FI102542B - Muuttuneen pH-profiilin omaavat uudet glukoosi-isomeraasit - Google Patents

Description

102542

Muuttuneen pH-profiilin omaavat uudet glukoosi-isomeraasit Tämä keksintö koskee proteiinitekniikan sovellutusta me-talloentsyymien, erityisesti glukoosi-isomeraasien ominaisuuksien parantamiseksi. Tässä esitetään menetelmä aminohappojen valitsemiseksi, joiden muutos vaikuttaa glukoosi-isomeraasien pH-aktiivisuusprofiiliin. Tämä keksintö koskee myös muuttuneen pH-optimin omaavia, mutatoituja glukoosi-isomeraasimolekyylejä. Erityisesti pH-aktiivi-suusprofiilin hapan pää on siirtynyt alhaisemman pH:n suuntaan.

Tämä keksintö koskee myös yhdistelmäglukoosi-isomeraaseja, joita voidaan edullisesti käyttää fruktoosisiirappien, erityisesti fruktoosipitoisen maissisiirapin (high fructose corn syrups) valmistamiseksi.

Glukoosi-Isomeraasln teollinen käyttö

Teollisessa tärkkelyshajotuksessa entsyymeillä on tärkeä rooli. Entsyymiä, joka on α-amylaasi, käytetään tärkkelyksen nesteyttämiseksi dekstriineiksi, joilla polymerointi-aste on noin 7-10. Myöhemmin entsyymiä, joka on a-amylo-glukosidaasi, käytetään sokeroimiseen, jonka tuloksena saadaan siirappi, joka sisältää 92-96 % glukoosia. Glukoo-·. sin reversiibeliä isomeroitumista fruktoosiksi katalysoi entsyymi nimeltään glukoosi- (tai ksyloosi-)isomeraasi. Tämän entsyymin oikea nimitys on D-ksyloosi-ketoli-isomeraasi (EC 5.3.1.5) johtuen siitä, että entsyymi asettaa etusijalle ksyloosin. Kuitenkin koska entsyymiä pääasiallisesti käytetään muutettaessa glukoosi fruktoosiksi, sitä yleisesti kutsutaan glukoosi-isomeraasiksi. Tämän isome-roitumisen tasapainovakio on lähellä yhtä, jolloin optimaalisissa prosessioloissa noin 50 % glukoosista muuttuu. Glukoosin ja fruktoosin tasapainoseos tunnetaan fruktoosi-pitoisena siirappina.

2 102542

Ihminen maistaa fruktoosin paljon makeampana kuin glukoosin tai sakkaroosin, mikä tekee siitä taloudellisesti kilpailukykyisen sokerisubstituutin.

Monia mikro-organismeja, joiden on todettu tuottavan glu-koosi-isomeraasia, on käytetty teollisesti. Yksityiskohtaisen katsauksen glukoosi-isomeraasien teollisesta käytöstä on esittänyt Wen-Pin Chen, Process Biochemistry, 15 June/July (1980) 30-41 ja August/September (1980) 36-41.

Wen-Pin Chen'in viitteessä kuvataan viljelyolosuhteet mikro-organismeille sekä talteenotto- ja puhdistusmenetelmät entsyymille. Lisäksi siihen on myös koottu glukoosi-isomeraasien ominaisuudet, kuten substraattispesifisyys, lämpö-tilaoptimit ja pH-optimit, lämpöstabiliteetti ja metalli-ionivaatimus.

Glukoosi-isomeraasi vaatii kaksiarvoisen kationin, kuten Mg2+:n, Co2+:n, Mn2+:n tai näiden kationien yhdistelmän, katalyyttiseen aktiivisuuteensa. Erilaisten glukoosi-isomeraasien 3D-rakenteiden määrityksen yhteydessä on paljastunut, että niissä esiintyy kaksi metalli-ionia monomeeri-sessä yksikössä (Farber et ai., Protein Eng. l (1987) 459-466; Rey et ai.. Proteins 4 (1987) 165-172; Henrick et ai., Protein Eng. 1^ (1987) 467-475).

Katalyyttisessä mekanismissa esiintyvän roolin lisäksi kaksiarvoisten kationien on esitetty myös lisäävän eräiden glukoosi-isomeraasien lämpöstabiliteettia (M.Callens et ai., Enzyme Microb.Technol. 1988 (10), 695-700). Lisäksi glukoosi-isomeraasin katalyyttistä aktiivisuutta inhiboi pahasti Ag+, Hg2+, Cu2+, Zn2+ ja Ca2+.

Glukoosi-isomeraasien pH-optimi on tavallisesti välillä 7,0 - 9,0. On olemassa useita syitä, miksi olisi edullista käyttää glukoosi-isomeraasia alhaisemassa pH-arvossa. Koi- •« 3 102542 me tällaista syytä, jotka ovat a) sokerimolekyylien stabiliteetti; b) sekä edeltävien ja/tai myöhempien prosessivaiheiden soveltaminen , j a c) entsyymin stabiliteetti; esitetään seuraavassa tämän asian kuvaamiseksi.

a) Aikalisissä oloissa ja korotetuissa lämpötiloissa värillisten sivutuotteiden muodostuminen ja metaboloitu-mattoman sokerin (D-psikoosin) muodostuminen ovat ongelma. Halutun työskentely-pH:n tulisi olla noin 6,0. Tämän pH:n ympärillä glukoosin ja fruktoosin hajoaminen olisi minimaalinen.

