装入双锥干燥器内，控制烘干温度90±5℃，真空度≤-0.07MPa，进行干燥，粉碎过筛，称重，分装即得土霉素季铵盐。
实施例3
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)孢子制备：
将龟裂链霉菌经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.4℃的温度、60％的相对湿度条件下培养5天后，挑选菌落正常无污染的孢子作为种子；
斜面培养基的各组分的质量份数为：麸皮15份、琼脂10份、水100份。
(2)种子制备：
将步骤(1)挑选得到的孢子接入一级种子罐，在34℃下培养至培养液为黄色，且培养液的pH值达到6.0-6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在34℃下扩大培养42h；
(3)发酵：
将步骤(2)得到的培养液在33℃下发酵140h，通氧量为1.1v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4-6.8之间；
在发酵的同时加入由烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的复合活性试剂，烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐的重量比为：4.5:1，复合活性试剂的添加量为培养液重量的0.6％。
(4)酸化和纯化：
用0.01mol/L的盐酸与0.1mol/L的草酸将步骤(3)所得发酵液调节至pH为1.70-1.74，随后向发酵液中加入纯化剂，搅拌后过滤，得到滤液；
纯化剂为硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷组成的复合试剂，硫酸锌、高铁酸钾、烷基糖苷的重量比为：3.0:5.7:1，纯化剂的添加量为发酵液重量的0.25％。
(5)脱色：
将滤液用复合脱色剂进行脱色处理40分钟，过滤；
复合脱色剂各组分的质量份数为：活性炭35份、ADS-7大孔吸附树脂20份、D1400大孔吸附树脂20份、NKA-9型大孔吸附树脂12份，复合脱色剂的添加量为滤液重量的2.0％。
(6)干燥：
将脱色后的滤液进行干燥，得到土霉素干品，控制水分为7％；
(7)溶解结晶：
将蒸馏水搅拌并升温至60℃，加入盐酸调节pH值为6.0-6.5，继续升温至68℃，投入步骤(6)制得的土霉素干品，搅拌至土霉素全部溶解，再加入备好的DTAC，继续搅拌，继续加入称量好的氢氧化钙，料液pH值控制在9.0-10.0之间，结晶，静置，离心分离；
蒸馏水、土霉素干品、DTAC、氢氧化钙的重量比为：4.5:1:0.35:0.20。
(8)干燥：
将步骤(7)得到的湿成品装入双锥干燥器内，控制烘干温度90±5℃，真空度≤-0.07MPa，进行干燥，粉碎过筛，称重，分装即得土霉素季铵盐。
实施例4
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)孢子制备：
将龟裂链霉菌经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.0℃的温度、58％的相对湿度条件下培养5天后，挑选菌落正常无污染的孢子作为种子；
斜面培养基的各组分的质量份数为：麸皮5份、琼脂8份、水100份。
(2)种子制备：
将步骤(1)挑选得到的孢子接入一级种子罐，在32℃下培养至培养液为黄色，且培养液的pH值达到6.0-6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在33℃下扩大培养42h；
(3)发酵：
将步骤(2)得到的培养液在32℃下发酵120h，通氧量为1.1v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4-6.8之间；
在发酵的同时加入由烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的复合活性试剂，烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐的重量比为：3.5:1，复合活性试剂的添加量为培养液重量的0.4％。
(4)酸化和纯化：
用0.01mol/L的盐酸与0.1mol/L的草酸将步骤(3)所得发酵液调节至pH为1.70-1.74，随后向发酵液中加入纯化剂，搅拌后过滤，得到滤液；
