CN111748486A - 一种芽孢杆菌培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种芽孢杆菌培养基，由以下原料组成：蛋白胨大豆肉汤、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钠、氯化钙、生物素和水。本发明提供的芽孢杆菌培养基获得的地衣芽孢杆菌发酵液的OD600nm值、枯草芽孢杆菌发酵液的OD600nm值分别增加43.3%、35.1%，地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌生物量明显增加，表明本发明提供的培养基更加适合地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌的生长，在本发明的优化培养基中地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌发酵4小时已进入对数生长期，可明显缩短发酵时间，大大降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌培养基。
背景技术
由于抗生素的长期大量使用，导致动物肠道正常菌群失调，而且抗生素在畜禽产品的残留直接影响人类的健康和生态环境。近年来不断发生的食品安全事件，引起人们对健康意识的不断增强和对绿色健康食品的重视，对无害化饲料的需求和抗生素替代品是急需解决的问题。益生菌制剂作为最有前途的抗生素替代品，无论在食品还是饲料中，益生菌的生理功效得到了人们的一致认同。
我国农业部发布的《饲料添加剂品种目录（2013）》，允许将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌作为活菌制剂加入养殖动物饲料中。养殖业应用益生菌产品以来，对益生菌的评价褒贬不一，经市场产品抽检发现，各种益生菌产品的标示菌种、活菌数含量差异非常大。因此我们还需不断改善现有的菌剂制备工艺，提高益生菌制剂中活菌数的含量及稳定性。
目前，芽孢杆菌的工业化液体深层发酵工艺普遍存在着发酵水平偏低，芽孢形成不一致，产品质量不稳定等缺陷。一般通过调整发酵过程中的温度、压力、通气搅拌等工业条件来提高有效活菌数量，对菌种的芽孢采用高温处理，使之在工业发酵过程中能同步形成芽孢，从而提高芽孢形成的数量和比例，缩短发酵时间。然而这些方法实际操作起来甚为麻烦，而且还增加了成本。
发明内容
本发明的目的为提供适宜地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌生长的培养基。为实现本发明目的，所使用的技术方案为：
本发明提供一种芽孢杆菌培养基，由以下原料组成：蛋白胨大豆肉汤、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钠、氯化钙、生物素和水。
优选地，所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。
优选地，所述培养基组分按重量/体积计：
所述蛋白胨大豆肉汤在培养基中的浓度为10.0-30.0 g/L；
所述葡萄糖在培养基中的浓度为10.0-30.0 g/L；
所述蛋白胨在培养基中的浓度为10.0-30.0 g/L；
所述磷酸二氢钠在培养基中的浓度为1.0-3.0 g/L；
所述氯化钙在培养基中的浓度为1.0-3.0 g/L；
所述生物素在培养基中的浓度为3.0-5.0 g/L。
优选地，所述培养基组分按重量/体积计：
所述蛋白胨大豆肉汤在培养基中的浓度为10.0-20.0 g/L；
所述葡萄糖在培养基中的浓度为10.0-20.0 g/L；
所述蛋白胨在培养基中的浓度为10.0-20.0 g/L；
所述磷酸二氢钠在培养基中的浓度为1.0-2.0 g/L；
所述氯化钙在培养基中的浓度为1.0-2.0 g/L；
所述生物素在培养基中的浓度为3.0-4.0 g/L。
优选地，所述培养基组分按重量/体积计：
所述蛋白胨大豆肉汤在培养基中的浓度为20.0-30.0 g/L；
所述葡萄糖在培养基中的浓度为20.0-30.0 g/L；
所述蛋白胨在培养基中的浓度为20.0-30.0 g/L；
所述磷酸二氢钠在培养基中的浓度为2.0-3.0 g/L；
所述氯化钙在培养基中的浓度为2.0-3.0 g/L；
所述生物素在培养基中的浓度为4.0-5.0 g/L。
本发明还保护上述任一所述培养基在培养地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌中的应用。
本发明还保护上述任一所述培养基在提高地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌生物量中的应用。
上述应用中，所述“提高地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌生物量”主要是地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌适宜于在上述任一所述培养基中生长造成的。
上述任一所述地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）为广西壮族自治区兽医研究所细菌室冻存。
