CN102757975A - 一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法。揭示了一种通过在龟裂链霉菌中增加土霉素otrA基因或otrB基因的表达，保护龟裂链霉菌自身，提高土霉素产量的方法。所述方法获得的龟裂链霉菌的土霉素产量显著提高。

Description

一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法。

背景技术

微生物可对其产生抗性的抗生素现在已涵盖了我们所已知的绝大多数种类自然的或者合成的化合物。抗生素产生菌都含有能抵御自身产生的抗生素的抗性元件，这些元件大多位于抗生素生物合成基因簇，属于调控元件。环境中抗生素的存在使微生物在不生产最初抗生素的情况下也能从相近种属中获得或自主进化得到高特异性的抗性元件。因此，对于抗性基因的研究一直是人们的兴趣所在，尤其是抗生素产生菌的自我抗性机制。

要想对抗生素的自我抗性机制有详细深入的了解，先要清楚不同的抗生素在细胞内的作用位点。抗生素的作用机理大致有以下几种：1)，对细胞壁的形成有抑制作用，如青霉素，头孢菌素，磷霉素等；2)，影响细胞膜的功能，如多肽类抗生素；3)，抑制蛋白质合成，如红霉素，链霉素等；4)，干扰核酸代谢，如丝裂霉素，灰黄霉素等。对于作用于不同位置的抗生素，细胞采取了不同的抵御方式。

如前所述，抗生素产生菌自我保护机制可以细化到许多种类，大多数生产菌不是单一采用一种机制，而是几种机制共同起作用。龟裂链霉菌就是采用抗生素作用靶点的修饰和药物溢流两种方式来保护自身，免受土霉素(OTC)侵害，后者同时也是降低终产物抑制的有效手段。

然而，为了提高土霉素的产量，本领域还有必要进一步研究保护龟裂链霉菌自身，提高土霉素产量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法。

在本发明的第一方面，提供一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法，所述方法包括：在龟裂链霉菌中增加土霉素抗性基因otrA或otrB的表达。

在另一优选例中，在龟裂链霉菌中增加土霉素抗性基因otrB的表达。

在另一优选例中，在龟裂链霉菌中增加一个拷贝的土霉素抗性基因otrA或otrB。

在另一优选例中，所述方法包括：

(1)提供表达载体，所述表达载体中包含土霉素抗性基因otrA或otrB的序列；

(2)将表达载体转化龟裂链霉菌，选择基因组中整合有外源的土霉素抗性基因otrA或otrB序列的重组龟裂链霉菌。

在另一优选例中，所述的表达载体中，土霉素抗性基因otrA或otrB的序列的5’端，包括强启动子ermE。

在另一优选例中，所述的表达载体是pSET152载体。

在另一优选例中，步骤(2)中，将表达载体转化去甲基化菌株；从转化的菌株中提取去甲基化的表达载体转化龟裂链霉菌。

在本发明的另一方面，提供一种重组的龟裂链霉菌，其基因组中整合有外源的土霉素抗性基因otrA或otrB的序列。

在另一优选例中，所述的重组龟裂链霉菌是通过前面所述的方法制备获得。

在本发明的另一方面，提供一种生产土霉素的方法，所述方法包括：

培养所述的重组的龟裂链霉菌，从而生产土霉素。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、重组质粒pSET152-otrB。

图2、pSET152-otrB酶切鉴定图谱。Lane 1：分子量标记DL15000；Lane 2：NdeI消化的pSET152-otrB；Lane 3：XbaI&NdeI消化的pSET152-otrB。

图3、电击的转化子筛选平板。

图4、ET12567/pSET152-otrA、ET12567/pSET152-otrB转化子PCR鉴定。Lane1-7：otrA基因转入的重组菌株；Lane 8-9：阳性对照(PCR模板为空载pSET152质粒，带有apr)；Lane 10-16：otrB基因转入的重组菌株。Lane 17：分子量标记Marker III。

图5、重组菌株整合方式PCR鉴定图。A为整合otrA之后的重组菌株染色体示意图。B和C分别表示阳性重组菌株的PCR结果。

图6、平板实验筛选重组菌株。A为otrA基因增强重组菌株(SRI-A)；B为otrB基因增强重组菌株(SRI-B)。

图7、20株otrA和otrB增强重组菌株发酵结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，找到了一种通过在龟裂链霉菌中增加土霉素抗性基因otrA或otrB的表达，保护龟裂链霉菌自身，提高土霉素产量的方法。所述方法可提供土霉素产量50％以上。