纯化剂为硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷组成的复合试剂，硫酸锌、高铁酸钾、烷基糖苷的重量比为：3.0:5.3:1，纯化剂的添加量为发酵液重量的0.20％。
(5)脱色：
将滤液用复合脱色剂进行脱色处理40分钟，过滤；
复合脱色剂各组分的质量份数为：活性炭25份、ADS-7大孔吸附树脂15份、D1400大孔吸附树脂20份、NKA-9型大孔吸附树脂8份，复合脱色剂的添加量为滤液重量的1.5％。
(6)干燥：
将脱色后的滤液进行干燥，得到土霉素干品，控制水分为7％；
(7)溶解结晶：
将蒸馏水搅拌并升温至55℃，加入盐酸调节pH值为6.0-6.5，继续升温至65℃，投入步骤(6)制得的土霉素干品，搅拌至土霉素全部溶解，再加入备好的DTAC，继续搅拌，继续加入称量好的氢氧化钙，料液pH值控制在9.0-10.0之间，结晶，静置，离心分离；
蒸馏水、土霉素干品、DTAC、氢氧化钙的重量比为：4.5:1:0.30:0.18。
(8)干燥：
将步骤(7)得到的湿成品装入双锥干燥器内，控制烘干温度90±5℃，真空度≤-0.07MPa，进行干燥，粉碎过筛，称重，分装即得土霉素季铵盐。
实施例5
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)孢子制备：
将龟裂链霉菌经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.2℃的温度、60％的相对湿度条件下培养4天后，挑选菌落正常无污染的孢子作为种子；
斜面培养基的各组分的质量份数为：麸皮10份、琼脂10份、水80份。
(2)种子制备：
将步骤(1)挑选得到的孢子接入一级种子罐，在33℃下培养至培养液为黄色，且培养液的pH值达到6.0-6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在34℃下扩大培养38h；
(3)发酵：
将步骤(2)得到的培养液在32.5℃下发酵140h，通氧量为0.9v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4-6.8之间；
在发酵的同时加入由烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的复合活性试剂，烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐的重量比为：4.0:1，复合活性试剂的添加量为培养液重量的0.6％。
(4)酸化和纯化：
用0.01mol/L的盐酸与0.1mol/L的草酸将步骤(3)所得发酵液调节至pH为1.70-1.74，随后向发酵液中加入纯化剂，搅拌后过滤，得到滤液；
纯化剂为硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷组成的复合试剂，硫酸锌、高铁酸钾、烷基糖苷的重量比为：2.5:5.5:1，纯化剂的添加量为发酵液重量的0.25％。
(5)脱色：
将滤液用复合脱色剂进行脱色处理20分钟，过滤；
复合脱色剂各组分的质量份数为：活性炭30份、ADS-7大孔吸附树脂20份、D1400大孔吸附树脂10份、NKA-9型大孔吸附树脂10份，复合脱色剂的添加量为滤液重量的2.0％。
(6)干燥：
将脱色后的滤液进行干燥，得到土霉素干品，控制水分为4％-7％；
(7)溶解结晶：
将蒸馏水搅拌并升温至58℃，加入盐酸调节pH值为6.0-6.5，继续升温至68℃，投入步骤(6)制得的土霉素干品，搅拌至土霉素全部溶解，再加入备好的DTAC，继续搅拌，继续加入称量好的氢氧化钙，料液pH值控制在9.0-10.0之间，结晶，静置，离心分离；
蒸馏水、土霉素干品、DTAC、氢氧化钙的重量比为：3.5:1:0.32:0.20。
(8)干燥：
将步骤(7)得到的湿成品装入双锥干燥器内，控制烘干温度90±5℃，真空度≤-0.07MPa，进行干燥，粉碎过筛，称重，分装即得土霉素季铵盐。
实施例6
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)孢子制备：
将龟裂链霉菌经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.4℃的温度、56％的相对湿度条件下培养4.5天后，挑选菌落正常无污染的孢子作为种子；
