DE69133491T2

DE69133491T2 - Glucose-Isomerase mit geändertem pH-Optimum

Info

Publication number: DE69133491T2
Application number: DE69133491T
Authority: DE
Inventors: Anne-Marie Virginie Renee Lambeir; Ignace Lasters; Nadir Mrabet; Wilhelmus Johannes Quax; Jan Metske Van Der Laan; Onno Misset
Original assignee: Plant Genetic Systems NV; Genencor International Inc
Current assignee: Bayer CropScience NV; Danisco US Inc
Priority date: 1990-01-04
Filing date: 1991-01-02
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2011-01-03
Also published as: IE910011A1; FI910024A; US5384257A; HUT61328A; DE69133491D1; FI910024A0; EP0436502A3; AU6865291A; JPH06319543A; ATE310080T1; BR9100025A; CA2033658A1; FI102542B; PT96416A; EP0436502B1; CA2033658C; KR910014503A; BG93586A; HU910016D0; BG60869B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung der Protein-Engineering-Technologie, um die Eigenschaften von Metalloenzymen zu verbessern. Ein Verfahren zur Auswahl von Aminosäuren, die bei einer Abänderung das pH-Aktivitätsprofil der Metalloenzyme beeinflussen werden, wird bereitgestellt. Das Verfahren wird auf Glucoseisomerase angewendet. Die vorliegende Erfindung stellt auch mutierte Glucoseisomerase-Moleküle mit einem geänderten pH-Optimum bereit. Speziell wird die saure Seite des pH-Aktivitätsprofils in Richtung auf einen niedrigen pH verschoben.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter rekombinante Glucoseisomerasen bereit, die vorteilhaft bei der Herstellung von Fructosesirupen, insbesondere „High Fructose Corn" Sirupen, verwendet werden können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Industrielle Anwendung von Glucoseisomerase
Beim industriellen Stärkeabbau spielen Enzyme eine wichtige Rolle. Das Enzym α-Amylase wird zur Verflüssigung von Stärke in Dextrine mit einem Polymerisationsgrad von etwa 7–10 verwendet. Anschließend wird das Enzym α-Amyloglucosidase für die Verzuckerung verwendet, was einen Sirup zum Ergebnis hat, der 92–96 % Glucose enthält. Die reversible Isomerisierung von Glucose zu Fructose wird durch das Enzym Glucose(oder Xylose)isomerase katalysiert. Die korrekte Nomenklatur dieses Enzyms ist aufgrund der Präferenz des Enzyms für Xylose D-Xylose-Ketol-Isomerase (EC 5.3.1.5). Jedoch wird es, da die Hauptanwendung des Enzyms in der Umwandlung von Glucose in Fructose liegt, üblicherweise als Glucoseisomerase bezeichnet. Die Gleichgewichtskonstante für diese Isomerisierung liegt nahe bei eins, so dass unter optimalen Verfahrensbedingungen etwa 50 % der Glucose umgewandelt werden. Die Gleichgewichtsmischung von Glucose und Fructose ist als „High Fructose Sirup" bekannt.
Fructose schmeckt für Menschen viel süßer als Glucose oder Saccharose, was sie zu einem wirtschaftlich konkurrenzfähigen Zuckerersatz macht.
Viele Mikroorganismen, von denen gefunden wurde, dass sie Glucoseisomerase erzeugen, sind industriell verwendet worden. Ein detaillierter Überblick über die industrielle Verwendung von Glucoseisomerasen ist von Wen-Pin Chen in Process Biochemistry, 15, Juni/Juli (1980), 30–41, und August/September (1980) 36–41, bereitgestellt worden.
Die Wen-Pin Chen-Literaturstelle beschreibt Kulturbedingungen für die Mikroorganismen sowie Gewinnungs- und Reinigungsverfahren für das Enzym. Zusätzlich fasst sie auch die Eigenschaften von Glucoseisomerasen, wie die Substratspezifität, die Temperaturoptima und pH-Optima, die Wärmestabilität und das Metallionenerfordernis, zusammen.
Glucoseisomerase erfordert ein zweiwertiges Kation wie Mg²⁺, Co²⁺, Mn²⁺ oder eine Kombination dieser Kationen für ihre katalytische Aktivität. Die Bestimmung von 3D-Strukturen von verschiedenen Glucoseisomerasen hat die Anwesenheit von zwei Metallionen in der Monomereinheit aufgedeckt (Farber et al., Protein Eng. 1 (1987) 459–466; Rey et al., Proteins 4 (1987) 165–172; Henrick et al., Protein Eng. 1 (1987) 467–475).
Abgesehen von einer Rolle in dem katalytischen Mechanismus wird von zweiwertigen Kationen auch mitgeteilt, dass sie die Thermostabilität von einigen Glucoseisomerasen erhöhen (M. Callens et al. in Enzyme Microb. Technol. 1988 (10), 695–700). Weiter wird die katalytische Aktivität von Glucoseisomerase stark durch Ag⁺, Hg²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ und Ca²⁺ inhibiert.
Glucoseisomerasen haben gewöhnlich ihr pH-Optimum zwischen 7,0 und 9,0. Es gibt mehrere Gründe, warum es vorteilhaft wäre, Glucoseisomerase bei einem niedrigeren pH-Wert zu verwenden. Drei dieser Gründe:

a) Stabilität der Zuckermoleküle,
b) Anpassung sowohl an frühere als auch an spätere Verfahrensschritte und
c) Stabilität des Enzyms,

a) Unter alkalischen Bedingungen und bei erhöhten Temperaturen sind die Bildung von gefärbten Nebenprodukten und die Erzeugung eines nicht metabolisierbaren Zuckers (D-Psicose) ein Problem. Der gewünschte Arbeits-pH sollte bei etwa 6,0 liegen. Um diesen pH herum wäre der Abbau von Fructose und Glucose minimal.
b) Für Glucoseisomerase ist auch ein niedrigeres pH-Optimum wünschenswert, wenn dieses Enzym in Kombination mit anderen Enzymen oder zwischen anderen enzymatischen Schritten, z.B. bei der Herstellung von High Fructose Sirupen, verwendet werden soll. In diesem Verfahren wird einer der anderen enzymatischen Schritte, die Verzuckerung durch eine α-Glucoamylase, bei pH 4,5 durchgeführt.
c) Die meisten der bekannten Glucoseisomerasen werden bei pH 7,5 verwendet. Dieser pH-Wert ist ein Kompromiss zwischen einer höheren anfänglichen Aktivität bei höherem pH und einer besseren Stabilität des immobilisierten Enzyms bei niedrigerem pH, was eine optimale Produktivität bei dem gewählten pH zur Folge hat (R. v. Tilbur, Doktorarbeit: „Engineering Aspects of Biocatalysis in Industrial Starch Conversion Technology", Delftse Universitaire Pers 1983). Die Verwendung von Glucoseisomerase bei einem niedrigeren pH als 7,5 könnte aus der längeren Halbwertszeit profitieren und würde in Kombination mit einer verbesserten höheren spezifischen Aktivität dementsprechend die Produktivität des immobilisierten Enzyms bei diesem niedrigeren pH steigern.