所述的“龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)”是一种产土霉素的链霉菌，其可以从土壤中分离获得。其形态为：孢子丝螺旋形2～3圈，紧密，偶有松敞螺旋。孢子柱形，0.8×1.6～1×1.7微米。

所述的“土霉素”化学名称为：6-甲基-4-二甲氨基)-3，5，6，10，12，12a-六羟基-1，11-二氧代-1，4，4a，5，5a，6，11，12α-八氢-2-并四苯甲酰胺。分子式：C₂₂H₂₄N₂O₉。其为四环素类抗生素，是广谱抑菌剂。

所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本文所用，“otrA基因”或“otrB基因”是指一类编码膜蛋白的基因、或在严格条件下与所述基因序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达对龟裂链霉菌的土霉素产量具有显著的促进作用。该定义中还包含在严格条件下与“otrA基因”或“otrB基因”杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。

NCBI已公开了“otrA基因”或“otrB基因”的序列，例如“otrA基因”的序列参见GenBank登录号X53401.1所示；“otrB基因”的序列参见GenBank登录号AF061335.1所示。

本发明的“otrA基因”或“otrB基因”的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

为了增加龟裂链霉菌的土霉素产量，本发明人作了广泛地研究，找到了适合于进行改良的基因，并构建了相应的构建物。

因此，本发明提供了一种构建物，所述构建物包括：“otrA基因”或“otrB基因”的表达盒。所述的表达盒具备基因表达所需的所有元件(包括启动子、编码DNA以及终止子等)，从而可完整地表达出相应的蛋白。

通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性。优选的，本发明的表达载体上的选择性标记是安普霉素(apr)抗性基因。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主是龟裂链霉菌。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，例如磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。作为一种优选的方式，可用电转化的方法进行。

在本发明的实施例中，土霉素()OTC两个抗性基因otrA和otrB分别被克隆到链霉菌特异性整合质粒pSET152上，酶切鉴定后电击转化SRI感受态细胞，使其发生特异性整合。后以重组菌株基因组为模板，设计两组引物验证重组质粒整合方式。最后得到了龟裂链霉菌基因组上otrA或otrB基因增强的重组菌株。

本发明的主要优点在于：

本发明找到并验证了导致抗生素生物合成终止的原因，解决了土霉素产物对于龟裂链霉菌的反馈抑制，提高了抗生素产生菌自身抗性，从地提高抗生素产量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、pSET152-otrA/pSET152-otrB构建与去甲基化

根据龟裂链霉菌Streptomyces rimosus M4018(购自Pfize公司)中otrA、otrB基因序列设计引物，并在正向引物序列引入NdeI酶切位点，在反向引物序列引入XbaI酶切位点，具体引物为：

otrA正向：5′CGCCATATGATGAACAAGCTGAATCTGGG 3′(SEQ ID NO：2)；

otrA反向：5′GGAAGCTTTCTAGATCACACGCGCTTGAGC 3′(SEQ ID NO：3)。

otrB正向：5′CGCCATATGGTGTCATCCGCAAATCCG 3′(SEQ ID NO：4)；

otrB反向：5′CCAAGCTTGCTCTAGATCAGGCGTCCGACGC 3′(SEQ IDNO：5)。

以1μL Streptomyces rimosusM4018菌总DNA为模板进行DNA扩增反应。PCR反应的总体系为25μL，反应条件为：95℃预变性7min后开始循环，即94℃1min，58℃30s，72℃2min，进行30个循环，最后进行延伸，即72℃延伸7min。

otrA、otrB基因PCR产物分别用凝胶回收试剂盒回收，再将回收的PCR产物分别连接到pMD19T载体(Promega)上。16℃连接6h后转化大肠杆菌(E.coli)Top10感受态细胞，将细胞涂布在含100μg/mL Amp，24μg/mL IPTG，及40μg/mLX-gal的LB平板上37℃过夜培养。挑选阳性克隆进行DNA测序分析。将菌落于试管中扩培，以碱裂解法提取质粒，用NdeI和XbaI双酶切，用凝胶回收试剂盒回收带NdeI和XbaI酶切位点的otrA、otrB基因。

用NdeI和XbaI双酶切载体pSET152(链霉菌整合质粒，获自University ofStrathclyde，Glasgow，UK)，然后分别与获得的带NdeI和XbaI酶切位点的otrA或otrB基因进行连接反应。16℃过夜连接后，把连接产物分别转化到大肠杆菌(E.coli)Top10感受态细胞中，并涂布在含50μg/mL apr(Apramycin)的LB平板上过夜培养。挑取阳性克隆，扩培后提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后，将重组质粒转化去甲基化大肠杆菌ET12567(获自University of Strathclyde，Glasgow，UK)，并涂布在含50μg/mL apr的LB平板上过夜培养。经鉴定正确后保存于-20℃。

