CN101589155A - 在含粗甘油的培养基中生产酶 - Google Patents
在含粗甘油的培养基中生产酶 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及从在包含粗甘油作为碳源的培养基中生长的宿主细胞产生想要的蛋白质的方法。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求在2007年1月11日提交的美国临时申请号60/879,904的权利，特此以其整体引入作为参考。
发明领域
本发明涉及使用粗甘油作为培养中细胞生长的碳源，和在这种细胞培养物中产生蛋白质。
发明背景
在某些分子生物学方法中，细胞在培养基中生长并用于产生想要的蛋白质。可以回收所产生的想要的蛋白质并用于多种工业和医学应用中。例如，所述想要的蛋白质可用作治疗蛋白(如抗体或酶)，和用于工业应用，如清洁应用(例如洗衣用去污剂)、造纸应用、动物喂养应用、烘焙应用、用于淀粉水解的方法及需要大量特定酶的其它方法。
使用重组细胞或非重组细胞产生大量的蛋白质经常需要在含碳源、氮源和那些细胞生长所需的其它营养物(例如氨基酸、维生素、矿物质等)的培养基中培养细胞。许多细胞培养掺入葡萄糖或葡萄糖与其它底物的组合作为细胞培养中的碳源，或作为细胞培养中的底物物料(feed)。
本发明涉及用于细胞培养的备选碳源。本发明人在本文中已发现向营养培养基中添加粗甘油(作为唯一的碳源或与其它糖类(例如葡萄糖)组合)可用作碳源以通过培养物中生长的细胞产生想要的蛋白质。在细胞培养物中使用粗甘油可带来巨大的商业效益。
发明简述
本发明提供含粗甘油的培养基。在某些实施方案中，所述粗甘油可以是培养基的唯一碳源。在其它实施方案中，所述培养基除含粗甘油外，还可含有一种或多种第二碳源，如6碳糖，其包括但不限于葡萄糖、半乳糖、果糖、山梨糖和甘露糖，或6碳糖如葡萄糖和果糖(蔗糖)、纤维素、乳糖等的组合。在其它实施方案中，所述培养基除含粗甘油外，还可含有一种或多种第二碳源，如蛋白质源(例如，大豆和/或玉米)。
本发明提供包含本发明的含粗甘油的培养基的细胞培养物。在某些实施方案中，所述细胞培养物包含：复数个细胞(其在特定实施方案中可包含用于产生想要的蛋白质的重组核酸)，和包含粗甘油的培养基。在某些实施方案中，细胞培养物中的细胞可以是细菌细胞或真菌细胞。所述重组核酸可含有表达盒，该表达盒包含有效连接的：a)启动子区，b)编码想要的蛋白质的编码区；和c)终止子区。
通过重组细胞产生的蛋白质对细胞可以是天然的或异源的，并且在某些实施方案中，所述蛋白质可以是细胞内蛋白质或由细胞分泌到培养基中。所述蛋白质例如可以是工业酶、治疗蛋白、报告蛋白、可选择标记、食品添加剂或食品。
本发明还提供蛋白质的生产方法。一般而言，该方法包括维持上述细胞培养物以提供想要的蛋白质的生产。在某些情况下，可从培养基中回收该蛋白质。
可通过组合，例如混合，粗甘油与细胞生长所需的其它组分，例如氮源和其它营养物，及水，来产生上述含粗甘油的培养基。
在一些实施方案中，可通过组合(例如混合)：a)粗甘油和b)包含用于产生想要蛋白质的核酸(例如重组核酸)的细胞的培养物，来产生上述细胞培养物。在其它实施方案中，可通过组合(例如接种)包含粗甘油的细胞培养基与包含用于产生所述蛋白质的重组核酸的细胞来产生上述细胞培养物。所述培养方法可以是分批、补料分批或连续培养方法。
附图简述
图1描述了随时间推移在分批培养中生长的重组变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)细胞的细胞质量(DCW；g细胞/kg)，所述变铅青链霉菌细胞在含有粗甘油或葡萄糖的培养基中进行培养，如实施例1中所述。
图2描述了随时间推移在分批培养中生长的变铅青链霉菌所分泌的纤维素酶的量(超过葡萄糖最大值的增加％)，所述变铅青链霉菌在含有粗甘油或葡萄糖的培养基中进行培养，如实施例1中所述。所有数据点相对于在含葡萄糖的培养基中产生的蛋白质的最高水平(其设置为100％)来描述。
图3描述了随时间推移在补料分批培养中生长的重组变铅青链霉菌细胞的细胞质量(DCW；g细胞/kg)，所述细胞在含有粗甘油或葡萄糖的培养基中进行培养，如实施例2中所述。
图4描述了随时间推移在补料分批培养中生长的变铅青链霉菌所分泌的纤维素酶的量(超过葡萄糖最大值的增加％)，所述变铅青链霉菌在含有粗甘油或葡萄糖的培养基中进行培养，如实施例2中所述。所有数据点相对于在含葡萄糖的培养基中所产生的蛋白质的最高水平(其设置为100％)来描述。
图5描述了随时间推移在分批培养中生长的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞的细胞质量(在550nm处的光密度)，所述枯草芽孢杆菌细胞在含有粗甘油或葡萄糖的培养基中进行培养，如实施例3中所述。
图6描述了随时间推移在分批培养中生长的枯草芽孢杆菌所分泌的蛋白酶的量(超过葡萄糖最大值的增加％)，所述枯草芽孢杆菌在含有粗甘油或葡萄糖的培养基中进行培养，如实施例3中所述。所有数据点相对于在含葡萄糖的培养基中所产生的蛋白质的最高水平(其设置为100％)来描述。
图7描述了随时间推移在补料分批培养中生长的重组枯草芽孢杆菌细胞的细胞质量(在550nm处的光密度)，所述枯草芽孢杆菌细胞在含有粗甘油或葡萄糖的培养基中进行培养，如实施例4中所述。
图8描述了随时间推移在补料分批培养中生长的枯草芽孢杆菌所分泌的蛋白酶的量(超过versadex最大值的增加％)，所述枯草芽孢杆菌在含有粗甘油或葡萄糖(versadex)的培养基中进行培养，如实施例4中所述。所有数据点相对于在含versadex的培养基中所产生的蛋白质的最高水平(其设置为100％)来描述。
图9描述了随时间推移在分批培养中生长的非重组黑曲霉(Aspergillusniger)细胞的细胞质量(DCW；g细胞/kg)，所述黑曲霉细胞在含有粗甘油或麦芽糖的培养基中进行培养，如实施例6中所述。
图10描述了随时间推移在分批培养中生长的黑曲霉所分泌的葡糖淀粉酶的量(超过麦芽糖最大值的增加％)，所述黑曲霉在含有粗甘油或麦芽糖的培养基中进行培养，如实施例6中所述。所有数据点相对于在含麦芽糖的培养基中所产生的蛋白质的最高水平(其设置为100％)来描述。
图11描述了随时间推移在分批培养中生长的重组锈赤链霉菌(Streptomyces rubigenosis)细胞的细胞质量(DCW；g细胞/kg)，所述锈赤链霉菌细胞在含有粗甘油或葡萄糖的培养基中进行培养，如实施例7中所述。
图12描述了随时间推移在分批培养中生长的锈赤链霉菌所分泌的细胞内葡萄糖异构酶的量(超过葡萄糖最大值的增加％)，所述锈赤链霉菌在含有粗甘油或葡萄糖的培养基中进行培养，如实施例7中所述。所有数据点相对于在含葡萄糖的培养基中所产生的蛋白质的最高水平(其设置为100％)来描述。
图13描述了随时间推移在分批培养中生长的重组多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)细胞的细胞质量(在550nm处的光密度)，所述多形汉逊氏酵母细胞在含有蒸馏甘油或粗甘油的培养基中进行培养，如实施例8中所述。
图14描述了随时间推移在分批培养中生长的多形汉逊氏酵母所分泌的脂肪酶的量(超过甘油最大值的增加％)，所述多形汉逊氏酵母在含有蒸馏甘油或粗甘油的培养基中进行培养，如实施例8中所述。所有数据点相对于在含蒸馏甘油的培养基中所产生的蛋白质的最高水平(其设置为100％)来描述。
发明详述
定义