将100 μL地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌种子液（1.8×108 cfu/mL）接种至装有10mL优化前的培养基（由3.0重量份TSB、1.0重量份葡萄糖、1.0重量份蛋白胨、0.1重量份NaH2PO4和95.0重量份水组成）和本发明提供的培养基（由3.0重量份TSB、1.0重量份葡萄糖、1.0重量份蛋白胨、0.1重量份NaH2PO4、0.2重量份CaCl2、0.3重量份生物素、95.0重量份水的培养基组成）的试管中，然后置于恒温摇床，37℃、200rpm振荡培养18h，得到发酵液，然后采用紫外线分光广度法测定OD600nm值。结果表明，与优化前的培养基相比，在相同的发酵时间采用本发明提供的培养基获得的地衣芽孢杆菌发酵液的OD600nm值、枯草芽孢杆菌发酵液的OD600nm值分别增加43.3%、35.1%，地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌生物量明显增加，表明本发明提供的培养基更加适合地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌的生长，在本发明的优化培养基中地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌发酵4小时已进入对数生长期，可明显缩短发酵时间，大大降低了生产成本。
通过添加生物素，促进了地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌的生长因子形成。本发明通过添加一定比例的CaCl2和生物素，调整菌种生长所需的碳源、氮源和无机离子的比例，提高芽孢杆菌的萌发和生长数量。
附图说明
图1是地衣芽孢杆菌生长曲线图。
图2是枯草芽孢杆菌生长曲线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
下列实施例中，三角瓶规格为250 mL，试管的规格均为20 mL。
实施例中所用地衣芽孢杆菌（B.licheniformis），枯草芽孢杆菌（B.subtilis）为广西壮族自治区兽医研究所细菌室冻存菌。
下述实施例中的种子液为将地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌接种于250 mL 胰蛋白胨大豆肉汤培养基（PH=7.0），37 ℃、200 rpm振荡培养18 h，制成菌悬液（1.8×108 cfu/mL）作为菌种。
实施例1、用于培养地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌的基础培养基的筛选
所述的基础培养基的制备
1、营养肉汤培养基的配制 称取19.0 g营养肉汤培养基粉末于1 L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，再分装至试管中，10 mL/管，121 ℃高压灭菌15 min，冷却至室温后即得基础培养液。
2、TSB肉汤培养基的配制 称取30.0 g TSB培养基粉末于1 L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，再分装至试管中，10 mL/管，121 ℃高压灭菌15 min，冷却至室温后即得基础培养液。
3、LB肉汤培养基的配制 称取25.0 g LB培养基粉末于1 L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，再分装至试管中，10 mL/管，121 ℃高压灭菌15 min，冷却至室温后即得基础培养液。
所述的基础培养基的筛选
1、将100 μL种子液接种至装有10 mL 待测基础培养基（营养肉汤培养基、TSB肉汤培养基和LB肉汤培养基）的试管中（接种量为1%（v/v）），然后置于恒温摇床，37 ℃、200 rpm 振荡培养18 h，得到发酵液。
2、完成步骤1，采用紫外分光光度法测定发酵液的OD600nm值。
检测结果见表1。结果表明，当待测培养基为TSB肉汤培养基时，发酵液的OD600nm值最高。由此可见，与其它基础培养基（营养肉汤培养基、LB肉汤培养基）相比，TSB肉汤培养基更适合地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌的生长。
表1
实施例2、最佳碳源的选择
待测培养基由含2重量份的碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖）的TSB肉汤基础培养基组成。
1、将100 μL种子液接种至装有10 mL待测培养基的试管中（接种量为1%（v/v）），然后置于恒温摇床，37 ℃、200 rpm 振荡培养18 h，得到发酵液。
2、完成步骤1后，采用紫外分光光度法测定发酵液的OD600nm值。
检测结果见表2。结果表明，当待测培养基中的碳源为葡萄糖时，发酵液的OD600nm值最高。由此可见，与其它碳源（蔗糖、乳糖）相比，地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌对葡萄糖的利用率更高。
