CN102965315A

CN102965315A - 一种龟裂链霉菌突变株及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102965315A
Application number: CN2012104693490A
Authority: CN
Inventors: 齐巧娟; 赵丽红
Original assignee: HEBEI SHENGXUE DACHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HEBEI SHENGXUE DACHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2012-11-20
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2032-11-20
Also published as: CN102965315B

Abstract

本发明提供了一种龟裂链霉菌（Streptomycesfungicidious）突变菌株DC461，其保藏号是CGMCCNo.5811，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏日期是2012年2月27日。本发明还提供了上述菌株的制备方法以及上述菌株在土霉素生产中的应用。本发明所述突变菌株DC461能耐高浓度消泡剂，还能够提高土霉素的生产水平。

Description

一种龟裂链霉菌突变株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于制备四环素类抗生素的菌株，具体地说涉及一种龟裂链霉菌突变株及其制备方法和其在土霉素生产中的应用。

背景技术

土霉素（Terramycin）也称“地霉素”或“氧四环素”，是第二个被发现的四环素类广谱抗生素，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、支原体、衣原体、立克次体引起的感染有效，还可用于治疗梨形虫病、附红细胞体病。土霉素是由龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）发酵产生的。目前在发酵生产土霉素时，由于出发菌株的选用以及土霉素菌体生长、代谢等因素的影响，发酵液中很容易形成稳定且难以消除的泡沫。这些泡沫不仅妨碍发酵液的通气和搅拌，还容易造成发酵液溢出，从而导致染菌或发酵异常。为了解决这一问题，目前普遍采用添加0.001~0.05%（质量体积比浓度）消泡剂的方法，以此抑制发酵泡沫。但该方法的消泡效果并不理想。如果增加消泡剂浓度，虽然能够进一步增强消泡效果，但高浓度消泡剂会对龟裂链霉菌菌株的生长和代谢产生不良影响；特别是当消泡剂用量大于0.1%（质量体积比浓度）时，就会对菌株产生明显的抑制作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够耐受高浓度消泡剂的、高产土霉素的龟裂链霉菌突变菌株；同时本发明提供一个上述菌株的制备方法；以及提供上述菌株在土霉素生产中的应用。

为实现本发明目的，本发明提供了一种龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）突变菌株DC461（以下简称DC461），其保藏号是CGMCC No.5811，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会（CGMCC），保藏日期是2012年2月27日。

本发明所提供的DC461其微生物学特征如下：

单菌落的形态为：菌落呈梅花状，直径3-5mm，孢子白色、丰富。显微镜下观察，孢子呈圆形或椭圆形。

本发明还提供了DC461的制备方法，包括以下步骤：

a、斜面培养：将龟裂链霉菌的出发菌株接种至麸皮斜面培养基中，于32-40℃、相对湿度30-60%条件下培养48-120 h后，再于25-35℃、相对湿度25-65%条件下培养20-40 h；

更优选的培养条件是先在36.5~37.5℃、相对湿度30~60%条件下培养70-85 h，然后再于29.5-30.5℃、相对湿度25-65%条件下培养20-30 h；

b、种子培养：将斜面培养后的菌株转接至种子培养基中，在25-35℃，190-240 rpm振荡培养25-30h；更优选的培养条件是在29.5-30.5℃，相对湿度25~65%，190-240 rpm振荡培养26-28 h。

c、发酵培养：将种子培养后的菌株转接至含有消泡剂的发酵培养基A中，在25-35℃，190-240 rpm振荡培养24-120 h，得到发酵液A。

其中所述含有消泡剂的发酵培养基A，其配方为，消泡剂0.001-1.5g，淀粉8-20g、豆粉0.5-5.0g、碳酸钙0.1-3.0g、硫酸铵0.1-3.0g、氯化钠0.3-0.8g、玉米浆0.2-0.8g、磷酸二氢钾0.001-0.03g、氯化钴0.001-0.1g、淀粉酶0.008-0.02g，加水至100ml；