除非本文另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语具有本发明隶属技术领域中的技术人员通常理解的相同含义。Singleton，等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第2版，John Wiley and Sons，New York(1994)，和Hale&Marham，THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了用于本发明的许多术语的常用字典。还可参考Atkinson等，Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook，第2版，Stockton Press(1991)作为一般参考。尽管与此处所述的那些类似或等价的任何方法和材料均可用于本发明的实践或测试中，但还描述了优选的方法和材料。
本文中涉及的所有专利和出版物，包括这些专利和出版物中公开的所有序列，被清楚地引入作为参考。
数值范围包括定义范围的数值。除非另有说明，核酸以5′到3′方向从左到右书写；氨基酸序列以氨基到羧基方向从左到右书写。
此处提供的标题不旨在限制本发明的各个方面或实施方案，这些方面和实施方案可参考说明书整体而得到。因此，以下术语通过参考说明书整体而得到更充分的定义。
“甘油”指(C3H8O3)1，2，3-丙烷，也称作1，2，3-三羟基丙烷。该术语也与“甘油(glycerin)”和“甘油(glycerine)”互换使用。
术语“粗甘油”(raw glycerol)此处定义为具有％纯度低于99％(v/v)，例如至少25％并低于95％的甘油(v/v)，95％到98％甘油(v/v)，95％到99％甘油(v/v)，或98％到99％甘油(v/v)的水溶液。
如此处所用的术语“精制甘油”(refined glycerol)指具有低于1％盐(w/v)的“粗甘油”。
术语“蒸馏甘油”(distilled glycerol)在此处定义为具有95％或更高的％纯度的甘油(v/v)(大于约95％且不超过100％甘油(v/v))的水溶液。
术语“培养基”在此处定义为液体的或固体的人造组合物，其含有碳源、氮源和培养细胞所需的其它营养物，例如氨基酸、维生素、矿物质等。培养基不含细胞。可用细胞接种培养基，以产生含有细胞和所述培养基的细胞培养物。
术语“细胞培养物”和“细胞的培养物”可互换地使用来描述含有活细胞(通常为单一一种)和培养基的液体组合物。可以通过用细胞接种培养基来产生细胞培养物。细胞培养物中的细胞在代谢上是活跃的，然而，它们可以发生或不发生活跃生长或分裂。细胞培养物存在于体外。
术语“分批”描述了分批细胞培养物，其中在一开始于发酵运行开始时向所述培养物中加入固体形式或浓缩液体形式的底物(substrate)。通过向该培养基中接种细胞来启始分批培养，并且随后无营养物的流入。培养基中营养物和代谢物的浓度取决于在该批中的起始浓度以及营养物料的组成随后因细胞发酵活动而发生的改变。术语“补料分批”描述了这样的分批细胞培养，其中在发酵运行过程中周期性地或连续地向所述培养物中加入固体形式或浓缩液体形式的底物。通过向该培养基中接种细胞开始补料分批培养，但随后有营养物流入，例如通过浓缩的营养物料。然而，没有培养液或细胞的系统性的移出。
术语“连续细胞培养”或“连续培养”指特征为连续流入液体营养物料和连续流出液体的培养。
术语“容器”指用于培养细胞的任何合适的容器，包括但不限于罐、瓶、烧瓶、袋子、生物反应器，和用于进行本发明方法的任何其它合适的容器。
术语“启动子”在此处定义为在细胞中指导下游多核苷酸转录的核酸。在某些情况下，所述多核苷酸可以含有编码序列，并且启动子可以指导所述编码序列转录成可翻译的RNA。
如此处定义的术语“分离的”指将化合物、蛋白质、细胞、核酸序列或氨基酸从与其天然相关的至少一种组分中移出。
术语“编码序列”在此处定义为核酸，当其置于合适的控制序列(包括启动子)的控制之下时转录成能翻译成多肽的mRNA。编码序列可含有单个可读框或例如由内含子分隔开的几个可读框。编码序列例如可以是cDNA、基因组DNA、合成DNA或重组DNA。编码序列通常在起始密码子(例如ATG)处开始，并在终止密码子(例如UAA、UAG和UGA)处终止。
术语“重组的”指不是在宿主细胞中天然出现的多核苷酸或多肽。重组分子可以含有两个或更多天然发生的序列，其以非天然发生的方式连接在一起。
术语“异源的”指正常相互无关的元件。例如，如果重组宿主细胞产生异源蛋白质，那么该蛋白质不由相同类型的野生型宿主细胞产生，异源启动子是在与野生型宿主细胞内源的核酸中不存在的启动子，并且有效连接异源编码序列的启动子是有效连接如下编码序列的启动子，所述编码序列在野生型宿主细胞中通常不与该启动子有效连接。
术语“有效连接”指允许元件在功能上相关联的元件布置方式。例如，如果启动子控制编码序列的转录，那么该启动子有效连接该编码序列，如果信号序列指导蛋白质通过宿主细胞的分泌系统，那么该信号序列有效连接该蛋白质。
术语“核酸”包括单链或双链DNA、单链或双链RNA及其修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”此处可互换使用。
如此处所用的术语“DNA构建体”指包含至少两个DNA多核苷酸片段的核酸序列。
如此处所用，术语“报道分子”指可被容易地检测并测定的蛋白质。在某些情况下，报道分子可以是光学上可检测的，例如荧光的、发光的或生色的。
如此处所用，术语“可选择的标记”指生物聚合体——多肽或多核苷酸，其使得可以从含所述生物聚合体的其它细胞中选出含有所述生物聚合体的宿主细胞。可选择的标记可以提供对毒性化合物(如抗生素、除草剂等)的抗性。
术语“信号序列”或“信号肽”指蛋白质N末端部分的氨基酸序列，其促进所述蛋白质的成熟形式分泌到细胞外。细胞外蛋白质的成熟形式缺少信号序列，其在分泌过程中被切掉。
术语“载体”在此处定义为设计来携带待引入一种或多种细胞类型中的核酸序列的多核苷酸。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体或病毒颗粒、DNA构建体、盒等。表达载体可包括调节序列，如启动子、信号序列、编码序列和转录终止子。
如此处所用的“表达载体”指包含有效连接合适控制序列的编码序列的DNA构建体，所述控制序列能够实现蛋白质在合适宿主中的表达。这种控制序列可包括实现转录的启动子、任选的控制转录的操纵基因序列、编码合适的核糖体结合位点的序列、增强子及控制转录和翻译终止的序列。
如此处所用，术语“多肽”和“蛋白质”互换使用，并包括提及任何数量氨基酸残基的聚合物。该术语适用于这样的氨基酸聚合物，其中一个或更多氨基酸残基是相应的天然发生氨基酸的人工化学类似物，该术语也适用于天然发生的氨基酸的聚合物。该术语也适用于含有保守氨基酸替换的聚合物，所述替换使得该多肽保持功能性。“肽”是具有少于50个氨基酸残基的多肽。
“宿主细胞”指表达载体的合适宿主，所述表达载体包含编码想要的蛋白质的DNA构建体。宿主细胞可以是任何细胞类型。
术语“丝状真菌”指真菌亚门的所有丝状真菌形式(参阅Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY，Wiley，New York)。这些真菌特征在于具有由壳多糖、葡聚糖和其它复杂多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本发明的丝状真菌在形态学上、生理学上和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是菌丝伸长，并且碳代谢是专性需氧的。