b) Alentunut pH-optimi on toivottava myös glukoosi-isome-raasin kannalta, silloin kun tätä entsyymiä käytetään yhdessä muiden entsyymien kanssa tai muiden entsymaattisten vaiheiden välillä, esimerkiksi valmistettaessa fruktoosi-pitoisia siirappeja (high fructose syrups). Tässä prosessissa yksi muista entsymaattisista vaiheista, sokeroiminen a-glukoamylaasilla, suoritetaan pH-arvossa 4,5.

c) Useimpia tunnettuja glukoosi-isomeraaseja käytetään pH:ssa 7,5. Tämä pH-arvo on kompromissi suuremman alkuak- \ tiivisuuden, joka saavutetaan korkeammalla pH-arvolla, ja immobilisoidun entsyymin paremman stabiliteetin, joka saadaan alhaisemmalla pH-arvolla, välillä johtaen optimaaliseen tuottavuuteen valitussa pH:ssa (R.v.Tilburg, Thesis: "Engineering aspects of Biocatalysts in Industrial Starch Conversion Technology", Delftse Universitaire Pers, 1983). Käyttämällä glukoosi-isomeraasia pH:ssa, joka on alhaisempi kuin 7,5, voitaisiin hyötyä pidemmästä puoliintumisajasta ja yhdessä parantuneen korkeamman spesifisen aktiivisuuden kanssa seurauksena olisi immobilisoidun entsyymin tuottavuuden lisäys tuossa alhaisemmassa pH:ssa.

4 102542

Edellä esitetystä voidaan päätellä, että tarvitaan glukoo-si-isomeraaseja, joilla on suurempi aktiivisuus alhaisemmissa pH-arvoissa reaktio-oloissa.

Monet mikro-organismit testattiin glukoosi-isomeraasin suhteen alhaisemmalla pH-optimilla. Huolimatta monista yrityksistä, tämä lähestymistapa ei johtanut uusiin, kaupallisiin glukoosi-isomeraaseihin.

Jotta glukoosi-isomeraasien pH-aktiivisuusprofiilia voidaan muuttaa kohti alhaisempaa pH:ta proteiinitekniikalla, on tärkeätä tunnistaa ne ensisijaiset vaikutukset, jotka johtavat nopeaan vähenemiseen katalyyttisessä tapahtumassa happamassa pH:ssa.

Metalli-ionien rooli entsyymeissä

Metalli-ioneille voidaan havaita kaksi erilaista funktiota entsyymeissä.

Ennen kaikkea metalli-ioneilla voi olla rakenteellinen rooli. Tämä tarkoittaa sitä, että ne osallistuvat oikean 3D-rakenteen ylläpitoon ja siitä syystä tukevat entsyymi-molekyylin (lämpö)stabiliteettia. Esimerkki tällaisesta rakenteellisesta ja stabiloivasta roolista on Ca2+ serii-niproteinaasien subtilisiini-perheessä.

Toiseksi metalli-ionit voivat toimia kofaktoreina katalyyttisessä mekanismissa. Tässä tapauksessa entsyymiaktiivisuus on selvästi riippuvainen metalli-ionin esiintymi-.·: sestä aktiivikohdassa. Metalli-ioni voi esimerkiksi toimia siltana entsyymin ja substraatin välillä (esim. Ca2+ fos-folipaasissa sitoo substraatin fosfaattiryhmän) tai se voi aktivoida veden muuttumaan voimakkaaksi nukleofiiliseksi hydroksyyli-ioniksi (Zn2+-OH").

5 102542

Esimerkkejä ovat Zn2+-proteaasit/ kuten termolysiini ja karboksipeptidaasi, hiilihappoanhydraasi (Zn2+)/ fosfoli-paasi-A2 (Ca2+), stafylokokkinen nukleaasi (Ca2+) ja alka-liset fosfataasit (Mg2+, Ca2+). Esimerkkejä alfa/beta-sy-linterientsyymeistä (alfa/beta barrel enzymes), jotka vaativat kationit polarisoimaan karboksyyli- tai karbonyyli-ryhmää vedyn siirtämiseksi, ovat glukoosi/ksyloosi-isome-raasi (Mg2+), ribuloosi-l*5-bifosfaattikarboksylaasi/oksy-genaasi (RUBISCO) (Mg2+), enolaasi (Mg2+), hiiva-aldolaasi (Mg2+, K1+), mandolaattirasemaasi (Mg2+), mukonaattisyklo-isomeraasi (Mn2+). Metallikelatointiaineiden (kuten EDTA:n) läsnäollessa nämä entsyymit menettävät aktiivisen monipuolisuutensa.

Metalli-ionien sitoutuminen proteiinimolekyyliin käsittää tavallisesti 4 tai 6 ligandin koordinaation. Riippuen me-talli-ionityypistä havaitaan erilaiset ligandit. Esimerkiksi magnesium ja kalsium ligandoituvat tavallisesti happiatomeilla joko proteiinin pääketjun karbonyyliryhmästä, glutamiini- tai asparagiinisivuketjun karbonyyliryhmästä tai asparagiini- tai glutamiinihapposivuketjun karboksy-laatista. Sinkki- ja kupari-ionit ligandoituvat tavallisesti typpiatomeilla histidiinin sivuketjusta tai rikki-atomeilla kysteiinistä ja metioniinista.