斜面培养基的各组分的质量份数为：麸皮15份、琼脂5份、水90份。
(2)种子制备：
将步骤(1)挑选得到的孢子接入一级种子罐，在34℃下培养至培养液为黄色，且培养液的pH值达到6.0-6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在32℃下扩大培养40h；
(3)发酵：
将步骤(2)得到的培养液在33℃下发酵110h，通氧量为1.0v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4-6.8之间；
在发酵的同时加入由烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的复合活性试剂，烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐的重量比为：4.5:1，复合活性试剂的添加量为培养液重量的0.2％。
(4)酸化和纯化：
用0.01mol/L的盐酸与0.1mol/L的草酸将步骤(3)所得发酵液调节至pH为1.70-1.74，随后向发酵液中加入纯化剂，搅拌后过滤，得到滤液；
纯化剂为硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷组成的复合试剂，硫酸锌、高铁酸钾、烷基糖苷的重量比为：2.8:5.7:1，纯化剂的添加量为发酵液重量的0.15％。
(5)脱色：
将滤液用复合脱色剂进行脱色处理30分钟，过滤；
复合脱色剂各组分的质量份数为：活性炭35份、ADS-7大孔吸附树脂10份、D1400大孔吸附树脂15份、NKA-9型大孔吸附树脂12份，复合脱色剂的添加量为滤液重量的1.0％。
(6)干燥：
将脱色后的滤液进行干燥，得到土霉素干品，控制水分为5％；
(7)溶解结晶：
将蒸馏水搅拌并升温至60℃，加入盐酸调节pH值为6.0-6.5，继续升温至62℃，投入步骤(6)制得的土霉素干品，搅拌至土霉素全部溶解，再加入备好的DTAC，继续搅拌，继续加入称量好的氢氧化钙，料液pH值控制在9.0-10.0之间，结晶，静置，离心分离；
蒸馏水、土霉素干品、DTAC、氢氧化钙的重量比为：4.0:1:0.35:0.16。
(8)干燥：
将步骤(7)得到的湿成品装入双锥干燥器内，控制烘干温度90±5℃，真空度≤-0.07MPa，进行干燥，粉碎过筛，称重，分装即得土霉素季铵盐。
对比例1(工艺参数不在本发明范围内)
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)孢子制备：
将龟裂链霉菌经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.5℃的温度、55％的相对湿度条件下培养4天后，挑选菌落正常无污染的孢子作为种子；
斜面培养基的各组分的质量份数为：麸皮20份、琼脂15份、水70份。
(2)种子制备：
将步骤(1)挑选得到的孢子接入一级种子罐，在30℃下培养至培养液为黄色，且培养液的pH值达到6.0-6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在35℃下扩大培养45h；
(3)发酵：
将步骤(2)得到的培养液在30℃下发酵150h，通氧量为1.2v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4-6.8之间；
在发酵的同时加入由烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的复合活性试剂，烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐的重量比为：5:1，复合活性试剂的添加量为培养液重量的0.7％。
(4)酸化和纯化：
用0.01mol/L的盐酸与0.1mol/L的草酸将步骤(3)所得发酵液调节至pH为1.70-1.74，随后向发酵液中加入纯化剂，搅拌后过滤，得到滤液；
纯化剂为硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷组成的复合试剂，硫酸锌、高铁酸钾、烷基糖苷的重量比为：2:6:1，纯化剂的添加量为发酵液重量的0.1％。
(5)脱色：
将滤液用复合脱色剂进行脱色处理40分钟，过滤；