获得的重组质粒pSET152-otrB的示意图如图1；pSET152-otrA的图谱类似于图1，其中的otrB基因被otrA基因取代。

由于在otr基因上游引入了NdeI酶切位点，下游引入了XbaI酶切位点，因此将平板上长出的菌落进行扩培后，提取质粒用NdeI和XbaI进行双酶切鉴定，pSET152-otrB酶切分析图谱见图2。

实施例2、龟裂链霉菌工业菌电转化

将鉴定正确的大肠杆菌ET12567/pSET152-otrA或ET12567/pSET152-otrB扩培，提取去甲基化的质粒，电转龟裂链霉菌工业菌(购自山西大同同星抗生素有限公司)(SRI)感受态细胞，培养于含500μg/mL apr的TSA培养基(按照重量含：TSB 3％；Agar1.5％)上，培养3-7天。挑取转化子，提取基因组DNA，以其为模板进行PCR鉴定，经鉴定正确后保存于-20℃。

电转之后，30℃培养5-7天。转化有ET12567/pSET152-otrB的菌落生长状况如图3。

由于龟裂链霉菌工业菌基因组中没有Apramycin抗性基因，而阳性转化子则因重组质粒特异性整合到染色体上而获得了此抗性基因。因此，在NCBI上查找到Apramycin抗性基因序列，设计引物(引物序列F：5’-TGCAATACGAATGGCGAAAAG-3’(SEQ ID NO：6)和R：5’-TCGGCCCAGTTGACCCAGGG-3’(SEQID NO：7))，以重组菌的总DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物电泳图如图4。Apramycin抗性基因大小为750bp。

实施例3、重组菌整合方式鉴定

图5A所示为整合之后的重组菌株染色体示意图。如果重组质粒与基因组进行了正确的位点特异性重组，按照此图，设计attB-F&apr-R和otrA-F&attB-R两对鉴定引物对其整合方式进行分子鉴定，理论片段大小分别为2077bp和4600bp。图5B和C分别表示阳性重组菌株的PCR结果。

引物序列为：

attB-F：5’GTTCACCAACAGCTGGAGGC 3’(SEQ ID NO：8)；

apr-R：5’-TCGGCCCAGTTGACCCAGGG-3’(SEQ ID NO：9)。

otrA-F：5′CGCCATATGATGAACAAGCTGAATCTGGG 3′(SEQ ID NO：10)；

attB-R：5’CGTCATGCCCGCAGTGACC 3’(SEQ ID NO：11)。

如图5所示，表示重组菌株确实是按照本发明人预期的方式发生位点特异性重组的。

pSET152是链霉菌整合质粒，质粒上带有红霉素抗性基因启动子ermE，其序列如下(SEQ ID NO：1)：

gaattcggtaccagcccgacccgagcacgcgccggcacgcctggtcgatgtcggaccggagttcgaggtacgcggcttgcaggtcca

ggaaggggacgtccatgcgagtgtccgttcgagtggcggcttgcgcccgatgctagtcgcggttgatcggcgatcgcaggtgcacgc

ggtcgatcttgacggctggcgagaggtgcggggaggatctgaccgacgcggtccacacgtggcaccgcgatgctgttgtgggcacaa

tcgtgccggttggtaggatctgcagccaagctctggaccgcccccgactcctgaccgccggccatccgtgaccaccgctcagcacga

aggagaacagaccgtggcagccgccgccaagatcgccatgtccagtgtggcgcccagtcaccggcaggggggcagcacccgcgccct

gctgacgccgtcgtcggtgggtgcgacctccggagagctcggtacccggggatcctctaga

启动子ermE是能在链霉菌中组成型表达且比较强的启动子。pSET不含链霉菌复制起始位点，属于链霉菌自杀型载体，若不能整合到染色体上，将因不能在链霉菌中复制而丢失。pSET152与基因组的位点特异性重组是依靠来自链霉菌噬菌体的ФC31整合酶发挥作用的。链霉菌温敏型噬菌体ФC31的整合酶基因是丝氨酸重组酶家族中的一员，这种酶能准确地识别细菌附着位点(attB)和噬菌体附着位点(attP)，进而介导整合。attB和attP最小活性序列长度分别为34和39bp。经过位点特异性整合生成2个杂合位点attL与attR，attL与attR没有显著的DNA重复，不能作为整合酶重组的底物，反应是单向不可逆的。ФC31-int催化作用具有自主作用的特点，不需要外界的化学能源、蛋白质辅助因子或者特殊的DNA拓扑结构。