表2
实施例3、最佳氮源的选择
待测培养基由含1重量份的氮源（蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉）的TSB肉汤基础培养基组成。
1、将100 μL种子液接种至装有10mL待测培养基的试管中（接种量为1%（v/v）），然后置于恒温摇床，37℃、200 rpm 振荡培养18 h，得到发酵液。
2、完成步骤1后，采用紫外分光光度法测定发酵液的OD600nm值。
检测结果见表3。结果表明，当待测培养基中的氮源为蛋白胨时，发酵液的OD600nm值最高。由此可见，与其它氮源（酵母浸粉、牛肉浸粉）相比，地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌对蛋白胨的利用率更高。
表3
实施例4、最佳无机盐的选择
待测培养基由含0.2重量份的无机盐（K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4）的TSB肉汤基础培养基组成。
1、将100 μL种子液接种至装有10 mL待测培养基的试管中（接种量为1%（v/v）），然后置于恒温摇床，37 ℃、200 rpm 振荡培养18 h，得到发酵液。
2、完成步骤1后，采用紫外分光光度法测定发酵液的OD600nm值。
检测结果见表4。结果表明，当待测培养基中的无机盐为NaH2PO4时，发酵液的OD600nm值最高。由此可见，与其它无机盐（K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4）相比，地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌对NaH2PO4的利用率更高。
表4
实施例5、培养基中营养组分含量的优化
根据最佳碳源、氮源、无机盐选择结果，以葡萄糖用量（1.0-3.0重量份）、蛋白胨用量（1.0-3.0重量份）、NaH2PO4用量（0.1-0.3重量份）、生物素用量（0.3-0.5）重量份为考察因素，以枯草芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌生物量（即发酵液的OD600nm值）为评价指标，通过L9（34）正交试验设计优化培养基的组分和含量。
上述任一所述培养基中，所述TSB、所述葡萄糖、所述蛋白胨、所述NaH2PO4、所述CaCl2、所述生物素和所述水的比例可为3.0重量份：1.0重量份：1.0重量份：0.1重量份：0.2重量份：0.3重量份：95.0重量份。
上述任一所述培养基中，所述TSB、所述葡萄糖、所述蛋白胨、所述NaH2PO4、所述CaCl2、所述生物素和所述水的比例可为3.0重量份：1.0重量份：2.0重量份：0.2重量份：0.2重量份：0.4重量份：94.0重量份。
上述任一所述培养基中，所述TSB、所述葡萄糖、所述蛋白胨、所述NaH2PO4、所述CaCl2、所述生物素和所述水的比例可为3.0重量份：1.0重量份：3.0重量份：0.3重量份：0.2重量份：0.5重量份：93.0重量份。
上述任一所述培养基中，所述TSB、所述葡萄糖、所述蛋白胨、所述NaH2PO4、所述CaCl2、所述生物素和所述水的比例可为3.0重量份：2.0重量份：1.0重量份：0.2重量份：0.2重量份：0.5重量份：94.0重量份。
上述任一所述培养基中，所述TSB、所述葡萄糖、所述蛋白胨、所述NaH2PO4、所述CaCl2、所述生物素和所述水的比例可为3.0重量份：2.0重量份：2.0重量份：0.3重量份：0.2重量份：0.3重量份：93.0重量份。
上述任一所述培养基中，所述TSB、所述葡萄糖、所述蛋白胨、所述NaH2PO4和、所述CaCl2、所述生物素和所述水的比例可为3.0重量份：2.0重量份：3.0重量份：0.1重量份：0.2重量份：0.4重量份：92.0重量份。
上述任一所述培养基中，所述TSB、所述葡萄糖、所述蛋白胨、所述NaH2PO4、所述CaCl2、所述生物素和所述水的比例可为3.0重量份：3.0重量份：1.0重量份：0.3重量份：0.2重量份：0.4重量份：93.0重量份。
上述任一所述培养基中，所述TSB、所述葡萄糖、所述蛋白胨、所述NaH2PO4、所述CaCl2、所述生物素和所述水的比例可为3.0重量份：3.0重量份：2.0重量份：0.1重量份：0.2重量份：0.5重量份：92.0重量份。
上述任一所述培养基中，所述TSB、所述葡萄糖、所述蛋白胨、所述NaH2PO4、所述CaCl2、所述生物素和所述水比例可为3.0重量份：3.0重量份：3.0重量份：0.2重量份：0.2重量份：0.3重量份：91.0重量份。
1、将100 μL种子液接种至装有10 mL待测培养基的试管中（接种量为1%（v/v）），然后置于恒温摇床，37 ℃、200 rpm 振荡培养18 h，得到发酵液。
1、将100 μL种子液接种至装有10 mL待测培养基的试管中（接种量为1%（v/v）），然后置于恒温摇床，37 ℃、200 rpm 振荡培养18 h，得到发酵液。
2、完成步骤1后，采用紫外分光光度法测定发酵液的OD600nm值。