“非病原”菌株是对人不具致病性的菌株。
培养基
如上指出，本发明提供含粗甘油的培养基。所述培养基可含有氮源、粗甘油和细胞培养物所需的其它营养物，例如氨基酸、维生素、矿物质等。所述粗甘油可以被生长在该培养基中的细胞用作碳源。
在某些实施方案中，培养基可包含其它碳源，例如糖用于细胞生长。因此，在某些实施方案中，粗甘油可以是用于细胞的唯一碳源。在其它实施方案中，所述粗甘油可与一种或更多种其它第二碳源共同存在用于细胞。
在示例性实施方案中，培养基中粗甘油可具有25％到85％(v/v)；还有25％到50％(v/v)；还有50％到75％(v/v)；还有75％到85％(v/v)；还有85％到90％(v/v)，或还有90％到低于95％(v/v)的百分比甘油纯度。在一些实施方案中，所述粗甘油可以具有95％到98％(v/v)的甘油纯度。在一些实施方案中，所述粗甘油可具有低于99％(v/v)的甘油纯度。
在某些实施方案中，粗甘油可含有盐(例如KCl或NaCl；硫酸钠或硫酸钾、磷酸钠或磷酸钾，或硝酸钠或硝酸钾)，其浓度不超过12％(w/v)，例如在1％到10％(w/v)；1％到5％(w/v)；5％到8％(w/v)或8％到12％(w/v)的范围内。精制甘油含有低于1％的盐(w/v)，例如浓度在0.01％到0.1％(w/v)、0.1％到0.5％(w/v)或0.5％到低于1％(w/v)范围内的盐。在一个实施方案中，所述粗甘油基本不包含盐(0到0.01％，或0到0.001％的盐)。
尽管在优选实施方案中粗甘油用于培养基和细胞培养物中，但某些实施方案中可使用蒸馏甘油。在一些实施方案中，定义为具有95％或更高纯度的蒸馏甘油可具有至少95％并低于99.5％(v/v)，例如高于95％到97％甘油(v/v)、97％到99％甘油(v/v)或99％到低于99.5％甘油(v/v)的纯度。在一些实施方案中，在本发明涵盖的方法中使用的蒸馏甘油将具有至少99.5％，例如至少99.6％、至少99.7％或至少99.9％甘油(v/v)的纯度。具有上述范围内的％纯度的甘油可称作工业级甘油(例如，高于95％到低于99.5％)和医药级甘油(例如，至少99.5％甘油到至少99.9％甘油v/v))。
培养基中存在的粗甘油的量可以根据所用的生长方法(例如，细胞是在分批培养(例如在摇瓶中)、连续培养，还是补料分批培养中生长)而有很大变化。在某些实施方案中，所述培养基可包含0.1％到75％的粗甘油(v/v)，例如0.5％到2％的粗甘油(特别是如果细胞培养物在连续或补料分批方法下生长时，在所述方法中碳源将被培养基中培养的细胞快速消耗)、2％到5％的粗甘油、5％到10％的粗甘油、10％到30％的粗甘油、30％到50％的粗甘油或50％到75％的粗甘油。在一些实施方案中，所述粗甘油的浓度为大约0.1、0.5、1、5、10、15、20或25％(v/v)中的任何一个浓度至大约50、55、60、65、70、75或80％(v/v)中的任何一个浓度。在一些实施方案中，细胞在分批发酵工艺中生长，并且所述培养基包含大约1％到大约5％的粗甘油(v/v)。在一些实施方案中，细胞在补料分批发酵工艺中生长，并且所述培养基包含大约20％到大约50％的粗甘油(v/v)。
如果在培养基中存在第二碳源，那么所述第二碳源可以是糖，例如葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、右旋糖或蔗糖等。如果在培养基中存在第二碳源，那么所述第二碳源和粗甘油可以以1∶99(例如，1摩尔的第二碳源比99摩尔的甘油)到99∶1(例如，99摩尔的第二碳源比1摩尔的甘油)的相对摩尔浓度存在。例如，第二碳源和粗甘油可以以在1∶99到1∶10、1∶10到1∶2、1∶2到2∶1、10∶1到2∶1或10∶1到99∶l范围内的相对摩尔浓度存在。在一些优选实施方案中，所述第二碳源可以是葡萄糖，并特别是当细胞培养物包含真菌细胞时，一些葡萄糖将被提供为碳源。在一些优选实施方案中，粗甘油与葡萄糖的比将在1∶4到4∶1，和可以在2∶1到1∶2的范围内。
可在本发明细胞培养基中使用的其它组分(例如氮源和其它营养物等)的身份及合适浓度通常取决于在培养基中生长的细胞的类型。这种组分通常为本领域所熟知(参阅，例如，Ausubel，等，Short Protocols inMolecular Biology，第3版，Wiley&Sons，1995；Sambrook，等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，1989Cold Spring Harbor，N.Y.；Talbot，Molecular and Cellular Biology of Filamentous Fungi：A PracticalApproach，Oxford University Press，2001；Kinghorn和Turner，AppliedMolecular Genetics of Filamentous Fungi，Cambridge University Press，1992；和Colin R.Harwood，Plenum Press，1989的Bacillus(BiotechnologyHandbooks)；Bacillus subtilis：From Genes to Cells，Sonenshein，A.L.，Hoch，J.A.和Losick，R ASM(2001)，及例如Ilmen等，Appl.Environ.Microbiol.199763：1298-1306；O′Herrin等Hum.Immunol.199651：63-72；Westers等，J.Biotechnol.2006123：211-24和Yang等，Biochim.Biophys.Acta 20041703：43-51)。也可在科学文献中和/或从真菌来源(如美国典型培养物保藏中心(ATCC)和Fungal Genetics Stock Center)中找到用于给定细胞类型的培养条件。
可在培养基中使用的示例性组分包括，但不限于：来自微生物、动物或植物细胞的提取物，例如大豆粉、大豆蛋白、大豆浓缩物、玉米浆、玉米粉、玉米谷蛋白、酵母提取物、大豆面、棉花粉、花生粉、马铃薯蛋白、乳清、鱼粉、细菌用胰蛋白胨、细菌用蛋白胨等，盐，例如KH2PO4、MgSO4、CaCl2、NaCl、FeCl3、MgCl2、MnCl2，其它化合物，例如氯化硫胺素、生物素、维生素B12、NaH2PO4H3BO3、ZnSO4、Na2MoO4和CuSO4，和任选地，一种或更多种第二碳源，如上讨论的。在某些情况下，已知的培养基中的碳源可被替换为甘油(例如粗甘油)。下文中示例了含粗甘油的培养基。
如将在下文更详细地进行描述，培养基可用于培养含有用于表达蛋白质的重组核酸的细胞。因为在某些实施方案中，重组核酸可以含有可选择的标记以选择含所述重组核酸的细胞，所以所述培养基还可以含有细胞的可选择标记能赋予对其的抗性选择剂，如抗生素，如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、潮霉素、博来霉素、氯霉素(chloroamphenicol)、链霉素或腐草霉素，或除草剂。在某些情况下，所述培养基还可含有从细胞分泌的蛋白质。如将在下文中更详细地描述，蛋白质对细胞可以是内源的，或对细胞是非内源的。
在特定实施方案中，可特别地配制培养基用于培养特定细胞(例如含有用于产生蛋白质的重组核酸的宿主细胞)。如将在下文中更详细地描述，这种宿主细胞包括，但不限于某些细菌和真菌宿主细胞。