Aus dem Vorstehenden kann geschlossen werden, dass es einen Bedarf an Glucoseisomerasen mit einer höheren Aktivität bei niedrigeren pH-Werten unter Verfahrensbedingungen gibt.
Viele Mikroorganismen wurden auf eine Glucoseisomerase mit einem niedrigeren pH-Optimum durchmustert. Trotz vieler Bemühungen führte dieser Ansatz nicht zu neuen, kommerziellen Glucoseisomerasen.
Um in der Lage zu sein, das pH-Aktivitätsprofil von Glucoseisomerasen durch Protein-Engineering in Richtung auf einen niedrigeren pH abzuändern, ist es wichtig, die zugrunde liegenden Effekte zu erkennen, welche zu der raschen Abnahme der katalytischen Leistung bei saurem pH Anlass geben.
Die Rolle von Metallionen in Enzymen
Zwei verschiedene Funktionen von Metallionen in Enzymen können erwogen werden.
Zuallererst können Metallionen eine strukturelle Rolle besitzen. Dies bedeutet, dass sie an der Beibehaltung der richtigen 3D-Struktur beteiligt sind und deshalb zur (Thermo)stabilität des Enzymmoleküls beitragen. Ein Beispiel für eine derartige strukturelle und stabilisierende Rolle ist Ca²⁺ in der Subtilisin-Familie der Serin-Proteinasen.
Zweitens können Metallionen als Cofaktor im katalytischen Mechanismus wirken. In diesem Fall hängt die Enzymaktivität streng von der Anwesenheit des Metallions im aktiven Zentrum ab. Das Metallion kann z.B. als Brücke zwischen dem Enzym und dem Substrat dienen (z.B. bindet Ca²⁺ in Phospholipase die Phosphatgruppe des Substrats) oder es kann Wasser aktivieren, so dass dieses ein stark nukleophiles Hydroxylion wird (Zn²⁺-OH^–).
Beispiele sind die Zn²⁺-Proteasen, wie Thermolysin und Carboxypeptidase, Kohlensäureanhydrase (Zn²⁺), Phospholipase-A₂ (Ca²⁺), Staphylokokken-Nuklease (Ca²⁺) und alkalische Phosphatasen (Mg²⁺, Ca²⁺). Beispiele für alpha/beta-Tonnen-Enzyme, die Kationen erfordern, um zur Übertragung von Wasserstoff eine Carboxyl- oder eine Carbonylgruppe zu polarisieren, sind Glucose/Xylose-Isomerase (Mg²⁺), Ribulose-1,5-biphosphatcarboxylase/oxigenase (RUBISCO) (Mg²⁺), Enolase (Mg²⁺), Hefe-Aldolase (Mg²⁺, K¹⁺), Mandolatracemase (Mg²⁺), Muconatcycloisomerase (Mn²⁺). In Anwesenheit von Metallchelatierungsmitteln (wie EDTA) verlieren diese Enzymen ihre Aktivität vollständig.
Die Bindung von Metallionen in einem Proteinmolekül beinhaltet gewöhnlich eine Koordination durch vier oder sechs Liganden. Abhängig von der Art von Metallion werden verschiedene Liganden gefunden. Zum Beispiel werden Magnesium und Calcium gewöhnlich von Sauerstoffatomen aus entweder einer Carbonylgruppe der Protein-Hauptkette, einer Carbonylgruppe aus einer Glutamin- oder Asparagin-Seitenkette oder dem Carboxylat aus einer Asparagin- oder Glutaminsäure-Seitenkette koordiniert. Zink- und Kupferionen werden gewöhnlich durch Stickstoffatome aus einer Histidin-Seitenkette oder die Schwefelatome aus Cystein und Methionin koordiniert.
Faktoren, die die pH-Abhängigkeit eines Enzyms bestimmen
Die Aktivität eines Enzyms hängt vom pH-Wert des wässrigen Mediums ab. Diese Abhängigkeit wird einerseits durch die (De)protonierung von ionisierbaren Gruppen im aktiven Zentrum des Enzyms und andererseits durch ionisierbare Gruppen des Substrats oder Produkts (falls vorhanden) verursacht. Ionisierbare Gruppen in Proteinen beinhalten die Seitenketten der basischen Aminosäuren Lysin, Arginin und Histidin (die in der protonierten Form eine positive Ladung tragen) und der sauren Aminosäuren Asparaginsäure, Glutaminsäure, Cystein und Tyrosin (die alle eine negative Ladung bei einer Deprotonierung tragen). Weiter tragen die Aminogruppe des N-Terminus und die Carboxylgruppe des C-Terminus eine positive bzw. negative Ladung. Die pK_S-Werte von einigen Aminosäuren sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1. Ionisierbare Gruppen von Aminosäuren, wie sie in Proteinen auftreten [Cantor und Schimmel, 1980, Biophysical Chemistry, W.H. Freeman, San Francisco]
Es sollte wahrgenommen werden, dass die pK_S-Werte für Modellverbindungen gelten und dass aufgrund der spezifischen Umgebung der ionisierbaren Gruppe große Schwankungen sowohl innerhalb als auch zwischen verschiedenen Proteinen auftreten. Es ist bekannt, dass elektrostatische Effekte eine fundamentale Rolle bei der Enzymfunktion und bei den Enzymstrukturen spielen (siehe J.A. Matthew et al., CRC Critical Reviews in Biochemistry, 18 (1985) 91–197). Die Anwesenheit einer positiven Ladung nahe einer ionisierbaren Gruppe erniedrigt deren pK_S, während eine negative Ladung eine Erhöhung des pK_S verursacht. Die Größe des Effekts nimmt mit der Entfernung zwischen der ionisierbaren Gruppe und der Ladung ab. Darüber hinaus hängt die Größe dieser Abnahme von der Dielektrizitätskonstanten des Mediums ab. Insbesondere katalytische Reste können pK_S-Werte zeigen, die von diesen Durchschnitten abweichen (siehe z.B. Fersht, Enzyme structure and mechanism, 1985, W.H. Freeman, New York).
Die pH-Abhängigkeit einer Enzym-katalysierten Reaktion kann in die pH-Abhängigkeit der Michaelis-Konstanten K_m und die pH-Abhängigkeit der Turnover-Geschwindigkeitskonstanten k_Kat (äquivalent zu V_max) aufgetrennt werden. Diese Parameter stellen die Bindung des Substrats im Grundzustand bzw. Übergangszustand dar. Die pH-abhängige (De)protonierung von Amino-Seitenketten, welche die Bindung von beiden Substratformen beeinflusst oder die auf andere Weise an dem katalytischen Ereignis beteiligt sind (z.B. Protonenaufnahme und -freisetzung, wie in der allgemeinen Basen-Katalyse), bestimmen deshalb das pH-Aktivitätsprofil eines Enzyms.
Zum Beispiel ist die Protonierung des Histidins in der katalytischen Triade von Serin-Proteasen (sowohl der Trypsin- als auch der Subtilisin-Familie) für den Aktivitätsverlust bei niedrigeren pH-Werten (< 7) verantwortlich. In diesem Fall steht der pK_S der Enzymaktivität in direkter Beziehung mit dem pK_S dieses Histidin-Restes.
Als zweites Beispiel können die zwei Asparaginsäure-Reste in Aspartylproteasen, wie Pepsin und Chymosin, erwähnt werden. Diese Gruppen bestimmen das pH-Optimum dieser Proteasen. Die typische strukturelle Anordnung der Asparaginsäuren bewirkt, dass sie verschiedene pK_S-Werte aufweisen, was zu dem glockenförmigen pH-Aktivitätsprofil führt.
Es ist bekannt, dass die Änderung der Oberflächenladung durch umfangreiche chemische Modifikation zu signifikanten Änderungen der pH-Abhängigkeit der Katalyse führen kann. Jedoch führt dieser Ansatz in vielen Fällen zur Inaktivierung und/oder zu unerwünschten strukturellen Änderungen des Enzyms, da diese Verfahren ziemlich unspezifisch sind. Es wurde gezeigt, dass eine selektive chemische Modifikation von Lysinen in Cytochrom c eine Auswirkung auf das Redox-Potential aufweist (D.C. Rees, J. Mol. Biol. 173, 323– 326 (1980)). Jedoch sind diese Ergebnisse kritisiert worden, da das für die Modifikation verwendete voluminöse chemische Reagens die Struktur des Proteins stören könnte.