检测结果见表5、表6。结果表明，通过对表5中正交试验结果分析可以看出，各因素对地衣芽孢杆菌菌液浓度影响从大到小的顺序依次为：葡萄糖，NaH2PO4，蛋白胨，生物素。地衣芽孢杆菌最适培养基配方为：3.0重量份TSB粉末、1.0重量份葡萄糖、1.0重量份蛋白胨，0.1重量份NaH2PO4、0.2重量份CaCl2：0.3重量份生物素：95.0重量份水，组成。
结果表明，通过对表6中正交试验结果分析可以看出，各因素对枯草芽孢杆菌菌液浓度影响从大到小的顺序依次为：NaH2PO4，蛋白胨，葡萄糖，生物素。枯草芽孢杆菌最适培养基配方为：3.0重量份TSB、3.0重量份葡萄糖、1.0重量份蛋白胨、0.3重量份NaH2PO4、0.2重量份CaCl2、0.4重量份生物素、93.0重量份水组成。
表5
| 培养基 | 葡萄糖 | 蛋白胨 | NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 生物素 | 地衣芽孢杆菌发酵液OD<sub>600</sub>值 |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1.267 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 1.12 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 1.13 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 1.03 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 0.924 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 1.059 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 0.9 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 0.925 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 0.9 |
| K1 | 1.172 | 1.066 | 1.084 | 1.030 | |
| K2 | 1.004 | 0.99 | 1.017 | 1.026 | |
| K3 | 0.908 | 1.03 | 0.985 | 1.028 | |
| R | 0.264 | 0.076 | 0.099 | 0.004 |
表6
| 培养基 | 葡萄糖 | 蛋白胨 | NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 生物素 | 枯草芽孢杆菌发酵液OD<sub>600nm</sub>值 |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1.098 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 1.058 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 1.104 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 1.042 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 1.082 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 1.024 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 1.536 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 1.068 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 1.010 |
| K1 | 1.087 | 1.225 | 1.063 | 1.063 | |
| K2 | 1.049 | 1.069 | 1.037 | 1.206 | |
| K3 | 1.205 | 1.046 | 1.241 | 1.071 | |
| R | 0.156 | 0.179 | 0.204 | 0.143 |
实施例6、发酵培养效果比较
1、将100 μL种子液接种至装有10 mL待测培养基（优化前的培养基和优化后的培养基）的试管中（接种量为1%（v/v）），然后置于恒温摇床，37 ℃、200 rpm 振荡培养18 h，得到发酵液。
2、完成步骤1后，采用紫外分光光度法测定发酵液的OD600nm值。
检测结果见表7。结果表明，与优化前的培养基相比，在相同的发酵时间采用本发明提供的培养基获得的地衣芽孢杆菌发酵液的OD600nm值、枯草芽孢杆菌发酵液的OD600nm值分别增加43.3%、35.1%，地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌生物量明显增加，表明本发明提供的培养基更加适合地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌的生长。