本发明培养基中存在的甘油(例如，粗甘油)可来自任何来源。在特定实施方案中，本发明培养基中存在的甘油(例如，粗甘油)可以是生物柴油或肥皂生产方法的副产物，即通过植物和/或动物甘油三酯的转酯作用生产可燃性烷基酯的副产物，或通过植物和/或动物甘油三酯的皂化作用生产脂肪酸盐的副产物。例如可从Novance(法国)、Reidel-de Haen(德国)、Sigma-Aldrich和ADM获得商业来源的甘油。
可使用任何便利方法制备本发明培养基。在一个实施方案中，将所有的培养基组分(包括粗甘油和水)在使用前组合并灭菌，例如进行高压灭菌或过滤除菌。在另一实施方案中，可在使用前向生长培养基的其它组分中加入粗甘油。如果所述培养基是固体培养基，培养基可含有琼脂或其它固化剂。
细胞培养
本发明提供包含：a)复数个宿主细胞和b)上述培养基的细胞培养物。在某些实施方案中，细胞可含有用于产生蛋白质的重组核酸。
在特定实施方案中，本发明宿主细胞可以是细菌细胞，其包括以下物种的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞：芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)，包括但不限于：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、B.halodurans、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、B.lautus和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)；链霉菌属物种(Streptomyces sp.)，包括但不局限于变铅青链霉菌(S.lividans)、S.carbophilus、锈赤链霉菌(S.rubigenosus)和淡蜡黄链霉菌(S.helvaticus)；Pantoea属物种，包括P.citrea；葡糖杆菌属物种(Gluconobacter sp.)；欧文氏菌属物种(Erwinia sp.)；和大肠杆菌(E.coli)。
在其它实施方案中，本发明宿主细胞可以是以下物种的真菌细胞：木霉属物种(Trichoderma sp.)，(例如，里氏木霉(Trichoderma reesei)(先前分类为长枝木霉(T.longibrachiatum)并且目前也称为Hypocreajecorina)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichodermakoningii)和Trichoderma harzianum)；青霉属物种(Penicillium sp.)、腐质霉物种(Humicola sp.)(例如，特异腐质霉(Humicola insolens)和Humicola grisea)；Chrysosporium属物种(例如，C.lucknowense)、粘帚霉属物种(Gliocladium sp.)、曲霉属物种(Aspergillus sp.)(例如，米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、Aspergillus kawachi、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)和泡盛曲霉(Aspergillus awamori))，镰孢霉属物种(Fusarium sp.)、毛霉属物种(Mucor sp.)、脉孢霉属物种(Neurospora sp.)、肉座菌属物种(Hypocreasp.)或Emericella属物种。
用于培养这些细胞的方法，包括可用于培养这些细胞的合适的培养基组分，是已知的。
如上指出，细胞培养物中的细胞可含有用于表达蛋白质的重组核酸。在某些实施方案中，所述重组核酸可包含用于表达蛋白质的表达盒，即启动子、编码序列(即，编码所述蛋白质的多核苷酸)和终止子，其中所述启动子、编码序列和终止子有效连接，使得所述编码序列能转录产生RNA，并使得该RNA能翻译产生蛋白质。所述启动子、编码序列和终止子中的每一个均可以独立地对宿主细胞是内源的(即天然的)或非内源的。同样，所述蛋白质对宿主细胞可以是内源的(即天然的)或非内源的。在某些实施方案中，所述编码序列可以被密码子优化以用于在特定宿主细胞中表达蛋白质。因为列出许多细胞中每个密码子的使用的密码子选择表为本领域已知(参阅，例如Nakamura等，Nucl.Acids Res.200028：292)，或者可容易地推出来，所以给出待表达蛋白质的氨基酸序列，即可以容易地设计出这种核酸。
所编码的蛋白质可以是酶、治疗蛋白、报告蛋白、可选择标记、食品添加剂或食品等。
在一个实施方案中，蛋白质可以是酶，如糖酶，如α-淀粉酶、β-淀粉酶、纤维素酶；葡聚糖酶，α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、戊聚糖酶、木聚糖酶、转化酶、乳糖酶、柚皮苷酶(naringanase)、果胶酶或支链淀粉酶；蛋白酶，如酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、粗制凝乳酶、凝乳酶(rennin)、凝乳酶(chymosin)、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶，或胰蛋白酶；脂酶或酯酶，如甘油三酯酶、磷脂酶、pregastric酯酶、磷酸酶、植酸酶、酰胺酶、亚氨基酰基转移酶、谷氨酰胺酶、溶菌酶或青霉素酰基转移酶；异构酶，如葡萄糖异构酶；氧化还原酶，例如氨基酸氧化酶、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、羟基类固醇脱氢酶或过氧化物酶；裂合酶，如乙酰乳酸脱羧酶、天冬氨酸β-脱羧酶、延胡索酸酶或组氨酸酶(histadase)；转移酶，如环糊精糖基转移酶；或连接酶，等。在特定实施方案中，蛋白质可以是氨基肽酶、羧肽酶、壳多糖酶、角质酶(cutinase)、脱氧核糖核酸酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、漆酶、甘露糖苷酶、mutanase、果胶裂合酶(pectinolytic enyme)、多酚氧化酶、核糖核酸酶或转谷氨酰胺酶，等。
在其它实施方案中，蛋白质可以是治疗蛋白(即，具有治疗生物活性的蛋白质)。合适的治疗蛋白的实例包括：促红细胞生成素，细胞因子，如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-o和粒细胞-CSF、GM-CSF，凝血因子如因子VIII、因子IX，和人蛋白C、抗凝血酶III、凝血酶、可溶性IgE受体α-链、IgG、IgG片段、IgG融合物、IgM、IgA、白细胞介素、尿激酶、胰凝乳蛋白酶和尿胰蛋白酶抑制剂、IGF-结合蛋白、表皮生长因子、生长激素释放因子、膜联蛋白V融合蛋白、制管张素、血管内皮生长因子-2、髓系祖细胞(myeloid progenitor)抑制因子-1、骨保护素、α-1-抗胰蛋白酶、甲胎蛋白、DNA酶II、人纤溶酶原的kringle 3、葡糖脑苷脂酶、TNF结合蛋白1、促卵泡激素、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-Ig、跨膜激活剂及钙调亲环蛋白配体、可溶性TNF受体Fc融合物、胰高血糖素样蛋白1和IL-2受体激动剂。抗体蛋白质(特异性结合并识别抗原的含有来自免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其片段(例如可以人源化的单克隆抗体)尤其有意义。
