CN104611280A - 一种快速选育土霉素菌种的方法 - Google Patents

一种快速选育土霉素菌种的方法 Download PDF

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Abstract

一种快速选育土霉素菌种的方法，包括以下步骤：a、试管斜面陪养，b、孢子悬液的制备，c、分离培养，d、发酵培养，e、菌株复试。通过将分离培养得到的单菌落直接接种到发酵培养基中发酵培养，不仅筛选得到的土霉素的效价高，更有意义是将单菌落效价验证时间缩短为48-50h，大大提高了工作效率。

Description

一种快速选育土霉素菌种的方法
技术领域
本发明属于土霉素菌种选育的技术领域，具体涉及一种快速选育土霉素菌种的方法。
背景技术
土霉素(Spectniomycni)是龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)有氧发酵后生成的次级代谢产物，为四环类广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较强的抑制能力，对多种球菌和杆菌有抗菌作用，对立克次体和阿米巴病虫也有抑制作用，用来治疗上呼吸道感染、胃肠道感染、斑疹伤寒、恙虫病、支原体和衣原体属感染等疾病。
土霉素主要用做畜禽用药及饲料添加剂，此外，以土霉素为原料生产半合成抗生素的市场前景较好，比如用其合成的强力霉素(多西霉素)，其市场价格是土霉素的5-7倍，用其为原料生产的美他环素，临床效果优于土霉素，很多企业将土霉素、维生素B1、维生素B6等组成复方土霉素，能使土霉素疗效增加，还能降低消化道副反应，是良好的动物饲料添加剂。因此，对土霉素菌株的选育和研究具有很好的经济效益和社会效益。
现有技术中在选育高产量和高通量的土霉素菌株时，采用的方法是：斜面-孢子悬液-孢子悬液预处理-分离培养基-斜面-种瓶培养基-发酵培养基。例如专利申请号为201410087566.2的专利《一种土霉素高产菌株及其高通量筛选方法》中即为这种方法，其在制备了种子悬浮液之后还用0.5-1.5uL亚硝基胍溶液对种子悬浮液进行处理，之后才进行分离培养，而在分离培养之后，将分离培养得到的单菌落又经过了斜面培养基的培养和种子摇瓶的培养才进行发酵培养，通过这种筛选方法其验证周期长，影响筛选效率，操作麻烦，筛选通量小，高产菌株的筛出概率低。
发明内容
本发明为了解决现有技术中土霉素工业菌种的筛选周期长，影响工作效率的技术问题，提供了一种快速选育土霉素菌种的方法。
本发明为实现其目的采用的技术方案是：
一种快速选育土霉素菌种的方法，包括以下步骤：
a.试管斜面培养：将土霉素生产菌株砂土孢子接种于试管斜面培养基中，在温度37.0±0.5℃，湿度40％-60％的条件下培养3-5天，得到斜面孢子；
b.孢子悬液制备：向步骤a试管斜面培养基中加入无菌水，将步骤a得到的斜面孢子刮下，混匀，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使孢子浓度为1012-1014个/mL；
c.分离培养：将步骤b所得的孢子悬液用无菌水稀释至101-107倍，稀释液涂布在分离培养基上，于温度37.0±0.5℃，湿度40％-60％的条件下暗培养3-5天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；