Unter Verwendung der 3D-Struktur eines Proteins, um die Möglichkeit einer strukturellen Störung und ortsspezifischen Mutagenese vorauszusagen, ist es möglich, die Ladungsverteilung in einem Protein auf sehr selektive Weise zu modifizieren.
Fersht und Mitarbeiter haben gezeigt, dass es möglich ist, das pH-Aktivitätsprofil von Subtilisin durch ortsspezifische Mutagenese zu manipulieren (Thomas et al., Nature, 318, 375–376 (1985); Russell et al, J. Mol. Biol., 193, 803–813 (1987); Russel und Fersht, Nature 328, 496–500 (1987)). Die Einführung von negativ geladenen Gruppen 10–15 Å vom aktiven Zentrum von der Proteinoberfläche entfernt erhöht den pK_S-Wert des Histidins im aktiven Zentrum. Umgekehrt wird, wenn man die Oberfläche positiver geladen macht, der pK_S der sauren Gruppen erniedrigt. Die Abänderung von entweder von Asp99 13 Angström oder von Glu156 15 Angström von der aktiven Stelle entfernt zu einem Lysin erniedrigt den pK_S des Histidins im aktiven Zentrum um 0,6 pH-Einheiten. Die gleichzeitige Änderung beider Reste, was eine doppelte Mutante mit einer Änderung von 4 Ladungseinheiten ergibt, erniedrigt den pK_S um 1,0 pH-Einheiten. Es scheint, dass Änderungen der Coulomb-Wechselwirkungen kumulativ sein können.
Glucoseisomerase-Mutanten
Die WO 98/01520 (Cetus) führt eine Anzahl von Muteinen der Xyloseisomerase an, die aus Streptomyces rubiginosus erhalten werden können und die eine erhöhte Stabilität aufweisen können. Die Auswahl von möglichen Orten, die mutiert werden können, beruht auf Kriterien, die sich von den in der vorliegenden Erfindung verwendeten unterscheiden. Mehr als 300 Mutanten sind angeführt, aber es werden keine Daten bezüglich der Charakteristika und der Änderungen der mutierten Enzymmoleküle angegeben.
Methoden zum Erhalt von Enzymen mit verbesserten Eigenschaften
Enzyme mit verbesserten Eigenschaften können auf mehrere Weisen entwickelt oder gefunden werden, z.B. durch klassische Durchmusterungs verfahren, durch chemische Modifikation von existierenden Proteinen oder durch Verwendung moderner Gen- und Protein-Engineering-Techniken.
Eine ortsspezifische Mutagenese (OSM) ist die spezifischste Weise zum Erhalt von modifizierten Enzymen, welche die spezifische Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren durch irgendeine andere gewünschte Aminosäure ermöglicht.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, welche die Produktion von neuen mutierten Metalloenzymen durch Expression von Genen betreffen, die die Enzyme mit Aminosäuresequenzen codieren, welche sich in mindestens einer Aminosäure von den entsprechenden Wildtyp-Metalloenzymen unterscheiden und geänderte katalytische Eigenschaften zeigen. Speziell wird das pH-Aktivitätsprofil durch Änderung der Gesamt-Ladungsverteilung um das aktive Zentrum herum geändert.
Demgemäß stellt die Erfindung ein Verfahren zur Änderung des pH-Aktivitätsprofils eines Wildtyp-Glucoseisomerase-Enzyms auf solche Weise bereit, dass das Profil oder der saure Teil desselben in Richtung auf einen niedrigeren pH verschoben wird, welches die Substitution eines negativ geladenen Aminosäure-Restes durch einen neutralen oder durch einen positiv geladenen oder die Substitution eines neutralen Restes durch einen positiv geladenen umfasst, wobei die Substitution an einer Position stattfindet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ala25, Phe61, Gln204 und Leu258; wobei die Reste der Glucoseisomerase aus Actinoplanes missouriensis sind, deren Sequenz in 2 gezeigt ist, oder der entsprechenden Position in einer homologen Glucoseisomerase.
Die Erfindung stellt weiter ein Verfahren zum Erhalt eines mutierten Glucoseisomerase-Moleküls bereit, welches umfasst: a) Erhalten einer DNA-Sequenz, die Glucoseisomerase codiert, (b) Mutieren dieser Sequenz an ausgewählten Nukleotid-Positionen, um ein Enzym zu liefern, das an irgendeiner der Positionen Ala65, Phe61, Gln204 und Leu258 durch eine Substitution eines negativ geladenen Aminosäure-Restes durch einen neutralen oder einen positiv geladenen oder die Substitution eines neutralen Restes durch einen positiv geladenen geändert ist, wobei die Reste der Glucoseisomerase aus Actinoplanes missouriensis sind, deren Sequenz in 2 gezeigt ist, oder die entsprechende Position in einer homologen Glucoseisomerase; c) Klonieren der geänderten Sequenz in einen Expressionsvektor auf solche Weise, dass die DNA-Sequenz exprimiert werden kann; d) Transformieren eines Wirtsorganismus oder einer Wirtszelle mit dem Vektor; e) Kultivieren des Wirtsorganismus und f) Isolieren der geänderten Glucoseisomerase.
Ein derartiges Verfahren kann weiter die Verwendung der mutierten Glucoseisomerase bei der Herstellung eines Fructosesirups umfassen.
In den obigen Aspekten der Erfindung kann die Wildtyp-Glucoseisomerase aus einem Mikroorganismus der Ordnung Actinomycetales, wie Actinoplanes missouriensis, abstammen, und die Aminosäure-Ersetzungen können insbesondere A25K, F61K, Q204K und L258K sein.
Wenn die Glucoseisomerase die Actinoplanes missouriensis-Isomerase von 2 ist, kann der Ersatz F61K + K253R sein.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine schematische Darstellung des aktiven Zentrums von Glucoseisomerase aus Actinoplanes missouriensis, die von der dreidimensionalen Struktur des Glucoseisomerase/Xylit-Komplexes abgeleitet ist. Der Inhibitor ist in voller Einzelheit im Zentrum der Figur gezeigt. Bei den Aminosäure-Resten sind nur diejenigen Atome gezeichnet, die an der Wasserstoffbrückenbindung beteiligt sind. Die Namen der Aminosäure-Reste befinden sich in Kästchen, die mit durchgezogenen Linien gezeichnet sind, die Lösungsmittel-Moleküle befinden sich in Kästchen, die mit gestrichelten Linien gezeichnet sind. Die Metall-Bindungsstellen sind durch Ovale mit den Nummern 395 und 580 angezeigt. Gestrichelte Linien zeigen elektrostatische Wechselwirkungen an: Die dünnen gepunkteten Linien stellen Wasserstoffbrückenbindungen dar, die dicken gestrichelten Linien die vorgeschlagene Ligation der Metall. Streng konservierte Reste sind durch einen Stern markiert. Bei nicht-konservierten Resten sind die gefundenen Substitutionen angezeigt.
2 zeigt das Alignment von Aminosäuresequenzen von Glucoseisomerasen aus verschiedenen Quellen. Die vollständige Sequenz von Actinoplanes missouriensis-Glucoseisomerase ist angegeben. Die Aminosäuresequenz von Ampullariella-Glucoseisomerase unterscheidet sich von jener der veröffentlichten Sequenzen (Saari, J. Bacteriol, 169, (1987) 612) durch einen Rest: Es wurde gefunden, das Prolin 177 in der veröffentlichten Sequenz Arginin ist.
Die Streptomyces thermovulgaris-Sequenz ist nur bis zur Aminosäure 346 erstellt worden. Nicht bestimmte Reste sind leer gelassen worden. Ein Punkt zeigt die Abwesenheit eines Aminosäure-Restes an dieser Position im Vergleich zu irgendeiner der anderen Sequenzen an. Die unterschiedlichen Arten sind durch die folgenden Symbole angezeigt:

Ami.:: Actinoplanes missouriensis DSM 4643
Amp.:: Ampullarella species ATCC31351
Svi.:: Streptomyces violaceoruber LMG 7183
Smu.:: Streptomyces murinus
Sth.:: Streptomyces thermovulgaris DSM 40444
Art.:: Arthrobacter species
Bsu.:: Bacillus subtilus
Eco.:: Escherichia coli
Lxy.:: Lactobacillus xylosus

Die sekundäre Strukturzuordnung wurde bei der Struktur von Actinoplanes missouriensis vorgenommen. Die Helices in der Tonne sind von durch gezogenen Linien eingeschlossen. Die β-Stränge befinden sich in den schattierten Kästen.
3 zeigt das pH-Aktivitätsprofil von Glucoseisomerase in Anwesenheit von 200 mM Xylose und 10 mM Magnesium (Quadrate) und 1 mM Mangan (Kreise).
4 zeigt das Reaktionsschema für die Isomerisierung, die von Glucoseisomerase in Anwesenheit von Metallionen katalysiert wird.
E = Enzym, S = Substrat, M = Metallion, P = Produkt.
5 zeigt die pH-Abhängigkeit der Reaktion von Glucoseisomerase mit Xylose und Mg²⁺, wie in Fließgleichgewichtsexperimenten beobachtet. K₁, K₂, K₃ und K₄ sind Gleichgewichtskonstanten, die im Text erklärt werden und im Reaktionsschema von 4 angegeben sind.
6 zeigt das pH-Aktivitätsprofil der Mutanten K294R und K294Q in Anwesenheit von 200 mM Xylose und 10 mM Magnesium.
7 zeigt die pH-Aktivitätsprofile von E186Q und E186D in Anwesenheit von 200 mM Xylose und 10 mM Mg²⁺.
8 zeigt die pH-Aktivitätsprofile von E186D und E186Q in Anwesenheit von 200 mM Xylose und 1 mM Mn²⁺.
9 zeigt das pH-Aktivitätsprofil der Mutante D255N in Anwesenheit von 200 mM Xylose und 1 mM Mangan.
Die 10–20 zeigen die normierten pH-Aktivitätsprofile der folgenden Mutanten:
F254K (10), F94R (11), F61K (12), A25K (13), D57N (14), L258K (15), Q204K (16), R23Q (17), H54N (18), H290N (19), T95D (20).
Die Bedingungen sind in den Figuren erwähnt.
21 zeigt das normierte pH-Aktivitätsprofil der Mutanten F61KK253R. Die Bedingungen sind in der Figur erwähnt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Modifikation von Enzymen, um deren industrielle Anwendbarkeit zu verbessern. Die Erfindung verwendet rekombinante DNA-Techniken. Derartige Techniken liefern ein starkes Werkzeug zum Erhalt von gewünschten Aminosäure-Ersetzungen in dem Protein der Wahl. Wegen der praktisch unbegrenzten Menge an möglichen Aminosäure-Ersetzungen ist es vorzuziehen, einen selektiven Ansatz zu verwenden. Der vorliegende Ansatz beruht auf der gut koordinierten Anwendung von Protein-Kristallographie, molekularem Modellieren und molekularen Rechenverfahren, Enzymologie und Kinetik, Molekularbiologie und Proteinchemie-Techniken. Die Strategien für die Identifikation von Ziel-Mutationen sind in dem Sinn innovativ, als erkannt wird, dass Punktmutationen selten nur lokale Störungen verursachen. Mutationen beeinflussen im Allgemeinen mehrere verschiedene Eigenschaften des Proteins auf einmal. Obwohl die offenbarten Strategien gut etablierte Struktur-Funktions-Beziehungen verwenden, stellen sie deshalb auch eine rationale Weise dar, um unerwünschte Änderungen von sekundären Eigenschaften zu vermeiden oder zu korrigieren.
Eine umfangreiche biochemische Untersuchung der konstruierten Mutanten hat die Identifikation von Mutanten mit verbesserten Eigenschaften zum Ergebnis.
Mit „verbesserten Eigenschaften", wie hierin in Verbindung mit den vorliegenden Glucoseisomerase-Enzymen verwendet, meinen wir Enzyme, in denen die saure Seite des pH-Aktivitätsprofils in Richtung auf ein saureres pH-Optimum relativ zu den entsprechenden Wildtyp-Enzymen verschoben ist.
Es wurde festgestellt, dass das pH-Aktivitätsprofil von Wildtyp-Glucoseisomerase eine Verringerung der Aktivität sowohl bei einem sauren pH unterhalb von 7,0 als auch bei einem alkalischen pH jenseits von pH 8,0 zeigt (Beispiel 1 3). Wie vorstehend erörtert, wäre es vorzuziehen, Glucoseisomerase bei niedrigerem pH zu verwenden.
Überraschend wurde gefunden, dass der Abfall der Aktivität auf der sauren Seite des pH-Aktivitätsprofils durch die Protonierung einer oder mehrerer Aminosäure-Seitenketten verursacht wird, welche direkt an der Koordination des katalytischen Metallions von Glucoseisomerase beteiligt sind. Dies wurde aus der Tatsache abgeleitet, dass die scheinbaren Assoziationskontanten für die Metallbindung, wie durch Fließgleichgewichtskinetiken bestimmt, eine ähnliche pH-Abhängigkeit zeigten (Beispiel 1 5). Dies kann durch das folgende Modell beschrieben werden:
worin „Zentrum" das geometrische Bindungszentrum bezeichnet, das aus drei verschiedenen (ionisierbaren) Liganden zusammengesetzt ist. Das Enyzm ist nur aktiv, wenn das Zentrum durch ein Mg²⁺-Ion eingenommen wird, welches wiederum nur an das unprotonierte Metall-Bindungszentrum („Zentrum") und nicht an das protonierte („Zentrum: H+") binden kann. Die pH-abhängige Protonierung des Metall-Bindungszentrums ist durch den pK_S charakterisiert, während die Metallbindung an das unprotonierte Zentrum durch die Assoziationskonstante K_Ass charakterisiert ist. Die scheinbare Assoziationskonstante für die Metallbindung ist ein Funktion der wahren K_Ass, des pK_S und des pH und kann wie folgt beschrieben werden: AAss scheinbar = KAss·(1 + 10pKs – pH))–1
Die Reaktionsgeschwindigkeit ist proportional zum Bruchteil der Enzymmoleküle, der mit Mg²⁺ komplexiert ist. Dieser Bruchteil nimmt mit höherem [Mg²⁺]·K_Ass ^scheinbar zu.
Obwohl das dargestellte Modell nach einer in Glucoseisomerase gemachten Beobachtung beschrieben wurde, ist es offensichtlich, dass dieses Modell und das daraus abgeleitete Verfahren für Metalloenzyme allgemein verwendet werden kann, vorausgesetzt, dass die Inaktivierung bei niedrigem pH auf der Dissoziation der Metallionen beruht.
Der Abnahme der Aktivität, der bei alkalischem pH beobachtet wird, beruht auf einer Abnahme der maximalen Geschwindigkeit (V_max), welche die Deprotonierung eines Aminosäure-Restes widerspiegelt, der für den katalytischen Mechanismus wesentlich ist.
Aus dem oben beschriebenen Modell, das verwendet werden kann, um die Aktivitätsabnahme auf der sauren Seite des pH-Aktivitätsprofils zu erklären, kann abgeleitet werden, dass K_Ass erhöht werden muss und/oder der pK_S erniedrigt werden muss, um die Aktivität von Glucoseisomerase bei niedrigeren pH-Werten zu erhöhen.
Deshalb können DNA-Sequenzen, die Metalloenzyme wie Glucoseisomerase kodieren, auf solche Weise mutiert werden, dass die mutierten Proteine eine Änderung des pH-Aktivitätsprofils als Ergebnis einer Änderung des pK_S von Aminosäure-Seitenketten zeigen, die als Liganden bei der Metallbindung wirken.
Verschiebung des pH-Aktivitätsprofils von Metalloenzymen zu niedrigerem pH durch Änderung des pK_S von Aminosäure-Seitenketten
Um die pK_S's von Metall-koordinierenden Liganden zu einem saureren pH zu verschieben, müssen Reste eingeführt werden, welche die gesamte positive Ladung um die Metall-Bindungsstelle von Metalloenzymen herum erhöhen. Als Folge ändert sich die pH-Abhängigkeit der Aktivität von Metalloenzymen, bei denen die Aktivität auf der sauren Seite des pH-Optimums durch den pK_S der Metallbindung bewirkt wird, entsprechend. Diese Ladungsänderung wird durch weitreichende elektrostatische Effekte die negative Ladung der ionisierbaren Gruppen stabilisieren, die für die pH-Abhängigkeit der Metallbindung verantwortlich sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verschiebung des pH-Aktivitätsprofils von Glucoseisomerase zu einem saureren pH durch Erhöhen der gesamten positiven Ladung um das aktive Zentrum von Glucoseisomerase herum erzielt.
Bei etwa neutralem pH kann eine Nettoerhöhung der positiven Ladung erhalten werden durch:

– Ersetzen eines negativ geladenen Restes (Asp oder Glu) durch einen neutralen
– Ersetzen eines neutralen Restes durch einen positiv geladenen (Arg oder Lys)
– Ersetzen eines negativ geladenen Restes durch einen positiven.

Für die Auswahl von Resten, die für eine Mutation geeignet sind, können die folgenden Kriterien formuliert werden:

I. Man wähle jene Positionen, bei denen eine Substitution zu einer Nettozunahme der positiven Ladung innerhalb eines 15 Angström-Radius um die Ziel-Reste herum führt. Die Ziel-Reste sind die ionisierbaren Gruppen, die an der Koordination des Kations beteiligt sind. Man eliminiere aus dieser Sammlung: – alle Positionen, die bereits eine positive Ladung enthalten: Arginin oder Lysin – alle Positionen, die kein Arginin oder Lysin unterbringen können, da diese Reste zu einer unzulässigen Van-der-Waals-Überlappung mit den Hauptkettenatomen des Proteins führen würden; – alle Positionen, an denen ein Arginin oder ein Lysin eine umfangreiche Anpassung von zusätzliche Positionen in der direkten Umgebung erfordern würden, um Van-der-Waals-Überlappung zu vermeiden – alle Positionen, bei denen Substitution zu Arginin oder Lysin zu einer begrabenen unkompensierten Ladung in einem hydrophoben Cluster führen würde – alle Positionen, bei denen Reste nicht ersetzt werden sollten, da sie an typischen strukturellen Anordnungen beteiligt sind, wie: Salzbrücken, Packung von Helices, Stabilisierung von Helices durch Aufrechterhaltung einer negativen Ladung am Beginn der Helix, Initiierung von Helices, z.B. Proline am Beginn einer Helix, phi-psi-Winkel, die außerhalb des erlaubten Bereichs für den Rest liegen, der inseriert werden soll.
II. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die folgenden Aminosäuren ebenfalls aus der Sammlung eliminiert: – alle Reste, die an der Katalyse, Cofaktor-Bindung (wie Metallionen und Nukleotide) beteiligt sind; – alle Positionen, die unter homologen Enzymen (falls verfügbar) streng konserviert auftreten.
III. Anschließend kann jedem möglichem Mutationsort eine Priorität zugeteilt werden. Dies wird durch Überprüfung der strukturellen Umgebung des Restes, der Entfernung der „Ziel"-Reste, dem Wasserstoffbrückenbindungs-Muster, an dem der Rest beteiligt ist, und der Lösungsmittel-Zugänglichkeit vorgenommen. Um eine Maskierung der elektrostatischen Wechselwirkungen durch Gegenionen zu vermeiden, ist die Einführung von Ladungen an Orten vorzuziehen, die nicht durch Lösungsmittel von den Ziel-Resten abgeschirmt werden können. So bewirken aufgrund des Unterschieds der dielektrischen Eigenschaften zwischen dem Protein und dem Lösungsmittel Ladungen, die aufgrund der Tatsache, dass sie im Inneren des Proteins eingeschlossen oder partiell in Spalten auf der Proteinoberfläche eingeschlossen sind, nicht solvatisiert werden können, allgemein mit mehr Wahrscheinlichkeit Effekte als Ladungen, die vollständig solvatisiert sind. Darüber hinaus wird im Fall von Glucoseisomerase die Umwandlung von Glucose zu Fructose bei niedriger Ionenstärke durchgeführt, und deshalb wird erwartet, dass eine Abschirmung durch Gegenionen weniger stark die neu konstruierte Ladungs-Ladungs-Wechselwirkung in der neuen Glucoseisomerase stört, welche innerhalb der Ausführungsform der Erfindung beschrieben wird.