在其它实施方案中，蛋白质可以是报告蛋白。这种报告蛋白例如可以是在光学上可检测的或是生色的。在该实施方案中，所述蛋白质可以是β-半乳糖苷酶(lacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤光素酶、碱性磷酸酶、胭脂碱合酶(NOS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、辣根过氧化物酶(HRP)或荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)或其衍生物。
可选择标记的实例包括但不限于赋予抗微生物抗性的标记(例如对潮霉素、博来霉素、氯霉素或腐草霉素的抗性)，和赋予代谢优势的蛋白质，例如amdS、argB和pyr4。可选择标记还描述于Kelley等，(1985)EMBO J.4：475-479；Penttila等，(1987)Gene 61：155-164和Kinghorn等(1992)Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi，Blackie Academic andProfessional，Chapman and Hall，London中。
在某些实施方案中，编码序列可编码融合蛋白。在这些实施方案中的一些实施方案中，所述融合蛋白可提供蛋白质从表达其的宿主细胞中的分泌，并且由此可含有有效连接到蛋白质N末端的信号序列，其中所述信号序列含有使所述蛋白质定向于宿主细胞分泌系统的氨基酸序列，从而导致所述蛋白质从宿主细胞分泌到宿主细胞生长所处的培养基中。在蛋白质分泌之前信号序列从融合蛋白上被切掉。所使用的信号序列对宿主细胞可以是内源的或非内源的，并且在某些实施方案中，其可以是已知从宿主细胞大量分泌的蛋白质的信号序列。在特定实施方案中，信号序列蛋白可以是任何有利于蛋白质从丝状真菌(例如，木霉或曲霉)宿主细胞或细菌(例如，芽孢杆菌或链霉菌)宿主细胞中分泌的信号序列。这种信号序列包括，但不限于：例如，纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、内切葡聚糖酶I、内切葡聚糖酶II、内切葡聚糖酶III、α-淀粉酶、天冬氨酰蛋白酶、葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、糖苷酶和大麦内肽酶B的信号序列(参阅Saarelainen，Appl.Environ.Microbiol.199763：4938-4940)。其它信号序列是来源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA)、α因子基因(酵母，例如酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和汉逊氏酵母属(Hansenula))或α淀粉酶基因(芽孢杆菌属)的那些序列。因此在某些实施方案中，本发明重组核酸可以包含：编码信号序列的核酸，所述核酸有效连接编码蛋白质的核酸，其在宿主细胞中的翻译产生融合蛋白，所述融合蛋白包含具有用于从宿主细胞分泌蛋白质的N末端信号序列的蛋白质。
在特定实施方案中，融合蛋白还可以含有“载体蛋白”，其是宿主细胞内源的并由宿主细胞大量分泌的蛋白质的一部分。合适的载体蛋白包括里氏木霉甘露聚糖酶I(Man5A或MANI)、里氏木霉纤维二糖水解酶II(Cel6A或CBHII)(参阅，例如Paloheimo等Appl.Environ.Microbiol.2003 December；69(12)：7073-7082)或里氏木霉纤维二糖水解酶I(CBHI)的那些。在一个实施方案中，所述载体蛋白是截短的里氏木霉CBHl蛋白，其包括CBHl核心区和部分CBHl接头区。因此提供从氨基末端到羧基末端含有有效连接的信号序列、载体蛋白和目的蛋白的融合蛋白，及编码该蛋白质的核酸。
本发明重组核酸可存在于载体中，或整合到宿主细胞的基因组中。所述重组核酸可存在于在宿主细胞中进行自主复制的载体中，例如噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。用于表达重组蛋白质的载体为本领域所熟知(Ausubel，等，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley&Sons，1995；Sambrook，等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。
因为在上述培养基中含有粗甘油，该粗甘油在某些实施方案中可以是用于制备生物柴油或肥皂的反应的含甘油副产物，故本文所述培养基在某些实施方案中可含有痕量可检测量的，例如低于1％、低于0.5％、低于0.2％、低于0.1％、低于0.05％、低于0.01％、低于0.005％、低于0.001％或低于0.0005％(v/v)的、用于这些反应的组分或这些反应的其它产物或副产物。例如，在某些实施方案中，根据用于产生粗甘油的反应本发明培养基可含有痕量脂肪酸的烷基酯或烷基盐(所述脂肪酸存在于植物油，例如菜籽油、大豆油、巯基芥子油、棕榈油、大麻油、麻风树油、废烹饪油的甘油三酯，或动物脂肪，例如，牛油、猪油、黄油脂或鱼油的甘油三酯中)，皂，反应催化剂，例如甲氧基钠或硅酸钠，或醇，例如乙醇或甲醇，脂肪酸、灰分、硫酸、磷酸、醋酸和e-甲氧基，1，2-丙二醇。
方法
可使用多种不同方法制备上述细胞培养物。例如，在某些实施方案中，例如通过在水中将培养基的所有成分混和在一起，加入粗甘油，然后将培养基用宿主细胞接种来制备含粗甘油的培养基。可在容器中于细胞生长的合适条件下维持细胞培养物(例如，在振荡温育箱中合适温度下，如生物反应器中室温、30℃或37℃)。
在其它实施方案中，可向细胞培养物中加入(例如与其混和)粗甘油。在这些实施方案中，可将粗甘油与细胞培养物快速(例如在几秒钟之内)混合，或逐渐(例如在几分钟或几小时之内)混合。像这样，在某些实施方案中，本发明方法可包括在缺少粗甘油(即，使用不是粗甘油的碳源)的情况下培养细胞，然后向细胞中加入粗甘油。在其它实施方案中，在存在粗甘油的情况下培养细胞一段时间(例如数分钟或数小时)，然后向培养物中加入另一碳源。如上指出，所述粗甘油可以是或可以不是用于细胞培养物中的细胞的唯一碳源。
在特定实施方案中，可在使用前，从远距离场所，例如远离细胞培养场所的肥皂或生物柴油生产厂，例如不同的城市或国家，接收粗甘油。可以贮存粗甘油，并在使用前灭菌。
本发明还提供使用上述细胞培养物产生蛋白质的方法。在某些实施方案中，该蛋白质生产方法包括：维持上述细胞培养物以提供蛋白质的产生。在某些实施方案中并如上讨论，所述蛋白质可分泌到培养基中。像这样，所述方法的某些实施方案包括从培养基中回收蛋白质的步骤。由细胞产生的蛋白质可用于多种方法中。
在一些实施方案中，可在分批或连续发酵条件下培养细胞。经典的分批发酵方法使用封闭系统，其中在发酵运行开始前将培养基灭菌，用想要的生物接种所述培养基，并且在随后不向培养基中加入任何组分的情况下进行发酵。在某些情况下，在分批方法过程中，可改变生长培养基的pH和氧含量，但不能改变其碳源含量。分批系统的代谢物和细胞生物量不断变化，直至发酵结束。在分批系统中，细胞通常从静止的延滞期发展到高速生长的对数期，并最终达到生长速率降低或停止的稳定期。如果不加处理，稳定期的细胞最终会死亡。一般而言，对数期和稳定期的细胞产生大多数的蛋白质。