d.发酵培养：在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到25mL发酵培养基中，于32.0±0.5℃，湿度为40-60％，转速为200-220rpm条件下震荡培养48-50h，生长到周期后检测发酵液中土霉素含量，选高于效价500U/mL的菌株进行砂土干燥保藏；
e.菌株复试：取步骤d沙土干燥保藏的菌株转接试管斜面培养基，于37.0±0.5℃，40％-60％湿度条件下培养3-5天，得斜面孢子，将所得的斜面孢子转接至种子培养基中，于30.0±0.5℃，220rpm条件下震荡培养24-30h，将培养好的种液转接至复试用发酵培养基中，于30.0±0.5℃，200-220rpm条件下震荡培养5-7天，取样检测效价。
所述的试管斜面培养基按质量百分比的组成为：6.0％-7.0％麸皮，2.0％-2.5％琼脂。
所述的步骤a中，湿度为45％-55％，培养时间为4天。
所述的步骤c中，分离培养基按质量百分比的组成为：2.0％-3.0％玉米淀粉，0.2％-0.5％玉米浆，0.1％-0.3％硫酸铵，0.1％-0.5％碳酸钙，0.3％-0.5％氯化钠，2.0％-2.5％琼脂。
所述的步骤c中，湿度为45％-55％，培养时间为4天。
所述步骤d中，发酵培养基按质量百分比的组成为：4％-5％玉米淀粉，0.1％-0.2％玉米浆，0.5％-1.0％黄豆粉，0.2％-0.3％硫酸铵，0.2％-0.3％碳酸钙，0.1％-0.2％氯化钠，0.01％-0.02％磷酸二氢钾。
所述步骤d中，湿度为45-55％，转速为220rpm，震荡培养49h。
所述步骤e中，种子培养基按质量百分比的组成为：2.0％-3.0％玉米淀粉，0.2％-0.5％玉米浆，2.0％-3.0％黄豆粉，0.1％-0.3％硫酸铵，0.1％-0.5％碳酸钙，0.3％-0.5％氯化钠。
所述步骤e中，复试用发酵培养基成分及其含量为：10％-15％玉米淀粉，0.2％-0.5％玉米浆，2.0％-3.0％黄豆粉，1.0％-1.5％硫酸铵，1.0％-1.5％碳酸钙，0.3％-0.5％氯化钠，0.01％-0.05％磷酸二氢钾，0.1％-0.3％聚醚消沫。
本发明的有益效果是：本发明所述快速选育土霉素菌种的方法，通过将分离培养得到的单菌落直接接种于发酵培养基中，将土霉素菌种筛选中的效价验证周期由192h缩短为48-50h，缩短了验证时间，提高了工作效率，而且选育出的土霉素具有高产的特点。
原来的土霉素发酵技术采用斜面孢子挖块的方式接种，而本文方法使用单菌落孢子接种，后者孢子量较小，从而降低发酵培养基的装量，节省了原料，降低了成本；通过将分离培养得到的单菌落直接接种于发酵培养基中换了一种验证工艺思路，减少了验证工艺中需要的较大的接种量，而在工艺思路改变的前提下，所要解决的技术关键是单菌落接到发酵瓶以后的孢子快速生长繁殖的发酵培养工艺，在步骤d发酵培养的过程中由于接种孢子量的减少，在发酵的研究中发现温度对孢子的萌发、菌丝的生长繁殖、抗生素的产生有着至关重要的影响，将温度控制在32.0±0.5℃，并同时需要将步骤d中发酵培养基的配方严格控制为“4％-5％玉米淀粉，0.1％-0.2％玉米浆，0.5％-1.0％黄豆粉，0.2％-0.3％硫酸铵，0.2％-0.3％碳酸钙，0.1％-0.2％氯化钠，0.01％-0.02％磷酸二氢钾”在较低的淀粉、黄豆粉等营养物质下配合32.0±0.5℃的培养温度才能实现孢子快速萌发、菌丝快速生长繁殖、产生抗生素。
具体实施方式
本发明为了解决现有技术中土霉素工业菌种的筛选周期长，影响工作效率的技术问题，提供了一种快速选育土霉素菌种的方法。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1.