所述发酵培养更优选的条件是在29.5-30.5℃，相对湿度25-65%，190-240 rpm振荡培养48-96 h；

d、紫外诱变：取发酵液A于灭菌的培养皿中，于波长254nm紫外灯下照射60-120 s，稀释至100-500个菌丝/mL，涂布在固体培养基上，在32-40℃，相对湿度30-60%条件下培养96-216 h，得到若干单菌落；更优选的培养条件是在温度36.5-37.5℃、相对湿度30-60%条件下培养110-145 h；

e、菌株筛选：分别挑取上述单菌落，单独进行培养、发酵，其方法为依次采用a步骤所述方法进行斜面培养、按照b步骤所述方法进行种子培养，然后转接至c步骤所述含有发泡剂的发酵培养基A中，于25-35℃，190-240 rpm震荡培养72-192 h，发酵。分别检测发酵液中土霉素效价，效价最高的发酵液对应的单菌落中的菌株即为本发明所述龟裂链霉菌突变菌株DC461。

更优选的培养条件是在29.5-30.5℃，相对湿度30-65%，190-240 rpm振荡培养120-168 h。

本发明创造性地采用高浓度消泡剂作为诱变条件之一，与紫外线辐照诱变技术相结合，获得了一株龟裂链霉菌突变菌株DC461。该菌株不仅能高产土霉素，还能耐高浓度消泡剂。采用该菌株生产土霉素时，可以增加消泡剂的用量至0.5-1.5%（质量体积比百分浓度），从而能够有效减少发酵液中的泡沫，不仅能防止发酵液溢出，还能提高发酵液的通气性、改善发酵条件。

本发明所述消泡剂可选用有机硅消泡剂、聚醚型消泡剂、硅和醚接枝、含胺和酰胺类消泡剂等。其中，优选聚醚型消泡剂，特别优选泡敌。聚醚类消泡剂是聚氧丙烯、聚氧乙烯在引发剂存在下的嵌段聚合物，属于非离子型表面活性剂，具有优异的消泡、抑泡功能，并且不会对人畜产生毒害。该类消泡剂可从市场销售渠道获得。

本发明优选的培养基配方如下：

所述麸皮斜面培养基，其配方为，以质量体积比浓度计，麸皮3-10%，琼脂1-3%，其余为水。

所述种子培养基，其配方为，以质量体积比浓度计，淀粉2-6%、豆粉0.1-0.8%、碳酸钙0.1-0.5%、硫酸铵0.2-0.5%、氯化钠0.3-0.8%、玉米浆0.2-0.8%、磷酸二氢钾0.001-0.03%，其余为水。

所述固体培养基，其配方为，以质量体积比浓度计成分淀粉2-6%、碳酸钙0.1-0.5%、硫酸铵0.2-0.5%、氯化钠0.3-0.8%、玉米浆0.2-0.8%、琼脂1-3%，其余为水。

本发明提供了龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）DC461在土霉素生产中的应用。

其在应用时的优选条件是：将所述龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）DC461接种至发酵培养基中，在25-35℃，190-240 rpm条件下发酵72-192 h，制得含有土霉素的发酵液。

其在应用中所述发酵培养基，优选配方为，淀粉8-20g、豆粉0.5-5.0g、碳酸钙0.1-3.0g、硫酸铵0.1-3.0g、氯化钠0.3-0.8g、玉米浆0.2-0.8g、磷酸二氢钾0.001-0.03g、氯化钴0.001-0.1g、淀粉酶0.008-0.02g、消泡剂0.5g，加水至100ml。

本发明所述的龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）DC461的制备方法操作简单、结果可靠，由菌株复试和稳定性考察结果可知，本发明所获得的突变菌株具有良好的传代稳定性，并且具有良好的抗消泡剂的作用。

具体实施方式

下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。

下述实施例所述龟裂链霉菌出发菌株由河北圣雪大成制药有限责任公司提供，该出发菌株是由购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的龟裂链霉菌经培养、筛选得到的。

实施例1龟裂链霉菌突变菌株的制备

a、斜面培养：将龟裂链霉菌出发菌株活化接种至预先制备好的麸皮斜面培养基中，首先在32-35℃、相对湿度30-40%条件下培养48-60 h，然后再于25-30℃、相对湿度25-35%条件下培养20-25 h。