在标准分批系统上的变异是“补料分批发酵”系统。在该系统中，当培养物中营养物的浓度降到阈值以下时，加入营养物(例如，碳源如粗甘油，氮源，盐、O2或其它营养物)。当分解代谢产物阻遏易于抑制细胞的代谢时以及当期望在培养基中具有有限量的营养物时，补料分批系统是有用的。可以基于可检测因素如pH、溶解氧和废气如CO2的分压的变化，估计补料分批系统中实际营养物浓度的测定。分批和补料分批发酵为本领域常见并已知。
连续发酵是开放系统，其中向生物反应器中连续加入含粗甘油的确定成分培养基，并且同时移出等量的条件培养基用于加工。连续发酵通常维持培养物在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长。
连续发酵允许调整影响细胞生长和/或终产物浓度的一个因素或任何数目的因素。例如，在一个实施方案中，将限制性营养物如碳源(粗甘油)或氮源维持在固定比例，而允许调节所有其它参数。在其它系统中，可不断改变影响生长的多个因素，而保持通过培养基混浊度测量到的细胞浓度恒定。连续系统力求维持稳定状态的生长条件。因此，由抽离培养基造成的细胞损失可由发酵中细胞生长速度进行平衡。调整营养物和生长因素用于连续发酵工艺的方法及用于使产物形成速度最大化的技术是已知的。
发酵反应是需氧过程，其中通过例如含分子氧的气体，如空气或富氧空气提供分子氧。尽管通气速率可在相当大范围内变化，但通常以在每分钟发酵罐中每液体体积约0.5到10，优选约0.5到7体积(在25℃在所用的压力)含氧气体的速率进行通气。该量基于应用于反应器的具正常氧含量的空气，就纯氧气而言，相应范围可以是每分钟发酵罐中每液体体积约0.1到1.7体积(在所用压力和25℃下)的氧气。用于微生物转化过程的压力范围可以宽范围地变化。压力通常在约0到50psi的范围内。
发酵温度可稍微有些变化，但对于丝状真菌和细菌而言，根据菌种和生物，温度通常在20℃到45℃的范围内。
微生物所需的氮源可以是任何含氮化合物或能够以适合于微生物代谢利用的形式释放氮的化合物。虽然可使用多种有机氮源化合物，如蛋白质水解物，但通常会利用廉价的含氮化合物，如氨、氢氧化铵、尿素硫酸铵、磷酸铵、氯化铵和其它铵化合物。氨气可用于大规模的操作，并可通过向水性发酵培养基鼓泡而被使用。
在水性微生物发酵中pH范围应该在pH 2.0到8.0的典型范围内。对于一些微生物而言，pH将在pH 3.5到6.0的范围内，对于其它微生物而言，优选pH为pH 6.0到7.5。平均发酵时间根据考虑的培养或发酵类型而将有很大变化，但通常运行时间将在12到400小时之间。
所用发酵罐的类型并不是关键性的，例如可以使用15L Biolafitte(Saint-Germain-en-Laye-，法国)。在一些实施方案中，发酵液通常含有细胞碎片，包括细胞和多种悬浮固体和可能地其它生物质污染物，及想要的蛋白质。可通过任何便利方法，例如通过沉淀、离心、亲和、过滤或本领域已知的任何其它方法从生长培养基中回收蛋白质。
在一些实施方案中，发酵将包括诱导性物料(inducing feed)组合物用于刺激想要的蛋白质在某些宿主细胞中进行表达。例如，当木霉是宿主细胞时，并尤其当木霉用作生产纤维素酶基因的宿主细胞时，可利用诱导性物料组合物，并可参考2004年4月29日公布的WO 04/035070。
在一些实施方案中，使用含粗甘油的培养基比使用只含有基于糖的碳源的其它培养基提供更多量的细胞量和/或分泌的蛋白。例如，在某些实施方案中，在含粗甘油的培养基中培养的细胞，与在含基于糖的碳源(例如，蔗糖或葡萄糖)的等同培养物相比，产生多至少2％的蛋白质、多至少5％的蛋白质、多至少10％的蛋白质、多至少50％的蛋白质、多至少100％的蛋白质或多至少1000％的蛋白质，其中所述等同培养物即在等同含糖培养基中相同条件下培养相等时间量的物含有相同细胞的细胞培养。更具体而言，包含粗甘油作为唯一碳源的细胞培养物，比包含6-碳糖(例如葡萄糖)或6碳糖混合物(例如蔗糖、葡萄糖、果糖)作为唯一碳源的等同培养物，产生多至少5％的蛋白质。在一些实施方案中，在含粗甘油的培养基中生长的细胞，与在基于糖的碳源(例如没有甘油的葡萄糖或蔗糖)中生长的等同细胞相比，细胞量相同或更多。例如，对于用甘油物料生长的细胞，相比于用葡萄糖物料生长的细胞，当在相同时期(例如在第20、30或40小时)进行测量时，通过g细胞/kg测量到的细胞量可以高1％、2％、3％、5％、10％、20％或更高。
实施例
为了进一步阐明本发明及其优势，给出以下具体实施例，应理解提供它们旨在举例说明本发明，而不应理解为以任何方式限制本发明的范围。
适用于细菌培养物的维持和生长的材料和方法为本领域所熟知。适用于以下实施例的技术可见于Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg，和G.Briggs Phillips，编辑)，AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.(1994)；或Thomas D.Brock inBiotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第2版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，Mass。除非另有说明，从SigmaAldrich(St.Louis，Mo.)、GD(Franklin Lakes，NJ)或QBiogene(Irvine，CA)获得了用于细菌细胞生长和维持的所有试剂和材料。
在随后的公开内容和实验部分，应用以下缩写：℃(摄氏度)；rpm(每分钟转数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；dIH2O(去离子水，Milli-Q过滤)；aa或AA(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(s)或s(s)(秒/复数秒)；min(s)或m(s)(分钟/复数分钟)；hr(s)或h(s)(小时/复数小时)；DIFCO(DIFCO实验室)；m/v(质量/体积)；和v/v(体积/体积)；OUR(在单位时间内每单位发酵罐体积微生物用于呼吸的氧气量)；DO％(相对于通过膜探针测量到的最大可溶量，溶解在发酵肉汤中的氧气量)。
在表1中提供了用于下文实施例的粗甘油来源。
表1
| 类型 | 甘油(％) | 盐(％) | M.O.N.G.(％) |
| 1 | 78.0-82.0 | 6.0-7.0 | ＜0.50 |
| 2 | 94.6(脱盐的) | 0 | 0.13 |
| 3 | 80.0 | 5.0 | N.A. |
| 4 | 88.0-93.0 | N.A. | 0.25 |
| 5 | 98.0 | N.A. | 1.20 |
M.O.N.G.-非甘油有机物(Matter Organic Non Glycerol)
N.A.-信息未得
实施例1在分批培养中生长的变铅青链霉菌
在具有50mL工作体积的500mL摇瓶中，通过常规分批发酵，在有氧和浸没条件下培养表达来自纤维单胞菌(Cellulomonas)的中性纤维素酶的变铅青链霉菌细胞。营养培养基含有酵母提取物(Biospringer B)、硫酸铵、柠檬酸和硫酸镁(固体形式)，及硼酸、柠檬酸、硫酸亚铁、氯化锰、硫酸锌的溶液，和1％(w/v)葡萄糖或粗甘油。