试管斜面培养基按质量百分比的组成为：6.0％-7.0％麸皮，2.0％-2.5％琼脂。
分离培养基按质量百分比的组成为：2.0％-3.0％玉米淀粉，0.2％-0.5％玉米浆，0.1％-0.3％硫酸铵，0.1％-0.5％碳酸钙，0.3％-0.5％氯化钠，2.0％-2.5％琼脂。
发酵培养基按质量百分比的组成为：4％-5％玉米淀粉，0.1％-0.2％玉米浆，0.5％-1.0％黄豆粉，0.2％-0.3％硫酸铵，0.2％-0.3％碳酸钙，0.1％-0.2％氯化钠，0.01％-0.02％磷酸二氢钾。
a.试管斜面培养：将土霉素生产菌株砂土孢子接种于试管斜面培养基中，每支试管斜面的砂土孢子接种量为，在温度37.0±0.5℃，湿度40％的条件下培养5天，得到斜面孢子；
b.孢子悬液制备：向步骤a试管斜面培养基中加入无菌水，将步骤a得到的斜面孢子刮下，混匀，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使孢子浓度为1012-1014个/mL；
c.分离培养：将步骤b所得的孢子悬液稀释至101-107倍，稀释液涂布在分离培养基上，于温度37.0±0.5℃，湿度40％的条件下暗培养5天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；
d.发酵培养：在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到25mL发酵培养基中，于32.0±0.5℃，湿度为40％，转速为220rpm条件下震荡培养50h，生长到周期后检测发酵液中土霉素含量，选土霉素的含量高于500U/mL的菌株进行砂土干燥保藏。
验证试验：
(1)试管斜面培养：将步骤a砂土管保藏的生产株及步骤d选出的一株高产菌株分别转接试管斜面，于温度37.0±0.5℃，湿度40％恒温室培养5天，得到斜面孢子。
(2)种子培养：将上述(1)得到的斜面孢子分别转接至种子培养基中，于30.0±0.5℃，220rpm条件下震荡培养30h，得到成熟种液。
(3)发酵培养：将上述(2)得到的成熟种液分别接种到复试用发酵培养基中，于30.0±0.5℃，220rpm条件下震荡培养5天。
效价检测：发酵培养到周期后使用比色法对发酵单位进行检测。步骤a出发株复试发酵单位为14890U/mL；步骤d选出的菌株复试发酵单位为19001U/mL。用本方法筛选出的菌株与出发菌株的效价相比明显提高。由此也证明了采用本发明的快速选育土霉素菌种的方法是可行的，可以选育出高产的土霉素菌种，而且验证时间大大缩短。
实施例2.
试管斜面培养基按质量百分比的组成为：6.0％-7.0％麸皮，2.0％-2.5％琼脂。
分离培养基按质量百分比的组成为：2.0％-3.0％玉米淀粉，0.2％-0.5％玉米浆，0.1％-0.3％硫酸铵，0.1％-0.5％碳酸钙，0.3％-0.5％氯化钠，2.0％-2.5％琼脂。
发酵培养基按质量百分比的组成为：4％-5％玉米淀粉，0.1％-0.2％玉米浆，0.5％-1.0％黄豆粉，0.2％-0.3％硫酸铵，0.2％-0.3％碳酸钙，0.1％-0.2％氯化钠，0.01％-0.02％磷酸二氢钾。
a.试管斜面培养：将土霉素生产菌株砂土孢子接种于试管斜面培养基中，每支试管斜面的砂土孢子接种量为，在温度37.0±0.5℃，湿度60％的条件下培养3天，得到斜面孢子；
b.孢子悬液制备：向步骤a试管斜面培养基中加入无菌水，将步骤a得到的斜面孢子刮下，混匀，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使孢子浓度为1012-1014个/mL；
c.分离培养：将步骤b所得的孢子悬液稀释至101-107倍，稀释液涂布在分离培养基上，于温度37.0±0.5℃，湿度60％的条件下暗培养3天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；
d.发酵培养：在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到25mL发酵培养基中，于32.0±0.5℃，湿度为60％，转速为200rpm条件下震荡培养48h，生长到周期后检测发酵液中土霉素含量，选土霉素的含量高于500U/mL的菌株进行砂土干燥保藏。
验证试验：
(1)试管斜面培养：将步骤a砂土管保藏的生产株及步骤d选出的一株高产菌株分别转接试管斜面，于温度37.0±0.5℃，湿度60％恒温室培养3天，得到斜面孢子。
(2)种子培养：将上述(1)得到的斜面孢子分别转接至种子培养基中，于30.0±0.5℃，220rpm条件下震荡培养24h，得到成熟种液。
(3)发酵培养：将上述(2)得到的成熟种液分别接种到复试用发酵培养基中，于30.0±0.5℃，220rpm条件下震荡培养5天。
效价检测：发酵培养到周期后使用比色法对发酵单位进行检测。步骤a出发株复试发酵单位为14937U/mL；步骤d选出的菌株复试发酵单位为18890U/mL。用本方法筛选出的菌株与出发菌株的效价相比明显提高。由此也证明了采用本发明的快速选育土霉素菌种的方法是可行的，可以选育出高产的土霉素菌种，而且验证时间大大缩短。
实施例3.