»

Tekijät, jotka määräävät entsyymin pH-rllppuvuuden

Entsyymin aktiivisuus riippuu vesipitoisen väliaineen pH-arvosta. Tämän riippuvuuden aiheuttaa toisaalta entsyymin aktiivikohdan ionisoituvien ryhmien ja toisaalta substraa- \ tin tai tuotteen (jos sitä esiintyy) ionisoituvien ryhmien (de)protonointi. Ionisoituvat ryhmät proteiineissa käsittävät emäksisten aminohappojen, lysiinin, arginiinin ja histidiinin (positiivinen varaus protonoidussa muodossa) ja happamien aminohappojen, asparagiinihapon, glutamiini-hapon, kysteiinin ja tyrosiinin (kaikilla negatiivinen va- 6 102542 raus deprotonoinnin jälkeen) sivuketjut. Lisäksi N-pään aminoryhmällä ja C-pään karboksyyliryhmällä on positiivinen ja vastaavasti negatiivinen varaus. Eräiden aminohappojen pKa-arvot on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1. Proteiineissa esiintyvien aminohappojen ionisoituvat ryhmät [Cantor ja Schimmel, 1980, Biophysical Chemistry, W.H.Freeman, San Fransisco] PKa positiivinen varaus (emäs) N-pää 7,5-8,5 lysiini 10,5 arginiini 12,5 histidiini 6,5-7,0 negatiivinen varaus (happo) C-pää 3,0-4,0 asparagiinihappo 3,9 glutamiinihappo 4,3 kysteiini 8,3 ·'. tyrosiini 10,1

On otettava huomioon, että nämä pKa-arvot on valittu mal-liyhdisteille ja että esiintyy suuria variaatioita sekä eri proteiinin sisällä että niiden välillä johtuen ioni-I soituvan ryhmän spesifisestä ympäristöstä. Elektrostaat- tisten vaikutusten tiedetään näyttelevän perustavaa laatua olevaa osaa entsyymitoiminnassa ja -rakenteissa (katso J.A.Matthew et ai., CRC Critical Reviews in Biochemistry, 18 (1985) 91-197). Positiivisen varauksen esiintyminen lähellä ionisoituvaa ryhmää alentaa sen pKa-arvoa kun taas 7 102542 negatiivinen varaus aikaansaa lisäyksen pKa:ssa. Vaikutuksen suuruutta vähentää ionisoituvan ryhmän ja varauksen välinen etäisyys. Lisäksi tämän vähenemisen suuruus riippuu väliaineen dielektrisestä vakiosta. Erityisesti katalyyttiset tähteet voivat paljastaa pKa-arvoja, jotka poikkeavat näistä keskiarvoista (katso esimerkiksi Fersht, Enzyme structure and mechanism, 1985, W.H.Freeman, New York).

Entsyymin katalysoiman reaktion pH-riippuvuus voidaan jakaa Michaelis-vakiosta Km johtuvaan pH-riippuvuuteen ja reaktionopeusvakiosta kca^. johtuvaan pH-riippuvuuteen (ekvivalentti vmaks.:^e)· Nämä parametrit edustavat substraatin sitoutumista perustilassa ja vastaavasti siirtymätilassa. Tästä johtuen aminohapposivuketjujen, jotka vaikuttavat molempien substraattimuotojen sitoutumiseen, tai jotka ovat muulla tavoin osallisina katalyyttisessä tapahtumassa (esim. protonin kiinnittyminen ja vapautuminen yleisessä emäskatalyysissä), pH:sta riippuvainen (de)pro-tonointi määrittää entsyymin pH-aktiivisuusprofiilin.

Esimerkiksi histidiinin protonointi seriiniproteaasin katalyyttisessä triadissa (sekä trypsiini- että subtilisii-ni-perheellä) on syynä aktiivisuuden vähenemiseen alhai-semmilla pH-arvoilla (<7). Tässä tapauksessa entsyymiaktiivisuuden pKa on suorassa suhteessa tämän histidiinitäh-teen pKa:han.

Toisena esimerkkinä voidaan mainita kaksi asparagiinihap-potähdettä aspartyyliproteaaseissa, kuten pepsiini ja ky-mosiini. Nämä ryhmät määräävät näiden proteaasien pH-opti-min. Asparagiinihappojen tyypillinen rakenteellinen järjestys vaikuttaa siten, että niillä on erilaiset pKa-arvot, josta on seurauksena kellon muotoinen pH-aktiivi-suusprofiili.

8 102542

Tiedetään, että muuttamalla pintavarausta laajalla kemiallisella modifikaatiolla, voidaan aikaansaada merkittäviä muutoksia katalyytin pH-riippuvuudessa. Kuitenkin monissa tapauksissa tämän lähestymisen tuloksena on entsyymin in-aktivoituminen ja/tai ei-toivotut rakennemuutokset, koska nämä menetelmät ovat melko epäspesifisiä. Lysiinin selektiivisen kemiallisen modifikaation sytokromi c:ssä todettiin vaikuttavan redox-potentiaaliin (D.C.Rees, J.Mol.Biol. 173, 323-326 (1980)). Kuitenkin näitä tuloksia on arvosteltu, koska modifikaatioon käytetty, tilaa ottava kemiallinen reagenssi voisi aiheuttaa epäjärjestystä proteiinin rakenteessa.

Käyttämällä hyväksi proteiinin 3D-rakennetta, rakenteellisen epäjärjestäytymismahdollisuuden ennakoimiseksi ja paikkaan kohdistettua mutagenointia, on mahdollista modifioida varauksen jakautumista proteiinissa hyvin selektiivisellä tavalla.