对用于细胞培养物的培养和生产培养基的详细描述，特别参考美国专利号7,135,309实施例16和PCT申请号WO 06/071598A1实施例2。简言之，通过从二日龄TSA平板(胰胨豆胨琼脂，BBL#11043)接种，开始在丰富培养基摇瓶中的培养。其它丰富培养基是TSB(胰胨豆胨培养液，BBL#11768)、液体培养液(其每升含有：16g胰蛋白胨、10g酵母提取物和5g NaCl)、培养基B(每升TSB补充：10.0g甘油、2mL改良Balch′s痕量元素溶液，其中NTA被柠檬酸替换，改良Balch′s痕量元素溶液的组成可见于Methods for General and Molecular Bacteriology(P.Gerhardt等，编辑，第158页，American Society for Microbiology，Washington，D.C.(1994))。通过从二日龄液体TSB培养物，使用1/30(v/v)接种物接种，开始在基本培养基摇瓶中的培养。基本培养基是：MM322(其每升含有：12.0g甘油、11.3g K2HPO4、1.0g(NH4)2SO4、0.2g Difco酵母提取物、0.1g NaCl和10mL如上改变的改良Balch′s痕量元素溶液，最终pH 6.7(HCl))；培养基D(补充有2g Na2CO3/L的培养基MM322，最终pH 7.2)；或培养基E(培养基Dm，最终H 6.4)。将培养基B和C及基本培养基过滤除菌，其它培养基高压灭菌。
此外，合适的培养条件可见于科学文献，如Sambrook(1989)，上引文；Kieser等(2000)Practical Streptomyces Genetics，John Innes Foundation，Norwich，UK；和来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，www.atcc.org。
摇瓶在30℃温育并剧烈振荡。在5天时间里取样，并通过测定纤维素酶活性来分析细胞生长(DCW)和蛋白质产生。使用OMNIMARK μWave(Omnimark Instruments Corporation，Tempe，AZ)测定DCW。根据标准技术测定纤维素酶活性(参阅PCT申请号PCT/US2005/045859和WO06/071598中描述的微量滴定板测定法)。结果呈现于图1和2中。
实施例2在补料分批培养中生长的变铅青链霉菌
在上文实施例1中描述的营养培养基中，通过常规补料分批发酵，在有氧浸没条件下培养表达来自纤维单胞菌的中性纤维素酶的变铅青链霉菌。用60％wt/wt葡萄糖补料(Cargill DE99右旋糖)或等价60％wt/wt粗甘油对14L分批发酵物进行补料。以20的氧摄取速率(mmol/L-h的OUR)开始补料。补料速率在几小时内倾斜升高(ramp)。对甘油补料而言，基于相等的碳来调整补料速率。使用28％w/v氢氧化铵控制pH在pH 7.0。发酵温度控制在32℃并剧烈搅动。在整个过程中对多种其它参数，如pH、DO％、气流和压力进行监测。DO％维持在30以上。在5天时间里取样，并分析细胞生长(DCW)和蛋白质产生。图3和4的曲线图显示了这些实验的结果。
实施例3在分批培养中生长的枯草芽孢杆菌
在具有50mL工作体积的500mL摇瓶中，通过常规分批发酵，在有氧浸没条件下培养表达解淀粉芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的微生物枯草芽孢杆菌细胞。营养培养基含有7g/l大豆粉(Cargill)、0.03g/l硫酸镁、0.22g/l磷酸氢二钾、21g/l磷酸二氢钠和16g/l磷酸氢二钠(固体形式)，和3.6g/l尿素的溶液，5％的葡萄糖或粗甘油。高压灭菌后pH为7.5。在将包括尿素的大豆粉和盐培养基灭菌后加入葡萄糖或甘油。其它培养基配方包括在Arbige等，Fermentation of Bacillus，第871-891页和Ferrari等，Commercial Production of Extracellular Enzymes，第917-937页，Sonenshein等(两者均在Bacillus subtilis and Other Gram-positiveBacteria：Biochemistry，Physiology and Molecular Genetics，(1993)American Society for Microbiology)中描述的那些。对可使用的培养和生产培养基的描述，特别参考美国专利号7,135,309实施例17。
将摇瓶置于37℃并以170rpm(2″摇床偏心距(shaker throw))振荡。在2天时间里取样，并用于分析细胞生长(在550nm处的光密度；″OD550″)和蛋白质产生。使用Spectronic Genesys 2在550nm处测定光密度(Sprectronic Analytical Instruments，Garforth，West Yorkshire，UK)。还可通过本领域所熟知的技术，例如在Manual of Methods for GeneralBacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg，和G.Briggs Phillips，编辑)中描述的技术来测定光密度(OD)。还可以如Estell等(1985)J.Biol.Chem.260(11)：6518-21中描述来测定蛋白质产生。图5和6的曲线图显示了该实验的结果。
实施例4在补料分批培养中生长的枯草芽孢杆菌
在含有0-15％大豆粉(Cargill)、5-25g/l磷酸钠和磷酸钾、0.5-4g/l硫酸镁及5-15g/l柠檬酸、氯化铁和氯化锰的溶液的营养培养基中，基本如K.Anstrup(1974)Industrial Aspects of Biochemistry，B.Spencer，编辑，第23-46页中描述的，通过常规补料分批发酵，在有氧浸没条件下培养表达解淀粉芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的微生物枯草芽孢杆菌。在发酵前，使用包括纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的酶混合物将培养基浸解90分钟(参阅WO95/04134)。用60％wt/wt葡萄糖补料(Cargill DE99右旋糖)、versadex绿或转化糖或等价60％wt/wt粗甘油(生物柴油副产物)向14L分批发酵物补料。当在批(batch)中检测不到葡萄糖或甘油时开始补料。补料速率在几小时内倾斜升高。基于相等的碳，调整补料速率以加入粗甘油。使用28％w/v氢氧化铵将pH控制在7。在起泡的情况下，向培养基中加入消泡剂(Mazu DF 204，1-3g/L)。发酵温度控制在37℃，并以750rpm搅动。在整个过程中对多种其它参数，如pH、DO％、气流和压力，进行监测。DO％维持在20以上。在2天时间里取样，并分析细胞生长(OD550nm)和蛋白质产生。如实施例3中所述来测定细胞生长和蛋白质产生。图7和8的曲线图显示了这些实验的结果。
实施例5在分批培养中生长的里氏木霉