试管斜面培养基按质量百分比的组成为：6.0％-7.0％麸皮，2.0％-2.5％琼脂。
分离培养基按质量百分比的组成为：2.0％-3.0％玉米淀粉，0.2％-0.5％玉米浆，0.1％-0.3％硫酸铵，0.1％-0.5％碳酸钙，0.3％-0.5％氯化钠，2.0％-2.5％琼脂。
发酵培养基按质量百分比的组成为：4％-5％玉米淀粉，0.1％-0.2％玉米浆，0.5％-1.0％黄豆粉，0.2％-0.3％硫酸铵，0.2％-0.3％碳酸钙，0.1％-0.2％氯化钠，0.01％-0.02％磷酸二氢钾。
a.试管斜面培养：将土霉素生产菌株砂土孢子接种于试管斜面培养基中，每支试管斜面的砂土孢子接种量为，在温度37.0±0.5℃，湿度45％的条件下培养4.5天，得到斜面孢子；
b.孢子悬液制备：向步骤a试管斜面培养基中加入无菌水，将步骤a得到的斜面孢子刮下，混匀，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使孢子浓度为1012-1014个/mL；
c.分离培养：将步骤b所得的孢子悬液稀释至101-107倍，稀释液涂布在分离培养基上，于温度37.0±0.5℃，湿度45％的条件下暗培养4.5天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；
d.发酵培养：在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到25mL发酵培养基中，于32.0±0.5℃，湿度为45％，转速为210rpm条件下震荡培养49.5h，生长到周期后检测发酵液中土霉素含量，选土霉素的含量高于500U/mL的菌株进行砂土干燥保藏。
验证试验：
(1)试管斜面培养：将步骤a砂土管保藏的生产株及步骤d选出的一株高产菌株分别转接试管斜面，于温度37.0±0.5℃，湿度45％恒温室培养4.5天，得到斜面孢子。
(2)种子培养：将上述(1)得到的斜面孢子分别转接至种子培养基中，于30.0±0.5℃，220rpm条件下震荡培养28h，得到成熟种液。
(3)发酵培养：将上述(2)得到的成熟种液分别接种到复试用发酵培养基中，于30.0±0.5℃，220rpm条件下震荡培养5天。
效价检测：发酵培养到周期后使用比色法对发酵单位进行检测。步骤a出发株复试发酵单位为14873U/mL；步骤d选出的菌株复试发酵单位为19013U/mL。用本方法筛选出的菌株与出发菌株的效价相比明显提高。由此也证明了采用本发明的快速选育土霉素菌种的方法是可行的，可以选育出高产的土霉素菌种，而且验证时间大大缩短。
实施例4.