Fersht ja kollegat ovat osoittaneet, että on mahdollista manipuloida subtilisiinin pH-aktiivisuusprofiilia paikkaan kohdistetulla mutagenoinnilla (Thomas et ai., Nature, 318, 375-376 (1985); Russel et ai., J.Mol.Biol., 193, 803-813 (1987); Russel ja Fersht, Nature 328, 496-500 (1987)). Ne-gatiivisesti varautuneiden ryhmien tuominen 10-15 Ä:n etäisyydelle proteiinipinnan aktiivikohdasta nostaa aktil-vikohdan histidiinin pKa-arvoa. Käänteisesti tekemällä pinta positiivisesti varautuneemmaksi, happamien ryhmien pKa-arvo alenee. Vaihtamalla joko Asp99 13 A:n etäisyydellä tai Glul56 15 Ä:n etäisyydellä aktiivikohdasta ly-siiniksi alenee aktiivikohdan histidiinin pKa 0,6 pH-yksi-köllä. Vaihtamalla molemmat tähteet samanaikaisesti saadaan kaksoismutantti, jossa on 4 varausyksikön muutos, pKa alenee 1,0 pH-yksiköllä. Ilmenee, että muutokset Coulombis-vuorovaikutuksissa voivat olla kumulatiiviset.

« 9 102542

Glukoosi-isomeraasimutantit WO 89/01520 (Cetus) luettelee joukon ksyloosi-isomeraasln mutantteja, jotka voidaan saada Streptomyces rubiqinosus1 -sta ja joilla voi olla lisääntynyt stabiliteetti. Mahdollisten mutatoitavien kohtien valinta perustuu kriteereihin, jotka eroavat tässä keksinnössä käytetyistä. Yli 300 mutanttia on lueteltu, mutta mitään tietoja ei ole esitetty mutanttientsyymimolekyylien tunnusmerkeistä ja muutoksista niissä.

Menetelmät entsyymien saamiseksi, joilla on parantuneet ominaisuudet

Entsyymejä, joilla on parantuneet ominaisuudet, voidaan kehittää tai löytää useilla keinoilla, esimerkiksi klassisilla testausmenetelmillä, olemassa olevien proteiinien kemiallisella modifikaatiolla tai käyttäen uudenaikaisia geeni- ja proteiinitietoteknisiä menetelmiä.

Paikkaan kohdistettu mutagenointi (site-directed mutagenesis = SDM) on kaikkein spesifisin keino modifioitujen entsyymien saamiseksi, sen mahdollistaessa yhden tai useamman aminohapon spesifisen korvautumisen toisella halutulla ’, aminohapolla.

Tämän keksintö koskee uusia mutanttiglukoosi-isomeraaseja, jotka saadaan ilmentämällä geenit, jotka koodittavat mainittuja entsyymejä, joilla aminohapposekvenssi eroaa ainakin yhdellä aminohapolla vastaavista villityyppisistä glu-1 koosi-isomeraaseista ja joilla on muuttuneet katalyyttiset ominaisuudet. Erityisesti kokonaisvarausjakauman muuttuminen aktiivikohdan ympärillä muuttaa pH-aktiivisuusprofii-lia.

Keksinnön toisena kohteena on menetelmä niiden kohtien valitsemiseksi villityyppisessä entsyymissä, jotka voidaan 10 102542 altistaa paikkaan kohdistetulle mutagenoinnille pH-aktii-vlsuusproflilin muuttamiseksi.

Edelleen keksinnön kohteena ovat glukoosi-isomeraasit, joilla on happamampi pH-optimi verrattuna villityyppiseen glukoosi-isomeraasiin.

Lyhyt kuvaus piirustuksista:

Kuvio 1 on kaavamainen esitys Actlnoplanes missourlen-sis'ista saadun glukoosi-isomeraasin aktiivikohdasta, johdettuna glukoosi-isomeraasi-ksylitolikompleksin kolmiulotteisesta rakenteesta. Inhibiittori on esitetty yksityiskohtaisesti kuvion keskellä. Aminohappotähteistä on piirretty ainoastaan ne atomit, jotka osallistuvat vetysi-dokseen. Aminohappotähteiden nimet ovat laatikoissa, jotka on ympäröity yhtenäisillä viivoilla, liuotinmolekyylit on esitetty katkoviivoilla piirretyissä laatikoissa. Metallin sitoutumiskohdat esitetään soikioissa, jotka on numeroitu 395 ja 396. Katkoviivat esittävät elektrostaattisia vuorovaikutuksia: ohuet katkoviivalinjat edustavat vetysidok-sia, paksut katkoviivat metallien oletettua ligaatioita. Ehdottomasti stabiilit tähteet on merkitty tähdellä. Ei-stabiileille tähteille on esitetty korvautumiset, joita luonnossa on todettu.

«.

Kuvio 2 esittää erilaisista lähteistä saatujen glukoosi-isomeraasien aminohapposekvenssien vertailun. On esitetty Actlnoplanes mlssouriensis-glukoosi-isomeraasin täydellinen sekvenssi. Ampullarlella-glukoosi-isomeraasin amino-! happosekvenssi eroaa julkaistuista sekvensseistä (Saari, J. Bacteriol., 169, (1987) 612) yhdellä tähteellä: prolii-ni 177 julkaistussa sekvenssissä on todettu arginiiniksi.

Streptomyces thermovulqaris-sekvenssi on julkaistu ainoastaan aminohappoon 346 asti. Määrittämättömät tähteet on 11 102542 jätetty kirjoittamatta. Piste osoittaa aminohappotähteen puuttumista siinä asemassa verrattuna mihin tahansa muuhun sekvenssiin. Eri lajit on esitetty seuraavilla symboleilla:

Ami.: Actlnoplanes missouriensls DSM 4643 Amp.: Ampullarlella sp. ATCC 31351 Svi.: Streptomyces vlolaceoruber LMG 7183 Smu.: Streptomyces murlnus

Sth.: Streptomyces thermovulgaris DSM 40444 Art.: Arthrobacter sp.