Kriterien für die Zuordnung von niedriger Priorität zu den obigen ausgewählten Orten, welche durch eine positive Ladung ersetzt werden, sind:

– Die Einführung einer positiven Ladung und/oder die Eliminierung einer negativen Ladung beeinflusst die Unversehrtheit der Quartärstruktur.
– Der Ort ist vollständig für Lösungsmittel zugänglich, so dass erwartet wird, dass eine eingeführte Ladung von den Ziel-Resten durch das Lösungsmittel abgeschirmt wird, was deshalb die Auswirkung auf den PK_S der Ziel-Reste verringert.

Ähnlich verschiebt die Erhöhung der gesamten negativen Ladung um die Metall-Bindungsstelle herum die pK_S's zu basischeren pH-Werten.
Verschiebung des pH-Aktivitätsprofils von Metalloenzymen zu niedrigerem pH durch Erhöhen von K_Ass der Metallbindung
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verschiebung des pH-Aktivitätsprofils zu einem niedrigeren pH durch Erhöhen der K_Ass erzielt.
Die Verschiebung des pH-Aktivitätsprofils von Metalloenzymen zu einem saureren pH kann durch Erhöhen der Assoziationskonstanten der Metallbindung erzielt werden. Die Assoziationskonstante der Metallbindung kann durch Optimieren der Koordination der Metalle durch die Liganden erhöht werden. Dies kann durch Einführung von besseren Liganden oder durch Einführung von mehr Liganden verwirklicht werden. Elektrostatische Wechselwirkungen können zu der Assoziationskonstante der Metallbindung über viel längere Entfernungen beitragen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die saure Seite des pH-Aktivitätsprofils von Glucoseisomerase durch Erhöhen der Assoziationskonstanten der Metallbindung zu niedrigerem pH verschoben.
Glucoseisomerase bindet zwei Magnesiumionen pro Untereinheit, was die Bindung von 8 Kationen pro Tetramer zur Folge hat, wodurch die Gesamtladung um +16 erhöht wird (siehe 1). Beide Bindungsstellen sind am C-terminalen Ende der β-Tonne angeordnet. Die Bindungsstelle „nach unten" ist ziemlich tief in der Tonne angeordnet und bindet im Xylit-Komplex direkt zwei Sauerstoffe aus dem Inhibitor. Die zweite Bindungsstelle („nach oben") ist nahe dem Ende der β-Tonne in der Nähe der Spalte des aktiven Zentrums und der Untereinheit-Grenzfläche angeordnet.
Im Allgemeinen hängen, wenn ein positiv geladenes Ion sich an ein zweites Teilchen bindet, die Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante sowie die Gesamtgleichgewichts-Affinitätskonstante von der Ladung des zweiten Teilchens ab. Eine Abstoßung findet statt, wenn das Teilchen ebenfalls positiv geladen ist, und eine Anziehung findet zwischen entgegengesetzten Ladungen statt. Bei kleinen Ionen und in gewissen Fällen auch Proteinen kann dieser Effekt durch Untersuchung der Ionenstärken-Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit quantifiziert werden. Die Assoziationsgeschwindigkeit von entgegengesetzt geladenen Ionen nimmt mit zunehmender Ionenstärke ab, die Assoziationsgeschwindigkeit der gleichen Ladungen nimmt mit zunehmender Ionenstärke zu, und wenn eines der Teilchen nicht geladen ist, gibt es keine Auswirkung der Ionenstärke.
Die Affinität von Glucoseisomerase zu Magnesium nimmt mit zunehmender Ionenstärke ab, was mit einer insgesamt negativen Ladung der Glucose isomerase-Bindungsstelle in Einklang steht. Die Bindung des Kations kann durch die Einführung einer geladenen Aminosäure an der Proteinoberfläche entlang der Trajektorie des Kations am Eingang des aktiven Zentrums geändert werden. Spezieller betrifft diese Erfindung die Verwendung von elektrostatischen Kräften, um die Assoziationsgeschwindigkeitskonstante des Kations zu ändern. Glucoseisomerase kann so verändert werden, dass die Assoziationsgeschwindigkeit des Kations durch die Hinzufügung von negativer Ladung (oder Deletion von positiver Ladung) nahe des Kanals des aktiven Zentrums erhöht wird oder dass die Assoziationsgeschwindigkeit des Kations durch die Hinzufügung von positiver Ladung (oder Deletion von negativer Ladung) nahe des Kanals des aktiven Zentrums verringert wird. Da nicht erwartet wird, dass die Geschwindigkeit des Entfernens wesentlich beeinflusst wird, hat eine geänderte Geschwindigkeit des Annäherns eine geänderte Gesamt-Assoziationskonstante des Kations zum Ergebnis. Da die Schleifenregionen an den C-Termini der β-Tonnenform des Eingangs des aktiven Zentrums angeordnet sind, werden die möglichen Mutationsorte in diesen Regionen gesucht. Um eine mögliche Störung der Tonnenstabilität zu vermeiden, werden Substitutionen in β-Strängen oder α-Helices nicht in Betracht gezogen. Das folgende Grundprinzip kann verwendet werden:

– Man wähle alle Reste in der Region zwischen den C-terminalen Enden der β-Stränge und den N-terminalen Enden der α-Helices.
– Man lasse alle Reste außer Betracht, bei denen eine Substitution zu einer Verringerung der positiven Nettoladung in einer Kugel mit einem Radius von 15 Angström um die Metallliganden herum führt. Die Einführung von negativen Ladungen zu nahe bei der Metall-Bindungsstellen würde den pK_S der Metallliganden zu einem höheren pH verschieben, was den Effekt einer erhöhten K_Ass bei niedrigem pH aufhebt.
– Man berechne für jeden der verbleibenden Reste dessen zugängliche Oberfläche im Kontext des Proteins und unter Verwendung einer Sonde mit einem Radius von 1,4 Å. Man lasse Reste außer Betracht, die in dem Sinn begraben sind, dass sie weniger als 10 Å² zugängliche Oberfläche aufweisen.