本实施例制备的麸皮斜面培养基的配方为：麸皮30g，琼脂10g，加水至1000ml；其制备方法为常规方法。

b、种子培养：将斜面培养后的菌株转接至预先制备好的种子培养基中，在25-28℃，190-200 rpm振荡培养25-27 h。

本实施例制备的种子培养基的配方为：淀粉20g、豆粉1g、碳酸钙1g、硫酸铵2g、氯化钠3g、玉米浆2g、磷酸二氢钾0.01g，加水至1000ml。其制备方法为常规方法。

c、发酵培养：将种子培养后的菌株转接至预先制备好的含有有机硅消泡剂的发酵培养基A中，在25-28℃，190-200 rpm振荡培养24-48 h，得到发酵液A。

本实施例制备的含有有机硅消泡剂的发酵培养基A的配方为：有机硅消泡剂0.01g、淀粉80g、豆粉5g、碳酸钙1g、硫酸铵1g、氯化钠3g、玉米浆2g、磷酸二氢钾0.01g、氯化钴0.01g、淀粉酶0.08g，加水1000ml。其制备方法为常规方法。

d、紫外诱变：取上述发酵液A于灭菌的培养皿中，于波长254nm紫外灯下照射60s，稀释至100-500个菌丝/mL，涂布在预先制备的固体培养基上，在32-35℃，相对湿度30-40%条件下培养96h，得到若干单菌落；

本实施例制备的固体培养基其配方为，淀粉20g、碳酸钙1g、硫酸铵2g、氯化钠3g、玉米浆2g、琼脂10g，加水至1000ml。其制备方法为常规方法。

e、菌株筛选：分别挑取上述单菌落，单独进行培养、发酵。其方法为采用a步骤所述方法进行斜面培养、按照b步骤所述方法进行种子培养，然后转接至c步骤所述含有消泡剂的发酵培养基A中，于25-35℃，190-200 rpm震荡培养72 h，发酵；分别检测不同单菌落所制备的发酵液中土霉素效价，效价最高为15638U/mL，将该效价的发酵液所对应单菌落中的菌株命名为DC461。

DC461菌株单菌落的形态为：菌落呈梅花状，直径3-5mm，孢子白色、丰富。显微镜下观察，孢子呈圆形或椭圆形。

对DC461进行砂土保藏：向保存有DC461菌株的斜面培养基中加入1 mL无菌水，用接种针将孢子刮下，摇匀后取0.2 mL转移至空白砂土管中，注明菌株名称、制备日期和有效期，在压强为-750~-760 mmHg柱下抽真空4-6 h，密封后置于装有变色硅胶的干燥器中，于2-8℃冰箱保存。保藏号为CGMCC No.5811（中国微生物菌种保藏管理委员会），保藏日期2012年2月27日。

实施例2 突变菌株的复试及稳定性考察

菌株复试：取实施例1中保藏DC461的砂土管，接种至实施例1制备的麸皮斜面培养基上，于32-40℃、相对湿度30-60%条件下培养48-120 h后，再于25-35℃、相对湿度25-65%条件下培养20-40 h，用接种铲挖取约0.5×0.5 cm²菌层接种至实施例1制备的种子培养基上，于28.0±0.5℃，220 rpm条件下震荡培养26-30 h后，转接至实施例1制备的含有消泡剂的发酵培养基A上，于25-35℃，190-240 rpm振荡培养72-192h，测定发酵液中土霉素的效价，结果为16016 U/mL。此结果表明DC461菌株活性良好，并具有高产和抗消泡剂的的特性。

稳定性考察：取实施例1中保藏DC461的砂土管，接种至上述麸皮斜面培养基上，首先在32-40℃、相对湿度30-60%条件下培养48-120 h后，然后在25-35℃、相对湿度25-65%条件下培养20-40 h，再次接种于上述斜面培养基上，进行培养，如此重复，连续转接三次后，转接至上述种子培养基上，于28.0±0.5℃，220 rpm条件下震荡培养26-30 h后，转接至上述发酵培养基A中，于25-35℃，190-240 rpm振荡培养72-192 h，检测发酵液中土霉素的效价，三代菌株所对应的土霉素效价分别为15971 U/mL、16058 U/mL、16255 U/mL。此结果表明DC461具有传代稳定性。

实施例3 DC461在土霉素生产中的应用

取实施例1中筛选出的菌株DC461作为发酵菌株，接种于发酵培养基中，在25-28℃，190-rpm条件下发酵120h。该发酵培养基的总体积为10L，其中淀粉1200g、豆粉200g、碳酸钙150g、硫酸铵150g、氯化钠40g、玉米浆40g、磷酸二氢钾1g、氯化钴0.1g、淀粉酶1.2g、聚醚型消泡剂50g，其余为水。发酵完成后，取发酵液，在10000rpm条件下，离心5min，取上清液，检测其中的土霉素效价，结果为15776U/mL。此结果表明，本发明筛选得到的菌株DC461可用于土霉素的生产。