试管斜面培养基按质量百分比的组成为：6.0％-7.0％麸皮，2.0％-2.5％琼脂。
分离培养基按质量百分比的组成为：2.0％-3.0％玉米淀粉，0.2％-0.5％玉米浆，0.1％-0.3％硫酸铵，0.1％-0.5％碳酸钙，0.3％-0.5％氯化钠，2.0％-2.5％琼脂。
发酵培养基按质量百分比的组成为：4％-5％玉米淀粉，0.1％-0.2％玉米浆，0.5％-1.0％黄豆粉，0.2％-0.3％硫酸铵，0.2％-0.3％碳酸钙，0.1％-0.2％氯化钠，0.01％-0.02％磷酸二氢钾。
a.试管斜面培养：将土霉素生产菌株砂土孢子接种于试管斜面培养基中，每支试管斜面的砂土孢子接种量为，在温度37.0±0.5℃，湿度50％的条件下培养4天，得到斜面孢子；
b.孢子悬液制备：向步骤a试管斜面培养基中加入无菌水，将步骤a得到的斜面孢子刮下，混匀，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使孢子浓度为1012-1014个/mL；
c.分离培养：将步骤b所得的孢子悬液稀释至101-107倍，稀释液涂布在分离培养基上，于温度37.0±0.5℃，湿度50％的条件下暗培养4天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；
d.发酵培养：在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到25mL发酵培养基中，于32.0±0.5℃，湿度为50％，转速为210rpm条件下震荡培养49h，生长到周期后检测发酵液中土霉素含量，选土霉素的含量高于500U/mL的菌株进行砂土干燥保藏。
验证试验：
(1)试管斜面培养：将步骤a砂土管保藏的生产株及步骤d选出的一株高产菌株分别转接试管斜面，于温度37.0±0.5℃，湿度50％恒温室培养4天，得到斜面孢子。
(2)种子培养：将上述(1)得到的斜面孢子分别转接至种子培养基中，于30.0±0.5℃，220rpm条件下震荡培养27h，得到成熟种液。
(3)发酵培养：将上述(2)得到的成熟种液分别接种到复试用发酵培养基中，于30.0±0.5℃，220rpm条件下震荡培养5天。
效价检测：发酵培养到周期后使用比色法对发酵单位进行检测。步骤a出发株复试发酵单位为14867U/mL；步骤d选出的菌株复试发酵单位为19025U/mL。用本方法筛选出的菌株与出发菌株的效价相比明显提高。由此也证明了采用本发明的快速选育土霉素菌种的方法是可行的，可以选育出高产的土霉素菌种，而且验证时间大大缩短。
实施例5.
试管斜面培养基按质量百分比的组成为：6.0％-7.0％麸皮，2.0％-2.5％琼脂。
分离培养基按质量百分比的组成为：2.0％-3.0％玉米淀粉，0.2％-0.5％玉米浆，0.1％-0.3％硫酸铵，0.1％-0.5％碳酸钙，0.3％-0.5％氯化钠，2.0％-2.5％琼脂。
发酵培养基按质量百分比的组成为：4％-5％玉米淀粉，0.1％-0.2％玉米浆，0.5％-1.0％黄豆粉，0.2％-0.3％硫酸铵，0.2％-0.3％碳酸钙，0.1％-0.2％氯化钠，0.01％-0.02％磷酸二氢钾。
a.试管斜面培养：将土霉素生产菌株砂土孢子接种于试管斜面培养基中，每支试管斜面的砂土孢子接种量为，在温度37.0±0.5℃，湿度55％的条件下培养3.5天，得到斜面孢子；
b.孢子悬液制备：向步骤a试管斜面培养基中加入无菌水，将步骤a得到的斜面孢子刮下，混匀，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使孢子浓度为1012-1014个/mL；
c.分离培养：将步骤b所得的孢子悬液稀释至101-107倍，稀释液涂布在分离培养基上，于温度37.0±0.5℃，湿度55％的条件下暗培养3.5天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；
d.发酵培养：在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到25mL发酵培养基中，于32.0±0.5℃，湿度为55％，转速为220rpm条件下震荡培养48.5h，生长到周期后检测发酵液中土霉素含量，选土霉素的含量高于500U/mL的菌株进行砂土干燥保藏。
验证试验：