Bsu.: Bacillus subtills Eco.: Escherichia coll Lxy.: Lactobacillus xylosus

Sekundäärirakenteen määritys tehtiin Actlnoplanes missouriensls'-in rakenteessa. Sylinterissä esiintyvät he-liksit on osoitettu yhtenäisillä viivoilla. Varjostetut laatikot esittävät β-säikeitä.

Kuviossa 3 esitetään glukoosi-isomeraasin pH-aktiivisuus-profiili 200 mM:n ksyloosia ja 10 mM:n magnesiumia (neliöt) ja 1 mM:n mangaania (ympyrät) läsnäollessa.

Kuviossa 4 esitetään reaktiokaavio isomeroitumiselle, jota •4 glukoosi-isomeraasi katalysoi metalli-ionien läsnäollessa.

E = entsyymi, S * substraatti, M = metalli-ioni, P = tuote.

Kuviossa 5 esitetään reaktion pH-riippuvuus, kun glukoosi-isomeraasi reagoi ksyloosin ja Mg2+:n kanssa, havainto tehty steady-state-kokeilla. Kj_, K2, K3 ja K4 ovat tasa- » painovakioita, jotka selitetään tekstissä ja kuviossa 4 esitetyssä reaktiokaavassa.

Kuviossa 6 esitetään pH-aktiivisuusprofiili mutanteille K294R ja K294Q 200 mM:n ksyloosia ja 10 mM:n magnesiumia läsnäollessa. WT = villityyppi.

« 12 102542

Kuviossa 7 esitetään pH-aktiivisuusprofiilit E186Q:lle ja E186D:lle 200 mM:n ksyloosia ja 10 mM:n Mg2+:aa läsnäollessa.

Kuviossa 8 esitetään pH-aktiivisuusprofiilit E186D:lle ja E186Q:lle 200 mM:n ksyloosia ja 1 mM:n Mn2+:aa läsnäollessa.

Kuviossa 9 esitetään mutantin D255N pH-aktiivisuusprofiili 200 mM:n ksyloosia ja 1 mM:n mangaania läsnäollessa.

Kuviot 10-20 esittävät seuraavien mutanttien normalisoituja pH-aktiivisuusprofiileja: F254K (kuvio 10), F94R (kuvio 11), F61K (kuvio 12), A25K (kuvio 13), D57N (kuvio 14), L258K (kuvio 15), Q204K (kuvio 16), R23Q (kuvio 17), H54N (kuvio 18), H290N (kuvio 19, T95D (kuvio 20).

Olosuhteet on mainittu kuvioissa.

Kuviossa 21 esitetään mutantin F61KK253R normalisoitu pH-aktiivisuusprofiili. Olosuhteet on mainittu kuviossa.

Tämä keksintö kuvaa entsyymien modifioimista niiden teollisen käyttökelpoisuuden parantamiseksi. Keksinnössä käy-tetään hyväksi yhdistelmä-DNA-menetelmiä. Tällaiset menetelmät tarjoavat voimakkaan keinon haluttujen aminohappo-korvautumisien aikaansaamiseksi valitussa proteiinissa. Koska käytännöllisesti katsoen mahdollisten aminohappokor-vautumisten määrä on rajoittamaton, on edullista käyttää selektiivistä lähestymistapaa. Tämä lähestymistapa perus-I tuu proteiinikristallografian, molekyylimallituksen ja laskennallisten menetelmien, entsymologian ja kinetiikan, molekyylibiologian ja proteeinikemian menetelmien hyvin koordinoituun hyväksikäyttöön. Suunnitelmat kohteena olevien mutaatioiden identifioimiseksi ovat innovatiivisia siinä mielessä, että on tunnettua, että pistemutaatiot t 13 102542 harvoin aikaansaavat ainoastaan paikallista epäjärjestäy-tymistä. Mutaatiot vaikuttavat yleensä heti proteiinin useisiin erilaisiin ominaisuuksiin. Tästä johtuen vaikka esitetyt suunnitelmat käyttävät hyväkseen hyvin todistettuja rakennefunktioyhteyksiä, ne myös muodostavat rationaalisen keinon välttää tai korjata sekundääristen ominaisuuksien ei-toivottuja muutoksia.

Suunniteltujen mutanttien laaja biokemiallinen tutkimus johtaa parantuneet ominaisuudet omaavien mutanttien identifioimiseen.

"Parantuneilla ominaisuuksilla", jota tässä käytetään näiden glukoosi-isomeraasientsyymien yhteydessä, tarkoitetaan entsyymejä, joissa pH-aktiivisuusprofiilin hapan pää on siirtynyt happamampaan pH-optimiin verrattuna vastaaviin villityyppisiin entsyymeihin.

Todettiin, että villityyppisen glukoosi-isomeraasin pH-ak-tiivisuusprofiilissa ilmenee vähentyminen aktiivisuudessa sekä happamalla pH:11a alle 7,0 että alkalisella pH:11a yli 8,0 (esimerkki 1 - kuvio 3). Kuten edellä esitettiin, olisi edullista käyttää glukoosi-isomeraasia alhaisemalla pH-arvolla.