实施例4、土霉素(OTC)生产实例

将去甲基化重组质粒(pSET152-otrA或pSET152-otrB)电转化龟裂链霉菌工业菌感受态细胞以后，培养在含有500μg/mL Apramycin抗生素的TSA平板上，待长出菌落后，再生长两天，用扁平竹签将菌落表面的灰白色孢子轻轻刮下，均匀规律地点至另一块已划分好区域的TSA平板上。otrA基因增强重组菌株(SRI-A)共挑出85株，otrB基因增强重组菌株(SRI-B)共挑出120株。如图6所示为部分平板背面示意图。

土霉素属于四环素类抗生素，此类抗生素产生菌在生长的稳定期，次级代谢产物的合成常常伴有其他较深颜色色素的产生，所以观察平板背面菌落的颜色，可以在一定程度上表明菌体抗生素合成的情况。依据这样的原则，挑选背面颜色较深的SRI-A和SRI-B各10株，以未转化的龟裂链霉菌工业菌为对照(SRI)进行发酵试验，每株菌平行做3瓶以减小试验误差。

发酵试验的过程：500mL摇瓶发酵，装液量1％(v/v)，接种量1％，30℃，260rpm培养8天，培养基为常规工业配方(购自山西大同同星抗生素有限公司)。

发酵结束后测定发酵液中土霉素的终浓度，各重组菌株的试验结果见图7。

从图中各菌株土霉素产量比较可以看出，所挑选的10株otrA增强重组菌株OTC产量与原始菌株相比均无明显变化；而otrB基因增强重组菌株有80％土霉素产量均较原始菌株有显著的提高，且B-80菌株OTC产量较原始菌株提高了73.7％。

从这一结果可以看出，otrA基因的增强大体上对龟裂链霉菌工业菌土霉素的产量没有明显影响，而otrB基因的增强却能在一定程度上提高土霉素产量。

结论与总结

在细胞代谢网络中，有很多对细胞生长或者对次级代谢产物产生具有正向调节作用的因子。本发明人在对这些细胞进行基因改造时，总是试图增强这些调节因子的表达，使其更利于产物的合成。通常采用的方法包括在基因上游加入强启动子，增加这些调节因子的应答元件的供应量，以及最常用的特异性重组等。本发明利用带有ermE强启动子的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pSET152，构建带有土霉素抗性基因的重组质粒，再将其导入SRI基因组中，利用质粒上的attP位点与基因组上的attB位点发生位点特异性重组，使SRI基因组中的土霉素抗性基因增加一个拷贝，且这个拷贝是在强启动子的调控之下的。

我们知道，细胞不能无限制的合成次级代谢产物，抗生素合成的中止不是由于其产生菌细胞体失去活力，而是以下三种可能的原因使其终止：1)抗生素生物合成途径中一个或更多的酶发生了不可逆衰退；2)胞内积累的抗生素产生了较强的反馈抑制作用；3)抗生素生物合成所需前体的耗竭。如果能克服其中导致抗生素生物合成终止的原因，那么可以预测细胞将源源不断的合成所需要的抗生素，这对于实际生产应用是相当有利的。而本发明所做的研究正是试图解决产物的反馈抑制，提高抗生素产生菌自身抗性，从而提高抗生素产量。

细胞对抗生素具有与生俱来的抗性，这一特性不仅限于抗生素产生菌，许多细菌和真菌也会在长期进化过程中形成对某些抗生素的抗性，这就形成了所说的耐药性。

抗生素普遍存在于环境中(尤其是土壤环境中)，对细菌的生存造成了压力。在长期的进化过程中，抗生素耐药基因在细菌中已经普遍存在。在非抗生素产生菌中，抗生素耐药基因的表达主要是为了应对环境的抗生素压力，而抗生素产生菌(如链霉菌)除了受到环境中的抗生素压力外，还首当其冲地受到自身所产生的抗生素的压力，因而其抗生素耐药基因的表达与调控机制就比非抗生素产生菌复杂，抗生素耐药基因参与了抗生素的合成调控，以确保抗生素耐药性的及时表达，从而免受自身抗生素的破坏。