(1)试管斜面培养：将步骤a砂土管保藏的生产株及步骤d选出的一株高产菌株分别转接试管斜面，于温度37.0±0.5℃，湿度55％恒温室培养3.5天，得到斜面孢子。
(2)种子培养：将上述(1)得到的斜面孢子分别转接至种子培养基中，于30.0±0.5℃，220rpm条件下震荡培养26h，得到成熟种液。
(3)发酵培养：将上述(2)得到的成熟种液分别接种到复试用发酵培养基中，于30.0±0.5℃，220rpm条件下震荡培养5天。
效价检测：发酵培养到周期后使用比色法对发酵单位进行检测。步骤a出发株复试发酵单位为14857U/mL；步骤d选出的菌株复试发酵单位为18906U/mL。用本方法筛选出的菌株与出发菌株的效价相比明显提高。由此也证明了采用本发明的快速选育土霉素菌种的方法是可行的，可以选育出高产的土霉素菌种，而且验证时间大大缩短。

Claims (9)

1.一种快速选育土霉素菌种的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.试管斜面培养：将土霉素生产菌株砂土孢子接种于试管斜面培养基中，在温度37.0±0.5℃，湿度40％-60％的条件下培养3-5天，得到斜面孢子；
b.孢子悬液制备：向步骤a试管斜面培养基中加入无菌水，将步骤a得到的斜面孢子刮下，混匀，制成孢子悬液，用血球计数板计数，使孢子浓度为1012-1014个/mL；
c.分离培养：将步骤b所得的孢子悬液用无菌水稀释至101-107倍，稀释液涂布在分离培养基上，于温度37.0±0.5℃，湿度40％-60％的条件下暗培养3-5天，培养时第一天正置，第二天起倒置培养；
d.发酵培养：在分离培养基上挑取直径在5mm以上的单菌落接种到25mL发酵培养基中，于32.0±0.5℃，湿度为40-60％，转速为200-220rpm条件下震荡培养48-50h，生长到周期后检测发酵液中土霉素含量，选高于效价500U/mL的菌株进行砂土干燥保藏；
e.菌株复试：取步骤d沙土干燥保藏的菌株转接试管斜面培养基，于37.0±0.5℃，40％-60％湿度条件下培养3-5天，得斜面孢子，将所得的斜面孢子转接至种子培养基中，于30.0±0.5℃，220rpm条件下震荡培养24-30h，将培养好的种液转接至复试用发酵培养基中，于30.0±0.5℃，200-220rpm条件下震荡培养5-7天，取样检测效价。
2.根据权利要求1所述的一种快速选育土霉素菌种的方法，其特征在于：所述的试管斜面培养基按质量百分比的组成为：6.0％-7.0％麸皮，2.0％-2.5％琼脂。
3.根据权利要求1所述的一种快速选育土霉素菌种的方法，其特征在于：所述的步骤a中，湿度为45％-55％，培养时间为4天。
4.根据权利要求1所述的一种快速选育土霉素菌种的方法，其特征在于：所述的步骤c中，分离培养基按质量百分比的组成为：2.0％-3.0％玉米淀粉，0.2％-0.5％玉米浆，0.1％-0.3％硫酸铵，0.1％-0.5％碳酸钙，0.3％-0.5％氯化钠，2.0％-2.5％琼脂。
5.根据权利要求1所述的一种快速选育土霉素菌种的方法，其特征在于：所述的步骤c中，湿度为45％-55％，培养时间为4天。
6.根据权利要求1所述的一种快速选育土霉素菌种的方法，其特征在于，所述步骤d中，发酵培养基按质量百分比的组成为：4％-5％玉米淀粉，0.1％-0.2％玉米浆，0.5％-1.0％黄豆粉，0.2％-0.3％硫酸铵，0.2％-0.3％碳酸钙，0.1％-0.2％氯化钠，0.01％-0.02％磷酸二氢钾。
7.根据权利要求1所述的一种快速选育土霉素菌种的方法，其特征在于，所述步骤d中，湿度为45-55％，转速为220rpm，震荡培养49h。
8.根据权利要求1所述的一种快速选育土霉素菌种的方法，其特征在于，所述步骤e中，种子培养基按质量百分比的组成为：2.0％-3.0％玉米淀粉，0.2％-0.5％玉米浆，2.0％-3.0％黄豆粉，0.1％-0.3％硫酸铵，0.1％-0.5％碳酸钙，0.3％-0.5％氯化钠。
9.根据权利要求1所述的一种快速选育土霉素菌种的方法，其特征在于，所述步骤e中，复试用发酵培养基成分及其含量为：10％-15％玉米淀粉，0.2％-0.5％玉米浆，2.0％-3.0％黄豆粉，1.0％-1.5％硫酸铵，1.0％-1.5％碳酸钙，0.3％-0.5％氯化钠，0.01％-0.05％磷酸二氢钾，0.1％-0.3％聚醚消沫剂。
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