«

Yllättäen havaittiin, että aleneminen aktiivisuudessa pH-aktiivisuusprofiilin happamalla puolella aiheutuu yhden tai useamman aminohapposivuketjun, jotka ovat suoraan osallisina glukoosi-isomeraasin katalyyttisessä metalli-ioni-koordinaatiossa, protonoitumisesta. Tämä pääteltiin siitä tosiasiasta, että ilmeiset assosiaatiovakiot metal-lisitoutumiselle, määritettynä steady-state-kinetiikalla, osoittivat samanlaista pH-riippuvuutta (esimerkki 1 - kuvio 5). Tätä voidaan kuvata seuraavalla kaavalla: «

Kass 102542 14 kohta + Mg2+ —^ kohta :Mg2+ pKa U + kohta:H+ jossa "kohta" tarkoittaa geometrista sitoutumiskohtaa, joka muodostuu erilaista (ionisoituvista) ligandeista. Ent- Λ i syymi on aktiivinen ainoastaan silloin, kun kohta on Mg* -ionin miehittämä, joka puolestaan voi sitoutua ainoastaan protonoimattomaan metallisitoutumiskohtaan ("kohta") eikä protonoituun kohtaan ("kohta:H+). Metallisitoutumiskohdan pH:sta riippuvaa protonointia kuvaa pKa-arvo, kun taas metallin sitoutumista protonoimattomaan kohtaan karakterisoi assosiaatiovakio Kass. Ilmeinen assosiaatiovakio metalli-sitoutumiselle on todellisen Kass:n, pKa:n ja pH:n funktio ja voidaan esittää seuraavalla tavalla:

Kassilmeinen = Kass * (1 + lolPKa-P»))'1

Reaktionopeus on verannollinen entsyymimolekyylien, jotka on kompleksoitu Mg2+:lla, fraktioon. Tämä fraktio kasvaa kun [Mg2+]*Kass^^me^nen on korkeampi.

Vaikka esitetty malli kuvattiin glukoosi-isomeraasissa suoritetun havaitsemisen jälkeen, on ilmeistä, että tätä mallia ja siitä johdettua menetelmää voidaan käyttää yleensä metalloentsyymeille edellyttäen, että inaktivoitu-minen alhaisessa pH:ssa johtuu metalli-ionien dissosioitu-misesta.

Aktiivisuuden aleneminen, joka havaittiin alkalisessa pH:ssa, aiheutuu maksimaalisen nopeuden (vmaks.) vähenemisestä, heijastaen katalyyttiselle mekanismille olennaisen aminohappotähteen deprotonointia.

Edellä esitetystä mallista, jota voidaan käyttää selittämään aktiivisuuden alenemista pH-aktiivisuusprofiilin hap- 15 102542 pamalla puolella, voidaan päätellä, että glukoosi-isome-raasln aktiivisuuden lisäämiseksi alhaisemmilla pH-arvoil-la Kass:n täytyy kasvaa ja/tai pKa:n täytyy pienentyä.

Tästä johtuen keksinnön yhdessä suoritusmuodossa metallo-entsyymejä, kuten glukoosi-isomeraaseja, koodittavat DNA-sekvenssit mutatoidaan siten, että mutanttiproteiineissa ilmenee muutos pH-aktiivisuusprofiilissa, mikä on seurausta metallisidoksessa ligandeina toimivien aminohapposivu-ketjujen pKa-arvossa tapahtuneesta muutoksesta.

Metalloentsyymien pH-aktllvisuusprofiilin siirtäminen alhaisempaan pH-arvoon aminohapposivuketjujen pKa:ta muuttamalla

Metallia koordinoivien ligandien pKa-arvojen siirtämiseksi happamammalle pH-arvolle, on liitettävä tähteitä, jotka lisäävät yleistä positiivista varausta metalloentsyymien metallisitoutumiskohdan ympärillä. Sen seurauksena metalloentsyymien, joilla pH-optimin happaman puolen aktiivisuuden aikaansaa metallisitoutumisen pKa, aktiivisuuden pH-riippuvuus muuttuu vastaavasti. Tämä varauksen muutos stabiloi ionisoituvien ryhmien negatiivisen varauksen, jotka ryhmät ovat suurella joukolla elektrostaattisia vai-; kutuksia vastuussa metallisitoutumisen pH-riippuvuudesta.

Edullisen suoritusmuodon mukaan glukoosi-isomeraasin pH-aktiivisuusprofiilin siirtyminen happamampaan pH-arvoon saavutetaan lisäämällä yleistä positiivista varausta glukoosi-isomeraasin aktiivikohdan ympärillä.

Suunnilleen neutraalissa pH:ssa nettolisäys positiivisessa varauksessa voidaan aikaansaada: - korvaamalla negatiivisesti varautunut tähde (Asp tai Glu) neutraalilla tähteellä - korvaamalla neutraali tähde positiivisesti varautuneella tähteellä (Arg tai Lys) - korvaamalla negatiivisesti varautunut tähde positiivi sesti varautuneella.

16 102542 Tähteiden valitsemiseksi, jotka ovat sopivia mutatoitavik- si, voidaan muodostaa seuraavat kriteerit: I. Valitaan ne asemat, joissa korvautuminen johtaa nettolisäykseen positiivisessa varauksessa 15 A:n säteellä kohdetähteiden ympärillä. Kohdetähteet ovat ionisoituvia ryhmiä, jotka ovat osallisina kationin koordinaatiossa.

Tästä kokoelmasta poistetaan: - Kaikki asemat, jotka jo sisältävät positiivisen varauksen: arginiini tai lysiini.

- Kaikki asemat, jotka eivät voi ottaa vastaan arginii-nia tai lysiiniä, koska nämä tähteet johtaisivat ei-hyväksyttävään Van der Waals-peittymiseen proteiinin runkoatomien kanssa.

- Kaikki asemat, joissa arginiini tai lysiini tarvitsisivat välittömässä ympäristössä muiden asemien laajaa mukautumista Van der Waals-peittymisen välttämiseksi.

- Kaikki asemat, joissa korvaaminen arginiiniksi tai lysiiniksi johtaisi kätkettyyn, kompensoimattomaan ; varaukseen hydrofobisessa ryhmässä.