STRUKTURELLE INFORMATION
Information über die 3D-Struktur des Enzyms (oder Enzym:Substrat- oder Enzym:Inhibitor-Komplexes) ist von großer Bedeutung, um Voraussagen mit Bezug auf die Mutationen treffen zu können, die eingeführt werden können.
Strukturelle Daten sind für Glucoseisomerase von Streptomyces rubiginosus (Carell et al., J. Biol. Chem. 259 (1984) 3230–3236; Carell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, (1989) 440–4444), Streptomyces olivochromogenus (Farber et al., Protein Eng. 1, 1987) 467–475; Farber et al., Biochemistry 28 (1987) 7289–7297), Arthrobacter (Hendrick et al., J. Mol. Biol. 208 (1983) 137–157) und Streptomyces albus (Dauter et al., FEBS Lett. 247, 1–8) mitgeteilt worden.
Obwohl nicht alle Aminosäuresequenz-Daten für diese Enzyme verfügbar sind, ist die 3D-Strukurhomologie mit Actinoplanes missouriensis-Glucoseisomerase verblüffend (siehe F. Rey et al., Proteins 4 (1988) 165–172). Um die allgemein Anwendbarkeit des in dieser Beschreibung offenbarten Verfahrens zu zeigen, sind die Gene von Glucoseisomerase, die aus verschiedenen Arten abstammt, kloniert und sequenziert worden. Es wird gezeigt, dass die Aminosäuresequenzen von Glucoseisoermase, die von den Genen von Streptomyces violaceoruber, Streptomyces murinus, Arthrobacter spec. und Streptomyces thermovulgaris abgeleitet sind, homolog sind. Veröffentlichte Aminosäuresequenzen der Glucoseisomerasen von Ampullariella sp. (Saari, a.a.O.) und Streptomyces violaceoniger (Nucl. Acids Res. 16, (1988) 9337), die von den Nucleotidsequenzen der jeweiligen Gene abgeleitet sind, zeigen eine enge Homologie zu Actinoplanes missouriensis-Glucoseisomerase. Zusätzlich offenbart die WO 89/01520, dass die Aminosäuresequenz von Streptomyces rubiginosus-Glucoseisomerase zu Ampullariella sp.-Glucoseisomerase homolog ist.
Trotz des Fehlens von 3D-Strukturdaten für die meisten Glucoseisomerasen kann geschlossen werden, dass alle Glucoseisomerasen aus Actinomycetales eine ähnliche tetramere Organisation aufweisen.
Im Allgemeinen kann angenommen werden, dass, wenn die Gesamt-Homologie größer als 65 %, bevorzugt größer als 74 % (minimale Homologie zwischen Actinoplanes missouriensis und Streptomyces-Glucoseisomerase gemäß Amore und Hollenberg, Nucl. Acids, 17, 7515 (1989)) und bevorzugt größer als 85 % ist und wenn die 3D-Struktur ähnlich ist, Aminosäure-Ersetzungen zu ähnlichen Änderungen des pH-Optimums führen. Speziell erwartet man, dass Glucoseisomerasen aus Arten, die zu der Ordnung der Actinomycetales gehören, einen solchen hohen Grad an Ähnlichkeit aufweisen, dass die Änderungen des pH-Optimums aufgrund von Aminosäure-Ersetzungen an den ausgewählten Orten ähnlich sind. Actinoplanes missouriensis ist die bevorzugte Quelle von Glucoseisomerase für eine Mutation.
1 gibt eine schematische Darstellung des aktiven Zentrums der Glucoseisomerase aus Actinoplanes missouriensis wieder.
2 zeigt die nach einem Ähnlichkeitsvergleich ausgerichteten Aminosäuresequenzen von verschiedenen Glucoseisomerasen.
In der vorliegenden Beschreibung werden sowohl der 3-Buchstaben- als auch der 1-Buchstaben-Code für Aminosäuren verwendet (siehe z.B. Stryer, L., Biochemistry, S. 13, 2. Aufl., W.H. Freeman and Comp., NY 1981).
EXPERIMENTELLER TEIL
Klonierung und Expression des D-Glucoseisomerase-Gens
D-Glucoseisomerase (GI) wird synonym für D-Xyloseisomerase (D-Xylose-Ketol-Isomerase, EC 5.3.1.5) verwendet, ein Enzym, das D-Xylose in D-Xylulose umwandelt. Die D-Glucoseisomerase aus Actinoplanes missouriensis, die von gentechnisch veränderten E. coli-Stämmen produziert wird, wird als EcoAmi (DSM) GI bezeichnet. Um das Actinoplanes missouriensis-Gen, das GI codiert, von dem analogen E. coli xylA-Gen zu unterscheiden, wird das erstgenannte als GI bezeichnet.
Verfahren zur Manipulation von DNA-Molekülen sind in Maniatis et al. (1982, Cold Spring Harbor Laboratory) und Ausubel et al. (1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. New York), beschrieben. Die Klonierung und DNA-Sequenzbestimmung des Glucoseisomerase-Gens aus Actinoplanes missouriensis DSM 43046 ist in der EP-A-0351029 beschrieben.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz von GI ist in 2 nummeriert und mit anderen Glucoseisomerasen verglichen. Im Folgenden bezieht sich die Nummerierung der Aminosäuren auf 2.
Wildtyp- und mutierte GI-Enzyme wurden im E. coli-Stamm K514 erzeugt, welche wie in der EP-A-0351029 beschrieben gezüchtet wurde.
Assay der enzymatischen Aktivität des Expressionsprodukts
Die enzymatische Aktivität von Glucoseisomerase wurde wie nachstehend beschrieben getestet (1 Einheit enzymatische Aktivität erzeugt 1,0 Mikromol Produkt-D-Xylulose oder -D-Fructose pro Minute; deshalb ist die spezifische Aktivität – spA – als Einheiten pro mg GI-Enzyme ausgedrückt.
Die GI-Aktivität kann direkt durch Messen der Zunahme der Extinktion bei 278 nm der durch Isomerisierung von Xylose durch Glucoseisomerasen bei 35 °C erzeugten Xylulose bestimmt werden. Dieser Assay wurde in 50 mM Triethanolamin-Puffer, pH 7,5, der 10 mM MgSO₄ enthielt, in Anwesenheit von 0,1 M Xylose durchgeführt. Die Glucoseisomerase-Endkonzentration in dem Assay betrug ± 0,01 mg/ml und wurde vor Verdünnung in der enzymatischen Assay-Mischung durch Absorptionsspektroskopie unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,08 bei 278 nm für eine 1,0 mg/ml-Lösung des Enyzms genau bestimmt.
Die spezifische Aktivität wurde in dem gekuppelten D-Sorbit-Dehydrogenase-Assay bestimmt, die enzymatische Bestimmung von D-Xylulose wurde bei 35 °C wie früher beschrieben (Kersters-Hilderson et al., Enzyme Microb. Technol. 9 (1987) 145) in 50 mM Triethanolamin, pH 7,5, 10 mM MgSO₄ and 0,1 M Xylose in Anwesenheit von ± × 10^–8 M D-Sorbit-Dehydrogenase (L-Iditol: NAD-Oxidoreduktase, EC 1.1.14) und 0,15 nM NADH durchgeführt, außer dass der Inkubationspuffer auch 1 mM Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure (EGTA) einschloss. Die Glucoseisomerase-Endkonzentration in diesem Assay betrug ± 2,5 × 10^–3 mg/ml und wurde genau bestimmt, wie oben beschrieben.
Mit Glucose als Substrat kann die GI-Aktiviät durch Messen der während der Isomerisierungsreaktion erzeugten D-Fructose unter Verwendung der Cystein-Carbazol-Methode (CCM) bestimmt werden, welche auf der Reaktion von Ketozuckern mit Carbazol in Säuren beruht, die ein purpurrotes Produkt liefert (Dische und Borenfreund, J. Biol. Chem. 192 (1951) 583).
BEISPIEL 1
Die pH-Abhängigkeit der Glucoseisomerase-Aktivität
Um das pH-Aktivitätsprofil von Wildtyp- und mutierter Glucoseisomerase zu bestimmen, wurde die Aktivität als Funktion des pH (5,2–8,0) in Anwesenheit von 10 mM MgSO₄ und 200 mM Xylose (unter Verwendung des direkten Assay-Verfahrens) gemessen. Bei Mutanten mit sehr geringer Aktivität wurde das gekuppelte Sorbit-Dehydrogenase-Assaysystem zwischen pH 5,8 und 8,4 verwendet. Es wurde dafür gesorgt, dass die Sorbit-Hydrogenase-Reaktion bei extremen pH-Werten nicht geschwindigkeitsbegrenzend wurde.
Das pH-Aktivitätsprofil von Glucoseisomerase (d.h. dem rekombinanten Wildtyp-Enzym aus Actinoplanus missouriensis) in Anwesenheit von 200 mM Xylose und verschiedenen aktivierenden Kationen ist in 3 gezeigt. Es zeigt eine Abnahme der Aktivität sowohl bei einem sauren pH unterhalb von 7,0 als auch einem alkalischen pH jenseits von 8,0.
Der geeignete kinetische Fließgleichgewichtsmechanismus für Glucoseisomerase beinhaltet die rasche Bildung eines Enyzm-Metall-Zucker-Komplexes, der in einem geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt (sogenanntes rasches Gleichgewicht – statistisch geordneter Mechanismus – siehe 4) in das Produkt umgewandelt wird. Gleichgewichts- und Übergangskinetik-Fluoreszenmessungen (gestoppter Fluss) zeigen die Anwesenheit von zwei Metallionen-Bindungsstellen an. In dem Experiment mit gestopptem Fluss binden die Metallionen aufeinanderfolgend. Das Metall mit hoher Affinität spielt eine Rolle bei der Aufrechterhaltung einer aktiven Konformation und wird deshalb als die „Konformations"-Stelle bezeichnet. Die zweite Metall-Bindungsstelle bringt das aktivierende Kation unter, deshalb wird diese Stelle gewöhnlich als die „katalytische" Stelle angegeben. Das in 4 gezeigte Reaktionsschema erscheint angemessen zu sein, um Fließgleichgewichtszustands-Experimente und Experimente mit gestopptem Fluss zu analysieren und zu vergleichen. Im Prinzip unterscheiden Fließgleichgewichts-Ergebnisse nicht zwischen den zwei Metallbindungstellen, aber es wird angenommen, dass der Haupteffekt aus der katalytischen Metallbindung herrührt.
Die Analyse der anfänglichen Geschwindigkeit (v) der Xylose-Umwandlung als Funktion der Xylose- und Magnesium-Konzentration ermöglicht es, vier Parameter zu bestimmen: die maximale Geschwindigkeit, die Gleichgewichtskonstanten der Magnesiumbindung an das freie Enzym (K₁), des Enzym-Zucker-Komplexes (K₄) und die Gleichgewichtskonstanten der Xylosebindung an das freie Enzym (K₂) und den Enzym-Magnesium-Komplex (K₃)
worin [M] und [S] die Konzentration des Metallions bzw. von Xylose darstellen.
Durch systematische Abwandlung der Magnesiumionen- und der Xylose-Konzentration war es möglich, Werte für die maximale Geschwindigkeit und für alle vier Gleichgewichtskonstanten zu erhalten. 5 zeigt die pH-Abhängigkeit dieser Parameter.
Der Vergleich der Ergebnisse der 3 und 5 zeigt, dass die saure Seite des pH-Profils vollständig durch die Metallionen-Bindung bestimmt wird.
Die Daten von 5 sind nicht ausreichend genau, um die Zahl der beteiligten Ionisationen zu berechnen. Die Steigung der Diagramme von log K_1,4 gegen den pH (Steigung > 1) zeigt jedoch an, dass mehr als eine Ionisation beteiligt sein könnte. Die Ähnlichkeit der pH-Abhängigkeit von K₁ und K₄ zeigt an, dass die gleichen ionisierenden Gruppen für diese beide Prozesse (an denen dasselbe Zentrum beteiligt ist) wichtig sind.