在摇瓶中通过分批发酵来培养表达木霉属葡糖淀粉酶的里氏木霉细胞。在Vogel氏基本培养基上维持转化体(Davis等，(1970)Methods inEnzymology 17A，第79-143页和Davis，Rowland，Neurospora，Contributions of a Model Organism，Oxford University Press(2000))。用真菌培养物的琼脂块接种具有50mL乳糖或Proflo培养基的带挡板摇瓶。在30℃温育摇瓶并以170rpm(2″摇床偏心距)振荡。在4天时间里取样，并分析细胞生长(干细胞重量)和酶活性。根据标准方法，通过测量干燥过程前后的重量(g/kg)来测定干细胞重量(DCW)(MVIMARK InstrumentCorporation μWave)。
乳糖培养基由以下组成：10g/L乳糖；2g/L蛋白胨；1g/L酵母提取物；15g/L KH2PO4；2g/L(NH4)2SO4；0.3g/L MgSO4＊7H2O；0.3g/LCaCl2＊2H2O；1mL/L痕量金属贮存液。
Proflo培养基由以下组成：22.5g/L Proflo；30g/L乳糖；6.5g/L(NH4)2SO4；2g/L KH2PO4；0.3g/L MgSO4＊7H2O；0.2g/L CaCl2；0.72g/LCaCO3；1mL/L痕量金属贮存液和2mL/L 10％Tween 80。
在两种培养基中均使用的该里氏木霉痕量金属贮存液含有5g/LFeSO4＊7H2O；MnSO4＊H2O 1.6；1.4g/L ZnSO4＊7H2O；2.8g/L CoCl2＊6H2O。
在两种培养基中，使用28％w/v氢氧化铵或5N HCl将pH调整到5.5。对任一种培养基，以1.5％终浓度向其中加入葡萄糖或粗甘油，作为支持生长的额外碳源。
实施例6在分批培养中生长的黑曲霉
在含有50mL于合适营养培养基中的黑曲霉的摇瓶中，通过常规的分批发酵，在有氧浸没条件下培养表达曲霉属葡糖淀粉酶的真菌黑曲霉细胞5天。使用本领域已知的操作，所述培养基含有碳源，例如麦芽糖或粗甘油，氮源和无机盐。可从商业供应商获得合适的培养基，或可以根据公布的组成，例如在美国典型培养物保藏中心的产品目录或在Ward等Bio/Technology 8：435-440(1990)、美国专利号No.5,360,732或美国专利号7,135,309B1实施例22和23中公开的组成来制备合适培养基。
用于本研究中的营养培养基含有promosoy 100(全脂大豆浓缩物，Central Soya Co.，Chicago，IL；参阅美国专利号3,971,856)和硫酸铵、无水硫酸镁、柠檬酸(三)钠、磷酸钠(如Ward等(2004)Appl.Environ.Microbiol 70(5)：2567-76中描述)，和作为等价替代物的5％(w/v)麦芽糖或粗甘油。用5N HCl将pH调至4.8。用磷酸钠将培养基缓冲在pH 4.5。使用1-3g/l Mazu DF60-P(Mazur Chemicals，Inc.，Gurnee，Ill.)作为消泡剂。细胞在30℃170rpm(2″摇床偏心距)剧烈搅动下生长5天。在5天时间里取样并通过标准测定法分析细胞生长(DCW)和葡糖淀粉酶产生(参阅Ward等(2004)Appl.Environ.Microbiol.70(5)：2567-76)。结果呈现于图9和10中。
实施例7在分批培养中生长的锈赤链霉菌
在具50mL工作体积的500mL摇瓶中，通过常规分批发酵，在有氧浸没条件下培养表达锈赤链霉菌葡萄糖异构酶的锈赤链霉菌细胞。烧瓶以来自24小时种子烧瓶的10％接种物开始，并在合适营养培养基中培养5天。该营养培养基含有4g/l酵母提取物(BD)、2.2g/l Cerelose、6g/l马铃薯右旋糖淀粉(dextrose starch)、0.5g/l工业琼脂和3.5g/l硫酸铵，向摇瓶中加入1.4％(w/v)葡萄糖或粗甘油。用5N HCl将pH调至6。
此外，合适的培养条件可见于科学文献，如Sambrook，(1982)上文；T.Kieser，MJ.Bibb，MJ.Buttner，KF Chater，和D.A.Hopwood，等，(2000)PRACTICAL STREPTOMYCES GENETICS.John Innes Foundation，Norwich UK；和/或来自美国典型培养物保藏中心(ATCC；www.atcc.org)。
摇瓶在30℃进行温育并剧烈搅动。使用每升1滴的Mazu DF60-P(Mazur Chemicals，Inc.，Gurnee，Ill.)作为消泡剂、在30小时时间里取样并通过测定葡萄糖异构酶活性分析细胞生长(DCW)和蛋白质产生。根据标准技术测定葡萄糖异构酶活性(美国专利号4,610,965、5,384,257、5,310,665)。结果呈现于图11和12中。
实施例8在分批培养中生长的多形汉逊氏酵母
表达重组真菌脂肪酶(PCT申请号WO 2005/087918)的多形汉逊氏酵母在YPD培养基(DIFCO)中，通过常规分批发酵在有氧浸没条件下生长。细胞在含有0.75升工作体积的2.8升带挡板fernbach摇瓶中进行培养。用NaOH或H2SO4将培养基调至pH 6.1。培养物在26℃下温育并以170rpm(2″摇床偏心距)剧烈振荡。加入每升1滴的Mazu DF204以控制起泡。在6天时间里取样并分析细胞生长(OD550nm)和蛋白质产生。根据“TIPU测定法”测定脂酶活性(PCT申请号WO 2005/087918)。结果呈现于图13和14中。
尽管已经通过阐述和实施例为清楚理解的目的在一定程度上详细描述了前面的发明，但是对本领域技术人员而言，显而易见的是，可进行某些改变和修改而不背离本发明的精神和范围。因此，不应该将说明书解释为限制本发明的范围，所述范围由所附权利要来描述。
所有在此引用的出版物、专利和专利申请为了所有目的以其整体引入作为参考，该引用程度就如同特异地和单独地就每一出版物、专利或专利申请指出为了所有目的而将其整体引入作为参考一样。
Claims (13)
1.用于在宿主细胞中产生蛋白质的方法，其包括在培养基中培养所述宿主细胞，所述培养基包含作为碳源的粗甘油，其中所述宿主细胞包含编码所述蛋白质的重组核酸。
2.根据权利要求1的方法，其中提供所述粗甘油作为培养基中的唯一碳源。
3.根据权利要求1的方法，其中所述培养基除了包含所述粗甘油外还包含碳水化合物作为碳源。
4.根据权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
5.根据权利要求4的方法，其中所述细菌细胞选自变铅青链霉菌、枯草芽孢杆菌和锈赤链霉菌。
6.根据权利要求1的方法，其中所述宿主细胞是真菌细胞。
7.根据权利要求6的方法，其中所述真菌细胞是黑曲霉或多形汉逊氏酵母。
8.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白质是酶。
9.根据权利要求1的方法，其中所述宿主细胞在分批、补料分批或连续发酵条件下进行培养。
10.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白质对所述宿主细胞是天然的。
11.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白质对所述宿主细胞是异源的。
12.根据权利要求1的方法，其中所述蛋白质分泌到培养基中，并且其中所述方法还包括从培养基中回收所述蛋白质。
13.根据权利要求1的方法，其中所述粗甘油以0.1％到75％(v/v)的浓度存在于所述培养基中。
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