- Kaikki asemat, joissa tähteitä ei tulisi korvata, koska ne ovat osa tyypillistä rakenteellista järjestystä, kuten: suolasillat, kierteiden pakkaaminen, kierteiden stabiloiminen pitämällä negatiivinen varaus kierteen alussa, kierteiden aloitus, esim. pro-liinit kierteen alussa, Phi-psi-kulmat, jotka ovat sallitun alueen ulkopuolella tähteellä, joka on tarkoitus insertoida.

II. Edullisessa suoritusmuodossa seuraavat aminohapot poistetaan kokoelmasta: 17 102542 - Kaikki tähteet, jotka osallistuvat katalyysiin tai kefaktorisitoutumiseen (kuten metalli-ionit ja nukleotidit) .

- Kaikki asemat, jotka näyttävät olevan voimakkaasti konservoituneita homologisissa entsyymeissä (jos tällaisia on olemassa).

III. Sen jälkeen etusija voidaan katsoa jokaiselle mahdolliselle mutaatiokohdalle. Tämä tehdään tutkimalla tähteen rakenteellista ympäristöä, etäisyyttä "kohde"täh-teisiin, vetysidosmallia, johon tähde mainitussa kohdassa sisältyy, ja liuottimen luoksepääsevyyttä.

Sen välttämiseksi, että vastaionit eivät naamioi elektrostaattisia vuorovaikutuksia, varausten liittäminen kohtiin, joita ei voida suojata liuottimena kohdetähteiltä, ovat edullisia. Niinpä yleensä johtuen proteiinin ja liuottimen välillä vallitsevasta erosta dielektrisissä ominaisuuksissa, varaukset, joita ei voida solvatoida täysin siitä syystä, että ne kätkeytyvät proteiinin sisään tai osittain kätkeytyvät halkeamiin proteiinin pinnalla, aikaansaavat vaikutuksia todennäköisemmin kuin varaukset, jotka ovat täysin solvatoituneet. Lisäksi glukoosi-isomeraasin ollessa kyseessä glukoosin muuttuminen fruktoosiksi tapahtuu alhaisella ionivahvuudella ja siitä johtuen vastaio-nien suojauksen odotetaan häiritsevän vähemmän vakavasti uudestaan suunniteltua varaus-varaus-vuorovaiku-tusta uudessa glukoosi-isomeraasissa, joka on kuvattu keksinnön suoritusmuodossa.

•

Kriteerit vähäisen etusijan määrittämiseksi edellä valituille kohdille, kun ne korvataan positiivisen varauksen omaavalla tähteellä, ovat: - Positiivisen varauksen liittäminen ja/tai negatiivisen varauksen eliminoiminen vaikuttaa kvaternäärisen 18 102542 rakenteen eheyteen.

- Kohta on täysin liuottimen vastaanottava niin, että liitetyn varauksen odotetaan olevan kohdetähteiltä suojassa liuottimen ansiosta, mikä tästä johtuen vähentää vaikutusta kohdetähteiden pKa-arvoon.

Samalla tavalla yleisen negatiivisen varauksen lisääminen metallisidoskohdan ympärillä siirtää pKa:t emäksisempiin pH-arvoihin.

Metalloentsyymlen pH-aktilvisuusprofiilln siirtäminen al-haisempaan pH arvoon lisäämällä metallisidoksen Kass:ta Tämän keksinnön toisessa edullisessa suoritusmuodossa pH-aktiivisuusprofiilin siirtäminen alhaisempaan pH-arvoon tapahtuu lisäämällä assosiaatiovakiota Kass.

Metalloentsyymlen pH-aktiivisuusprofiilin siirtäminen happamammalle pH-alueelle voidaan tehdä lisäämällä metallisidoksen assosiaatiovakiota. Metallisidoksen assosiaatiovakiota voidaan lisätä optimoimalla metallien koordinaatiota ligandeilla. Tämä voidaan toteuttaa liittämällä paremmat ligandit tai liittämällä useampia ligandeja. Elektrostaat-tiset vuorovaikutukset voivat myötävaikuttaa metallisidok-; sen assosiaatiovakioon paljon pidempien matkojen takaa.

Toisessa edullisessa suoritusmuodossa glukoosi-isomeraasin pH-aktiivisuusprofiilin hapan pää siirretään alhaisempaan pH-arvoon lisäämällä metallisidoksen assosiaatiovakiota.

Glukoosi-isomeraasi sitoo kaksi magnesiumionia alayksikköä kohti, josta tuloksena on kahdeksan kationin sitoutuminen tetrameeria kohti, jolloin kokonaisvaraus lisääntyy +16 (katso kuvio 1). Molemmat sitoutumiskohdat sijatsevat β-sylinterin C-päässä. "Ala"sitoutumiskohta sijaitsee melko syvällä sylinterissä ja ksylitolikompleksissa se sitoo 19 102542 suoraan kaksi happea Inhibiittorista. Toinen sitoutumiskohta ("ylä") sijaitseee melkein β-sylinterin päässä ja lähellä aktiivlkohdan rakoa ja alayksikön rajapintaa.

Yleensä kun positiivisesti varautunut ioni sitoutuu toiseen partikkeliin, assosiaatio- ja dissosiaationopeusvaki-ot sekä yleinen tasapainoaffiniteettivakio riippuvat toisen partikkelin varauksesta. Hylkimistä ilmenee silloin, kun partikkeli on myös positiivisesti varautunut ja vetovoimaa ilmenee vastakkaisten varausten välillä. Pienillä ioneilla ja tietyissä tapauksissa myös proteiineilla tämä vaikutus voidaan määrittää tutkimalla reaktionopeudesta riippuvaa ionivahvuutta. Vastakkaisesti varautuneiden ionien assosiaationopeus pienenee ionivahvuuden kasvaessa, samanlaisten varausten assosiaationopeus kasvaa ionivahvuuden kasvaessa ja kun yksi partikkeleista on varautuma-ton, ionivahvuudella ei ole vaikutusta.