BEISPIEL 2
Auswahl von Aminosäure-Resten in Glucosisomerase deren Substitution die pK_S-Werte der Metallbindung ändern wird ionisierbare Aminosäuren
Im Fall von Glucoseisomerase wurden die Kriterien für die Auswahl von möglichen Positionen für eine Substitution, wie in der detaillierten Beschreibung dieser Erfindung umrissen, unter Verwendung der ausgerichteten Sequenzen aus verschiedenen Quellen (2) und der hoch verfeinerter Struktur von Actinoplanes missouriensis-Glucoseisomerase im Komplex mit dem Inhibitor Xylit (siehe 1 und „strukturelle Information" in der „detaillierten Beschreibung der Erfindung") angewendet. Die hoch verfeinerte Struktur mit einer Auflösung von 2,2 Angström gibt die Position des Inhibitors und der zwei Metall-Bindungsstellen wieder. Eine schematische Darstellung des aktiven Zentrums der Glucoseisomerase von Actinoplanes missouriensis ist in 1 gegeben.
Aus der Glucoseisomerase-Struktur, die mit Cobalt und Xylit komplexiert ist, wurden jene Reste ausgewählt, bei denen eine Substitution zu einem positiver geladenen Aminosäure-Rest zu einer Nettozunahme der positiven Ladung innerhalb eines Radius von 15 Angström um die ionisierbaren Ziel-Gruppen herum führt. Im Fall von Glucoseisomerase sind die Ziele die ionisierbaren Gruppen, die an der Koordination der für die Aktivität erforderlichen Metallionen beteiligt sind. Diese ionisierbaren Ziel-Gruppen beinhalten die Carboxylgruppen von Glu181, Glu217, Asp245, Asp255, Asp292 und das NE von His220.
Nach Anwendung von Kriterium I wurden 80 mögliche Mutationsorte aufrechterhalten. Diese Orte sind nachstehend zusammengefasst:
Ala5, Phe11, Leu15, Trp20, Gln21, Ala25, Phe26, Asp28, Ala29, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe53, His54, Asp56, Asp57, Phe61, Ile85, Met88, Phe94, Thr95, Phe104, Gln122, Thr133, Leu134, Val135, Ala143, Tyr145, Tyr158, Asn163, Ser169, Glu181, Asn185, Glu186, Gly189, Ile191, Pro194, His198, Gln204, Leu211, Phe212, Asn215, Glu217, Thr218, His220, Glu221, Gln222, Ser224, Asn225, Leu226, Phe228, Thr229, Gly231, Leu236, His238, His243, Asp245, Asn247, His250, Phe254, Asp255, Gln256, Asp257, Leu258, Val259, Phe260, His262, Leu271, Tyr285, Asp286, His290, Asp292, Tyr293, Thr298, Glu299, Trp305, Ala310, Met314, Val380, Asn383.
Nach Verwerfen der katalytischen Reste und der streng konservierten Reste (Kriterium II) bleiben die folgenden 62 Reste übrig:
Ala5, Leu15, Gln21, Ala25, Phe26, Asp28, Ala29, Gly47, Tyr49, Thr52, Asp56, Phe61, Ile85, Met88, Thr95, Phe104, Gln122, Thr133, Leu134, Ala143, Tyr145, Tyr158, Asn163, Ser169, Asn185, Gly189, Ile191, Pro194, His198, Gln204, Leu211, Phe212, Thr218, Gln222, Ser224, Asn225, Leu226, Phe228, Thr229, Gly231, Leu236, His238, His243, His250, Phe254, Gln256, Asp257, Leu258, Val259, His262, Leu271, Tyr285, Asp286, His290, Tyr293, Thr298, Glu299, Trp305, Ala310, Met314, Val380, Asn383.
Anschließend wurde gemäß dem Kriterium III jedem dieser 62 möglichen Mutationsorte eine Priorität zugeteilt. Den folgenden 24 Orten wurde zugeteilt, dass sie eine hohe Priorität für eine Mutagenese aufweisen: Ala25, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe61, Ile85, Thr95, Gln122, Thr133, Tyr145, Tyr158, Gly189, Ile191, Gln204, Thr218, Gln222, Leu226, Thr229, Gly231, Leu236, Gln256, Leu258, Tyr293 und Val380.
Die Mutation von entweder einer oder mehreren der 80 ausgewählten Aminosäure-Reste in positiv geladene Reste wird eine Verringerung des pK_S der Metallbindung zu Glucoseisomerase zur Folge haben. Dies kann eine entsprechende Verschiebung des pH-Aktivitätsprofils in Richtung auf einen niedrigeren pH zum Ergebnis haben.
Entsprechend wird die Mutation von entweder einem oder mehreren der 80 ausgewählten Aminosäure-Reste in negativ geladenen Reste eine Erhöhung des pK_S der Metallbindung von Glucoseisomerase zur Folge haben. Dies kann eine entsprechende Verschiebung des pH-Aktivitätsprofils in Richtung auf einen höheren pH zum Ergebnis haben.
BEZUGSBEISPIEL A
Die Auswirkung der Mutation von Lys294 auf das pH-Aktivitätsprofil
In der Position 294 in Glucoseisomerase ist eine positive Ladung etwa 8 Angström entfernt von der höchsten besetzten Metall-Bindungsstelle im Glucosesomerase-Xylit-Komplex (395 in 1) angeordnet. Es wurde eine Mutation an diesem Ort vorgenommen, wobei das Lysin durch ein Arginin ersetzt wurde. Diese Mutation konserviert die positive Ladung in Position 294. In Übereinstimmung mit dieser Konservierung der positiven Ladung steht die Beobachtung, dass das pH-Aktivitätsprofil dieser Mutanten dem des Wildtyp-Enzyms ähnlich ist.
Wenn jedoch an Position 294 die positive Ladung durch Ersatz von Lysin294 durch ein Glutamin entfernt wird, beobachteten wir eine Verschiebung des pH-Aktivitätsprofils in Richtung auf die alkalische Seite um etwa 0,5 pH-Einheiten. Die pH-Aktivitätsprofile für K294R und K294Q sind in 6 gezeigt.
Dieses Beispiel erläutert, dass es möglich ist, den pK_S einer oder mehrerer funktioneller Gruppen im aktiven Zentrum von Glucoseisomerase durch Änderung der Nettoladung des Proteins um das aktive Zentrum herum zu manipulieren.
BEZUGSBEISPIEL B
Die Auswirkung einer Mutation von Glu186 und des Ersatzes von Magnesiumionen durch Manganionen auf das pH-Aktivitätsprofil
In der Mutante E186Q ist eine negative Ladung durch eine neutrale ersetzt, was eine Nettozunahme der positiven Ladung innerhalb eines Radius von 15 Angström um die Liganden herum entstehen lässt. Das pH-Aktivitätsprofil der E186Q-Mutante in Anwesenheit von Magnesium ist in 7 gezeigt. Die alkalische Seite des pH-Profils ist deutlich in Richtung eines niedrigeren pH verschoben. In Anwesenheit von Mangan anstelle von Magnesium ist das pH-Aktivitätsprofil von E186Q zu einem niedrigeren pH verschoben, und bei seinem optimalen pH ist seine Aktivität höher als die des Wildtyps (8).
Für Anwendungen, bei denen andere Metallionen als Magnesium verwendet werden können, ist die Kombination E186Q mit Mangan bei niedrigem pH eine interessante Wahlmöglichkeit.
Wir führten auch die Mutation E186D durch, die bezüglich der Ladung konservierend ist. Das pH-Aktivitätsprofil dieser Mutante ist in den 7 und 8 gezeigt. Die pH-Abhängigkeit der Aktivität der E186D-Mutante ist nicht signifkant von derjenigen des Wildtyp-Enzyms verschieden. Die Entfernung der negativen Ladung an Position 186 verschob das pH-Aktivitätsprofil zu einem saureren pH. Dieses Beispiel betont, dass das Grundprinzip der Mutation E186Q gültig ist.
BEZUGSEISPIEL C
Die Auswirkung des Ersatzes von Asp255 auf das pH-Aktivitätsprofil
Die Substitution der negativen geladenen Asparaginsäure in Position 255, die in der Tat ein Metall-Bindungsligand in Glucoseisomerase ist, durch ein neutrales Asparagin bewirkt eine Verschiebung des pH-Aktivitätsprofils in Richtung auf einen niedrigeren pH in Anwesenheit von Mangan. Das pH-Optimum wird etwa 2 pH-Einheiten in Richtung auf einen saureren pH verschoben.
Das pH-Aktivitätsprofil ist in 9 gegeben.
BEISPIEL 3
Glucoseisomerase mit einem geänderten pH-Aktivitätsprofil
Mutanten von Glucoseisomerase, die gemäß den Verfahren geschaffen wurden, welche in der detaillierten Beschreibung der Erfindung umrissen sind, wurden bezüglich ihrer pH-Aktivitätsbeziehung unter Bedingungen getestet, die in den Figuren (10–20) angegeben sind. Das pH-Aktivitätsprofil einer Mutanten ist das Ergebnis der Auswirkung der Mutation auf den pK_S einerseits und der Auswirkung auf die K_Ass andererseits.
Die Ergebnisse für die folgenden Mutanten sind in den Figuren angegeben:
F254K (10), F94R (11), F61K (12), A25K (13), D57N (14), L258K (15), Q204K (16), R23Q (17), H54N (18), H290N (19), T95D (20).
Bei den Mutanten, in die eine positive Ladung (F254K, F94R, F61K, A25K, L258K, Q204K) eingeführt oder eine negative Ladung neutralisiert wurde (D57N), ist ersichtlich, dass die saure Seite des pH-Aktivitätsprofils in Richtung auf einen niedrigeren pH verschoben ist.
Bei Mutanten, in die eine negative Ladung eingeführt wurde (T95D) oder eine positive Ladung neutralisiert wurde (R23Q, H54N, H290N), ist ersichtlich, dass das pH-Aktivitätsprofil in Richtung auf einen höheren pH verschoben ist.
Die beide Beobachtungen stehen im Einklang mit dem Modell, das in der detaillierten Beschreibung der Erfindung dargelegt ist.
Jedoch sollte bemerkt werden, dass Mutanten, in denen eine konservierte Aminosäure ersetzt worden ist (F94R, D57N, H54N), eine drastische Abnahme der spezifischen Aktivität bei Xylose ergeben. In Position 254 in dem Sequenz-Alignment (2) werden nur hydrophobe Aminosäuren gefunden. Die Einführung einer geladenen Aminosäure (F254K) in diese Position führt auch zu einer drastischen Abnahme der spezifischen Aktivität. So kann geschlossen werden, dass, obwohl (halb)konservierte Aminosäure-Positionen zur Änderung von Ladungen verwendet werden können, um das pH-Aktivitätsprofil zu modifizieren, diese nicht bevorzugte Orte sind.
BEISPIEL 4
Stabilisierung von Mutanten mit einem geänderten pH-Optimum, um eine bessere Leistung unter Anwendungsbedingungen zu erhalten
Die Mutanten H290N und F61K ergeben die erwartete Verschiebung des pH-Aktivitätsprofils, wie in Beispiel 6 beschrieben. Von diesen Mutanten wurde H290N immobilisiert, wie in der EP-A-351029 (Beispiel 7) beschrieben. Ein Anwendungstest der Wildtyp- und dieser mutierten Glucoseisomerase wurde durchgeführt, wie es in derselben Anmeldung (Beispiel 8) beschrieben ist. Die Stabilität wird durch die Zerfallskonstante erster Ordnung (K_Z, je niedriger die Zerfallskonstante ist, desto stabiler ist das Enzym) angezeigt. Tabelle 2 gibt die KZ-Werte für die Wildtyp- und mutierte Glucoseisomerase wieder. Tabelle 2 Zerfallskonstanten für Wildtyp- und mutierte Glucoseisomerase, immobilisiert auf Lewatit