本实例的发酵液中，消泡剂的浓度增至0.5%，发酵液中的泡沫明显减少，表明本发明所述龟裂链霉素具有耐高浓度消泡剂的优点。

对比实施例

以实施例1中的出发菌株为发酵菌株，采用等同于实施例1所述方法进行发酵。取发酵液，在10000rpm条件下，离心5min，取上清液，检测其中的土霉素效价，结果为730U/mL。

比较实施例5与本实施例所得发酵液中土霉素效价可知，与市售菌株相比，本发明所述DC461菌株的耐消泡剂能力提高了21.6倍；与现有的生产工艺中土霉素产率相比，提高了9.0%。上述结果表明，本发明所述突变菌株对高浓度消泡剂具有良好的适应性，并且提高了土霉素的生产能力。

Claims

1.一种龟裂链霉菌突变菌株，其特征在于：其分类名称是龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）DC461，保藏单位是CGMCC，保藏号是CGMCC No.5811，保藏日期是2012年2月27日。

2.权利要求1所述龟裂链霉菌突变菌株的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

b、种子培养：将斜面培养后的菌株转接至种子培养基中，在25-35℃，190-240 rpm振荡培养25-30 h；

c、发酵培养：将种子培养后的菌株转接至含有消泡剂的发酵培养基A中，在25-35℃，190-240 rpm振荡培养24-120 h，得到发酵液A，其中所述含有消泡剂的发酵培养基A，其配方为，消泡剂0.001-1.5g，淀粉8-20g、豆粉0.5-5.0g、碳酸钙0.1-3.0g、硫酸铵0.1-3.0g、氯化钠0.3-0.8g、玉米浆0.2-0.8g、磷酸二氢钾0.001-0.03g、氯化钴0.001-0.1g、淀粉酶0.008-0.02g，加水至100ml；

d、紫外诱变：取发酵液A于灭菌的培养皿中，于波长254nm紫外灯下照射60-120s，稀释至100-500个菌丝/mL，涂布在固体培养基上，在32-40℃，相对湿度30-60%条件下培养96-216 h，得到若干单菌落；

e、菌株筛选：分别挑取上述单菌落，单独进行培养、发酵，其方法为依次采用a步骤所述方法进行斜面培养、按照b步骤所述方法进行种子培养，然后转接至c步骤所述含有消泡剂的发酵培养基A中，于25-35℃，190-240 rpm震荡条件下发酵72-192 h；分别检测发酵液中土霉素效价，效价最高的发酵液对应的单菌落中的菌株即为龟裂链霉菌突变菌株DC461。

3.根据权利要求2所述龟裂链霉菌突变菌株的制备方法，其特征在于所述消泡剂为聚醚型消泡剂。

4.根据权利要求2或3所述龟裂链霉菌突变菌株的制备方法，其特征在于所述麸皮斜面培养基，其配方为，以质量体积比浓度计，麸皮3-10%，琼脂1-3%，其余为水。

5.根据权利要求2或3所述龟裂链霉菌突变菌株的制备方法，其特征在于所述种子培养基，其配方为，以质量体积比浓度计，淀粉2-6%、豆粉0.1-0.8%、碳酸钙0.1-0.5%、硫酸铵0.2-0.5%、氯化钠0.3-0.8%、玉米浆0.2-0.8%、磷酸二氢钾0.001-0.03%，其余为水。

6.根据权利要求2或3所述龟裂链霉菌突变菌株的制备方法，其特征在于所述固体培养基，其配方为，以质量体积比浓度计：淀粉2-6%、碳酸钙0.1-0.5%、硫酸铵0.2-0.5%、氯化钠0.3-0.8%、玉米浆0.2-0.8%、琼脂1-3%，其余为水。

7.权利要求1所述的龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）DC461在土霉素生产中的应用。

8.根据权利要求7所述龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）DC461在土霉素生产中的应用，其特征在于：将所述龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）DC461接种至发酵培养基中，在25-35℃，190-240 rpm条件下发酵72-192 h，制得含有土霉素的发酵液。

9.根据权利要求8所述龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）DC461在土霉素生产中的应用，其特征在于所述发酵培养基，其配方为：淀粉8-20g、豆粉0.5-5.0g、碳酸钙0.1-3.0g、硫酸铵0.1-3.0g、氯化钠0.3-0.8g、玉米浆0.2-0.8g、磷酸二氢钾0.001-0.03g、氯化钴0.001-0.1g、淀粉酶0.008-0.02g、消泡剂0.5%，加水至100ml。