优化后的地衣芽孢杆菌培养基由3.0重量份TSB、1.0重量份葡萄糖、1.0重量份蛋白胨，0.1重量份NaH2PO4、0.2重量份CaCl2：0.3重量份生物素：95.0重量份水组成。优化后的地衣芽孢杆菌培养基中，TSB粉末的浓度为30 g/L，葡萄糖的浓度为10 g/L、蛋白胨的浓度为10 g/L，NaH2PO4的浓度为1.0 g/L、CaCl2的浓度为2.0 g/L：生物素的浓度为3.0 g/L。
优化后的枯草芽孢杆菌培养基由3.0重量份TSB、3.0重量份葡萄糖、1.0重量份蛋白胨，0.3重量份NaH2PO4、0.2重量份CaCl2：0.4重量份生物素：93.0重量份水组成。优化后的枯草芽孢杆菌培养基中，TSB粉末的浓度为30 g/L，葡萄糖的浓度为30 g/L、蛋白胨的浓度为10 g/L，NaH2PO4的浓度为3.0 g/L、CaCl2的浓度为2.0 g/L：生物素的浓度为4.0 g/L。
表7
| 待测培养基 | 地衣芽孢杆菌发酵液OD<sub>600nm</sub>值 | 枯草芽孢杆菌发酵液OD<sub>600nm</sub>值 |
| 优化前的培养基 | 0.884 | 0.813 |
| 优化后的培养基 | 1.267 | 1.098 |
实施例7、地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌生长曲线及培养时间的确定
用于地衣芽孢杆菌待测培养基由3.0重量份TSB、1.0重量份葡萄糖、1.0重量份蛋白胨，0.1重量份NaH2PO4、0.2重量份CaCl2：0.3重量份生物素：95.0重量份水组成。
用于枯草芽孢杆菌待测培养基由3.0重量份TSB、3.0重量份葡萄糖、1.0重量份蛋白胨，0.3重量份NaH2PO4、0.2重量份CaCl2：0.4重量份生物素：93.0重量份水组成。
1、将100 μL种子液接种至装有10mL待测培养基的试管中（接种量为1%（v/v）），然后置于恒温摇床，37℃、200 rpm 振荡培养24h，得到发酵液。
2、完成步骤1后，采用紫外分光光度法测定每2h发酵液的OD600nm值。
检测结果见图1、图2。结果表明，在地衣芽孢杆菌优化培养液中，0~4h为地衣芽孢杆菌的生长延迟期，4~12h为对数生长期，12h后进入生长静止期；在枯草芽孢杆菌优化培养基中，0~4h为枯草芽孢杆菌的生长延迟期，4~14h为对数生长期，14h后进入生长静止期。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。
Claims (7)
1.一种芽孢杆菌培养基，其特征在于，由以下原料组成：蛋白胨大豆肉汤、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钠、氯化钙、生物素和水。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌培养基，其特征在于，所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌培养基，其特征在于，所述培养基组分按重量/体积计：
所述蛋白胨大豆肉汤在培养基中的浓度为10.0-30.0 g/L；
所述葡萄糖在培养基中的浓度为10.0-30.0 g/L；
所述蛋白胨在培养基中的浓度为10.0-30.0 g/L；
所述磷酸二氢钠在培养基中的浓度为1.0-3.0 g/L；
所述氯化钙在培养基中的浓度为1.0-3.0 g/L；
所述生物素在培养基中的浓度为3.0-5.0 g/L。
4.根据权利要求3所述的芽孢杆菌培养基，其特征在于，所述培养基组分按重量/体积计：
所述蛋白胨大豆肉汤在培养基中的浓度为10.0-20.0 g/L；
所述葡萄糖在培养基中的浓度为10.0-20.0 g/L；
所述蛋白胨在培养基中的浓度为10.0-20.0 g/L；
所述磷酸二氢钠在培养基中的浓度为1.0-2.0 g/L；
所述氯化钙在培养基中的浓度为1.0-2.0 g/L；
所述生物素在培养基中的浓度为3.0-4.0 g/L。
5.根据权利要求3所述的芽孢杆菌培养基，其特征在于，所述培养基组分按重量/体积计：
所述蛋白胨大豆肉汤在培养基中的浓度为20.0-30.0 g/L；
所述葡萄糖在培养基中的浓度为20.0-30.0 g/L；
所述蛋白胨在培养基中的浓度为20.0-30.0 g/L；
所述磷酸二氢钠在培养基中的浓度为2.0-3.0 g/L；
所述氯化钙在培养基中的浓度为2.0-3.0 g/L；
所述生物素在培养基中的浓度为4.0-5.0 g/L。
6.根据权利要求1-5任一所述的培养基在培养地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌中的应用。
7.根据权利要求1-5任一所述的培养基在提高地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌生物量中的应用。
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