在细菌中，至少存在以下几种抗生素耐药机制：(1)合成钝化抗生素的酶，如弗氏链霉菌的氨基糖苷耐药性主要通过产生催化抗生素共价修饰的酶；(2)改变细菌细胞膜结构，如膜蛋白的缺失或变异、内膜渗透性的改变等；(3)通过主动排出机制降低细胞内的抗生素积累，如抗生链霉菌(S.an tibioticus)oleC基因所控制的竹桃霉素主动外排；(4)改变核糖体靶位，如从卡那霉素产生菌卡那霉素链霉菌(S.kana2my ceti2cus)中分离得到的一种诱导性卡那霉素耐药基因通过修饰核糖体，调节蛋白质合成，可以赋予浅青紫链霉菌、淡紫灰链霉菌(S.lavend u lae)和微小链霉菌卡那霉素耐药性；(5)改变靶酶，如青霉素结合蛋白；(6)过量合成靶酶；(7)存在抗生素抑制的旁路。

有研究表明，抗生素合成基因与耐药基因具有协调表达的效应。主要表现在：1)抗生素耐药基因一般早于抗生素合成而表达，耐药基因可能具有双重功能，首先它能够使抗生素产生菌免于自身抗生素的破坏；其次，它又是激活抗生素合成基因的调节环路中的一个重要成分，这确保了耐药性的建立早于抗生素的合成；2)细胞大多具有诱导耐药性；3)抗生素合成基因与耐药基因的协调表达。一些链霉菌具有2种或更多的抗生素耐药机制，至少有1种耐药基因与抗生素合成基因紧密连锁。抗生素高产菌株的筛选也伴随着耐药水平的增加，反之亦然。所以研究抗生素耐药基因对于实际生活和生产具有十分重要的意义：1)，有助于阐明抗生素合成调控的途径；2)，用作载体选择标记；3)减少基因污染；4)先分离耐药基因，再分离合成基因簇，已经成为一个经典的克隆策略；5)筛选高耐药菌株以分离抗生素高产菌株；6)应用于药物设计。

土霉素抗性基因保护SRI不被自身产生的OTC所损伤。但是这种保护有一定的限度。当胞内OTC达到一定浓度时，otrB蛋白的相对不足会导致OTC不能及时被运送到胞外，从而造成胞内OTC的过量积累，同时未被otrA蛋白修饰过的核糖体便会成为多余OTC攻击的目标，这样便对自身造成了损伤。当本发明人将SRI中抗性基因的拷贝数和表达增强以后，额外的保护蛋白就能弥补这些不足。另外，由于OTC是一系列复杂生物反应合成的产物，合成过程中酶的酶活会受到终产物OTC的反馈抑制。也即当OTC生产到一定量时，会将产物已充足的信息反馈给细胞代谢调节因子，这些因子会进一步降低产物合成的酶活，这样不仅可以防止过量产物可能对菌体造成的损害，又能节约细胞内的资源，使底物都得到充分利用。由于otrB编码的膜蛋白可将OTC运送至胞外，将此基因过量表达后，便能将更多的OTC运送至胞外，使胞内OTC一直维持在较低水平，可有效解除或降低反馈抑制。

链霉菌一般都对自身产生的抗生素具有耐受性，然而对不同种类链霉菌所产生的抗生素可能敏感。抗生素生物合成基因簇中包含抗生素耐药基因，这些耐药基因所表达的耐药机制对该基因簇所编码合成的抗生素具有很强的选择性。耐药水平与抗生素合成水平呈正相关，抗生素产生能力的提高应该是抗生素合成调控基因的超量表达。这说明表达抗生素耐药性的酶是抗生素生物合成途径的限速酶。

综上，本发明以增强抗生素产生菌自身抗性为主线，结合龟裂链霉菌工业菌株高生产性能，分别将SRI中两个抗性基因增强，得到了OTC高产菌株。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法，其特征在于，所述方法包括：在龟裂链霉菌中增加土霉素抗性基因otrA或otrB的表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在龟裂链霉菌中增加土霉素抗性基因otrB的表达。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在龟裂链霉菌中增加一个拷贝的土霉素抗性基因otrA或otrB。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供表达载体，所述表达载体中包含土霉素抗性基因otrA或otrB的序列；

(2)将表达载体转化龟裂链霉菌，选择基因组中整合有外源的土霉素抗性基因otrA或otrB序列的重组龟裂链霉菌。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的表达载体中，土霉素抗性基因otrA或otrB的序列的5’端，包括强启动子ermE。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的表达载体是pSET152载体。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将表达载体转化去甲基化菌株；从转化的菌株中提取去甲基化的表达载体转化龟裂链霉菌。

8.一种重组的龟裂链霉菌，其特征在于，其基因组中整合有外源的土霉素抗性基因otrA或otrB的序列。

9.如权利要求8所述的龟裂链霉菌，其特征在于，其是通过权利要求1-7任一所述的方法制备获得。

10.一种生产土霉素的方法，其特征在于，所述方法包括：

培养权利要求8或9所述的重组的龟裂链霉菌，从而生产土霉素。

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