K_Z(× 10⁶ s^–1)

Wildtyp 2,5

H290N 3,1

K253R 0,7

H290NK253R 1,6

F61KK253R 1,4
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, ist H290N im Vergleich zur Wildtyp-Glucoseisomerase destabilisiert. Es wurde gefunden, dass K253R die Wildtyp-Glucoseisomerase um eine Faktor von mehr als 3 stabilisiert. Das pH-Aktivitätsprofil der K253R-Mutanten ist identisch mit dem des Wildtyp-Enzyms.
Die Kombination der pH-Mutante H290N mit der Stabilitätsmutante K253R zeigt, dass pH-Mutanten durch Einführen von Mutationen stabilisiert werden können, von denen gezeigt worden ist, dass sie das Wildtyp-Enyzm stabilisieren.
Zusätzlich zeigt Tabelle 2, dass die pH-Mutante F61K nach Einführen von K253R mit Bezug auf das Wildtyp-Enzym stabilisiert ist.
Die saure Verschiebung des pH-Aktivtätsprofils von F61K wird in der doppelten Mutante aufrechterhalten (21). Dies zeigt, dass Mutationen, welche verschiedene Eigenschaften eines Enzyms verbessern, in einer neuen Mutante kombiniert werden können, welche die verbesserten Eigenschaften der individuellen Mutationen (in diesem Fall ein verbessertes pH-Optimum und eine verbesserte Stabilität) beherbergt.
Es versteht sich, dass die oben erwähnten Beispiele dazu dienen sollen, das Konzept der Erfindung zu demonstrieren, welche in den Ansprüchen definiert ist.
Es sollte klar sein, dass die Kombinationen der oben erwähnten Mutationen mit anderen Mutationen, die zu geänderten Eigenschaften, z.B. Thermostabilität, Metallbindung oder Substratspezifität, führen, ebenfalls durch die vorliegende Erfindung umfasst werden.

Claims

Verfahren zur Änderung des pH-Aktivitätsprofils eines Wildtyp-Glucoseisomerase-Enzyms derart, dass das Profil oder der saure Teil desselben in Richtung auf einen niedrigeren pH verschoben wird, umfassend die Substitution eines negativ geladenen Aminosäure-Restes (Asp oder Glu) durch einen neutralen oder durch einen positiv geladenen oder die Substitution eines neutralen Restes durch einen positiv geladenen (Arg oder Lys), wobei die Substitution an einer Position stattfindet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Ala25, Phe61, Gln204 und Leu258; wobei die Reste der Glucoseisomerase aus Actinoplanes missouriensis, deren Sequenz in 2 gezeigt ist, oder der entsprechenden Position in einer homologen Glucoseisomerase sind.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Wildtyp-Glucoseisomerase aus einem Mikroorganismus der Ordnung Actinomycetales erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 2, in dem die Wildtyp-Glucoseisomerase aus Actinoplanes missouriensis erhalten wird.
Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, in dem die Glucoseisomerase mindestens eine der folgenden Aminosäure-Ersetzungen enthält: A25K, F61K, Q204K und L258K.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Glucoseisomerase die Actinoplanes missouriensis-Isomerase von 2 ist und den Ersatz F61K+K253R enthält.
Verfahren zum Erhalten eines mutierten Glucoseisomerase-Moleküls, welches umfasst: (a) Erhalten einer DNA-Sequenz, die eine Glucoseisomerase codiert; (b) Mutieren dieser Sequenz an ausgewählten Nukleotid-Positionen, um ein Enzym bereitzustellen, das an irgendeiner der Positionen Ala25, Phe61, Gln204 und Leu258 durch eine Substitution eines negativ geladenen Aminosäurerestes (Asp oder Glu) durch einen neutralen oder einen positiv geladenen oder die Substitution eines neutralen Restes durch einen positiv geladenen (Arg oder Lys) geändert ist, wobei die Reste der Glucoseisomerase aus Actinoplanes missouriensis, deren Sequenz in 2 gezeigt ist, oder die entsprechende Position in einer homologen Glucoseisomerase sind; (c) Klonieren der geänderten Sequenz in einen Expressionsvektor auf solche Weise, dass die DNA-Sequenz exprimiert werden kann; (d) Transformieren eines Wirtsorganismus oder einer Wirtszelle mit dem Vektor; (e) Kultivieren des Wirtsorganismus; und (f) Isolieren der geänderten Glucoseisomerase.
Verfahren nach Anspruch 6, in dem die Wildtyp-Glucoseisomerase aus einem Mikroorganismus der Ordnung Actinomycetales erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 7, in dem die Wildtyp-Glucoseisomerase aus Actinoplanes missouriensis erhalten wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 8, in dem die Glucoseisomerase mindestens eine der folgenden Aminosäure-Ersetzungen enthält: A25K, F61K, Q204K und L258K.
Verfahren nach Anspruch 6, in dem die Glucoseisomerase die Actinoplanes missouriensis-Isomerase von 2 ist und den Ersatz F61K+K253R enthält.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 10, das weiter die Verwendung der mutierten Glucoseisomerase bei der Herstellung eines Fructosesirups umfasst.