复合脱色剂各组分的质量份数为：活性炭20份、ADS-7大孔吸附树脂25份、D1400大孔吸附树脂5份、NKA-9型大孔吸附树脂15份，复合脱色剂的添加量为滤液重量的2.5％。
(6)干燥：
将脱色后的滤液进行干燥，得到土霉素干品，控制水分为4％；
(7)溶解结晶：
将蒸馏水搅拌并升温至50℃，加入盐酸调节pH值为6.0-6.5，继续升温至60℃，投入步骤(6)制得的土霉素干品，搅拌至土霉素全部溶解，再加入备好的DTAC，继续搅拌，继续加入称量好的氢氧化钙，料液pH值控制在9.0-10.0之间，结晶，静置，离心分离；
蒸馏水、土霉素干品、DTAC、氢氧化钙的重量比为：3:1:0.4:0.3。
(8)干燥：
将步骤(7)得到的湿成品装入双锥干燥器内，控制烘干温度90±5℃，真空度≤-0.07MPa，进行干燥，粉碎过筛，称重，分装即得土霉素季铵盐。
对比例2(发酵过程中不加烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的活性试剂)
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
(3)发酵：
将步骤(2)得到的培养液在32℃下发酵110h，通氧量为0.9v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4-6.8之间；
过程中不加入由烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的复合活性试剂。
其余同实施例1。
对比例3(纯化过程中加硫酸锌和黄血盐)
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
(4)酸化和纯化：
用0.01mol/L的盐酸与0.1mol/L的草酸将步骤(3)所得发酵液调节至pH为1.70-1.74，随后向发酵液中加入纯化剂，搅拌后过滤，得到滤液；
纯化剂为硫酸锌、黄血盐组成的复合试剂，硫酸锌、黄血盐的重量比为：2.8:5.5，纯化剂的添加量为发酵液重量的0.20％。
其余同实施例2。
对比例4(仅采用活性炭进行脱色)
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
(5)脱色：
将滤液用脱色剂进行脱色处理40分钟，过滤；
脱色剂为活性炭，脱色剂的添加量为滤液重量的2.0％。
其余同实施例3。
对比例5(一般的现有技术：发酵过程中不加活性试剂，纯化过程中加硫酸锌和黄血盐，仅采用活性炭进行脱色)
一种土霉素季铵盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)孢子制备：
将龟裂链霉菌经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.0℃的温度、56％的相对湿度条件下培养4天后，挑选菌落正常无污染的孢子作为种子；
斜面培养基的各组分的质量份数为：麸皮5份、琼脂5份、水80份。
(2)种子制备：
将步骤(1)挑选得到的孢子接入一级种子罐，在32℃下培养至培养液为黄色，且培养液的pH值达到6.0-6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在32℃下扩大培养38h；
(3)发酵：
将步骤(2)得到的培养液在32℃下发酵110h，通氧量为0.9v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4-6.8之间；
(4)酸化和纯化：
用0.01mol/L的盐酸与0.1mol/L的草酸将步骤(3)所得发酵液调节至pH为1.70-1.74，随后向发酵液中加入纯化剂，搅拌后过滤，得到滤液；
纯化剂为硫酸锌、黄血盐组成的复合试剂，硫酸锌、黄血盐的重量比为：2.5:5.3，纯化剂的添加量为发酵液重量的0.15％。
(5)脱色：
将滤液用活性炭进行脱色处理20分钟，过滤；
活性炭添加量为滤液重量的1.0％。
其余同实施例1。
本发明并不局限于上述具体实施方式，本领域技术人员还可据此做出多种变化，但任何与本发明等同或者类似的变化都应涵盖在本发明权利要求的范围内。
各个实施例及对比例得到的土霉素季铵盐的效果如下表所示：
收率＝得到的土霉素季铵盐产品/步骤(6)得到的土霉素干品×100％。
脱色率＝(脱色步骤前吸光度-脱色步骤后吸光度)/脱色步骤前吸光度×100％。
表1本发明各个实施例及对比例制得的土霉素季铵盐产品效果
从上表数据可以看出，本发明的实施例1-6制得的土霉素季铵盐产品效果都优于对比例1(工艺参数不在本发明范围内)、对比例2(发酵过程中不加烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的活性试剂)、对比例3(纯化过程中加硫酸锌和黄血盐)、对比例4(仅采用活性炭进行脱色)、对比例5(一般的现有技术：发酵过程中不加活性试剂，纯化过程中加硫酸锌和黄血盐，仅采用活性炭进行脱色)，尤其以实施例2的效果最优。可见本发明在发酵过程中加入烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的活性试剂、用硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷进行发酵液的纯化，脱色步骤选用复合脱色剂，均对制得的土霉素季铵盐产品效果有影响，因此本发明采用了以上各个技术特征，协同作用，制得的土霉素季铵盐产品收率高及土霉素效价高，且脱色效果好，满足其在制药领域中的应用。
Claims (7)
1.一种土霉素季铵盐的制备方法，其特征为：包括以下步骤：
（1）孢子制备：
将龟裂链霉菌经无菌手续接入麸皮、琼脂和水组成的斜面培养基中，在36.0-36.4℃的温度、56-60％的相对湿度条件下培养4-5天后，挑选菌落正常无污染的孢子作为种子；
（2）种子制备：
将步骤（1）挑选得到的孢子接入一级种子罐，在32-34℃下培养至培养液为黄色，且培养液的pH值达到6.0-6.4后，将培养液移至二级种子罐，继续在32-34℃下扩大培养38-42h；
（3）发酵：
将步骤（2）得到的培养液在32-33℃下发酵110-140h，通氧量为0.9-1.1v/m，当培养液的pH＜6.4时，开始通入液氨，直至pH在6.4-6.8之间；
（4）酸化和纯化：
用0.01mol/L的盐酸与0.1mol/L的草酸将步骤（3）所得发酵液调节至pH为1.70-1.74，随后向发酵液中加入纯化剂，搅拌后过滤，得到滤液；
（5）脱色：
将滤液用复合脱色剂进行脱色处理20-40分钟，过滤；
（6）干燥：
将脱色后的滤液进行干燥，得到土霉素干品，控制水分为4%-7%；
（7）溶解结晶：
将蒸馏水搅拌并升温至55-60℃，加入盐酸调节pH值为6.0-6.5，继续升温至62-68℃，投入步骤（6）制得的土霉素干品，搅拌至土霉素全部溶解，再加入备好的DTAC，继续搅拌，继续加入称量好的氢氧化钙，料液pH值控制在9.0-10.0之间，结晶，静置，离心分离；
（8）干燥：
将步骤（7）得到的湿成品装入双锥干燥器内，控制烘干温度90±5℃，真空度≤-0.07MPa，进行干燥，粉碎过筛，称重，分装即得土霉素季铵盐；
在所述的步骤（3）中，在发酵的同时加入由烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐组成的复合活性试剂，烟酸和D-氨基葡萄糖盐酸盐的重量比为：3.5-4.5:1；
在所述的步骤（4）中，纯化剂为硫酸锌、高铁酸钾、十二烷基糖苷组成的复合试剂，硫酸锌、高铁酸钾、烷基糖苷的重量比为：2.5-3.0:5.3-5.7:1。
2.如权利要求1所述的一种土霉素季铵盐的制备方法，其特征为：在所述的步骤（1）中，斜面培养基的各组分的质量份数为：麸皮5-15份、琼脂5-10份、水80-100份。
3.如权利要求1所述的一种土霉素季铵盐的制备方法，其特征为：复合活性试剂的添加量为培养液重量的0.2-0.6%。
4.如权利要求1所述的一种土霉素季铵盐的制备方法，其特征为：纯化剂的添加量为发酵液重量的0.15-0.25%。
5.如权利要求1所述的一种土霉素季铵盐的制备方法，其特征为：在所述的步骤（5）中，复合脱色剂各组分的质量份数为：活性炭25-35份、ADS-7大孔吸附树脂10-20份、D1400大孔吸附树脂10-20份、NKA-9型大孔吸附树脂8-12份。
6.如权利要求5所述的一种土霉素季铵盐的制备方法，其特征为：复合脱色剂的添加量为滤液重量的1.0-2.0%。
7.如权利要求1所述的一种土霉素季铵盐的制备方法，其特征为：在所述的步骤（7）中，蒸馏水、土霉素干品、DTAC、氢氧化钙的重量比为：3.5-4.5:1:0.30-0.35:0.16-0.20。
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