Glukoosi-isomeraasin affiniteetti magnesiumille vähenee ionivahvuuden kasvaessa, joka perustuu glukoosi-isomeraasin sitoutumikohdan negatiiviseen kokonaisvaraukseen. Kationin sitoutumista voidaan muuttaa, liittämällä varattuja aminohappoja proteiinin pintaan pitkin kationin rataa ak-tiivikohdan sisäänviennin yläpuolelle. Tarkemmin sanottuna I tämä keksintö koskee elektrostaattisten voimien käyttöä kationin assosiaationopeusvakion muuttamiseksi. Glukoosi-isomeraasi voidaan saada lisäämään kationin assosiaationo-peutta lisäämällä negatiivista varausta (tai poistamalla positiivista varausta) aktiivikohtakanavan lähellä tai vähentämään kationin assosiaationopeutta lisäämällä posi-tiivistä varausta (tai vähentämällä negatiivista varausta) aktiivikohtakanavan lähellä. Koska vähentämisen (off-rate) ei odoteta vaikuttavan olennaisesti, muutettu lisäys (on-rate) johtaa kationin muuttuneeseen kokonaisassosiaa-tiovakioon. Koska silmukka-alueet, jotka sijatsevat β-sylinterin C-päissä, muodostavat aktiivikohdan sisäänkäyn- 20 102542 nin, mahdolliset mutaatiokohdat etsitään näiltä alueilta. Mahdollisten häiriöiden välttämiseksi sylinterin stabiliteetissa, korvautumiset β-säikeissä tai α-kierteissä eivät tule kysymykseen. Voidaan käyttää seuraavaa kaaviota: - Valitaan kaikki tähteet, jotka ovat β-säikeiden C-päiden ja α-kierteiden N-päiden välillä.

- Harkittaessa edelleen hylätään kaikki tähteet, joissa korvautuminen johtaa positiivisen nettovarauksen vähenemiseen 15 A:n säteellä metalliligandeista. Negatiivisten varausten tuominen liian lähelle metallisitoutumiskohtaa siirtää metalliligandien pKa:ta korkeammalle pH:lie, mikä mitätöi lisääntyneen Kass:n vaikutuksen alhaisella pH:11a.

- Lasketaan jokaiselle jäljelle jäävälle tähteelle sen lähestyttävissä oleva pinta-ala proteiinin yhteydessä ja käytetään 1,4 A:n koetinta. Hylätään tähteet, jotka ovat piilossa siinä suhteessa, että niiden lähestyttävissä oleva pinta-ala on alle 10 A2.

Rakennetiedot

Entsyymin (tai entsyymi:substraatin tai entsyymi:inhibiittori-kompleksin) 3D-rakenteen tiedoilla on suuri merkitys, jotta pystytään tekemään ennusteita mutaatioista, joita : voidaan suorittaa.

Rakennetiedot on esitetty glukoosi-isomeraasille, joka saadaan Streptomyces rubiginosus'sta (Carrel et ai., J. Biol.Chem. 259 (1984) 3230-3236); Carrel et ai., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 86, (1989) 4440-4444), Streptomyces *·' olivochromoqenus1 sta (Farber et ai., Protein Eng. 1, (1987) 467-475); Farber et ai., Biochemistry 28 (1987) 7289-7297), Arthrobacter1sta (Hendrick et ai., J.Mol.Biol. 208 (1989) 127-157) ja Streptomyces albus1sta (Dauter et ai., FEBS Lett. 247, 1-8).

21 102542

Vaikka kalkkia aminohapposekvenssitietoja el ole saatavissa näille entsyymeille, 3D-rakenteellinen homologia Acti-noplanes mlssourlensls-qlukoosl-lsomeraasln kanssa on huomattava (katso F.Rey et ai., Proteins 4 (1988) 165-172). Tässä selityksessä esitetyn menetelmän yleisen käyttökelpoisuuden osoittamiseksi glukoosi-isomeraasin geenit, jotka ovat peräisin eri lajeista, on kloonattu ja sekventoi-tu. Glukoosi-isomeraasien aminohapposekvenssien, jotka ovat peräisin mikro-organismien Streptomyces violaceoruber, Streptomyces murlnus, Arthrobacter sp. ja Streptomy-ces thermovulqarls geeneistä, on osoitettu olevan homologiset. Ampullarlella sp.:n (Saari, ibid.) ja Streptomyces violaceoniqer1 in (Nucl.Acids Res. 16 (1988) 9337) glukoo-si-isomeraasien julkaistut aminohapposekvenssit, jotka on-johdettu vastaavien geenien nukleotidisekvensseistä, osoittavat läheistä homologiaa Actinoplanes missouriensls-glukoosi-isomeraasin kanssa. Lisäksi julkaisussa WO 89/ 01520 esitetään, että Streptomyces rubiqinosus-isomeraasin aminohapposekvenssi on homologinen Ampullarlella sp.:n glukoosi-isomeraasin kanssa.

Huolimatta siitä, että 3D-rakennetiedot puuttuvat useimmilta glukoosi-isomeraaseilta, voidaan päätellä, että kaikilla Actinomycetales-qlukoosi-isomeraaseilla on samanlai-: nen tetrameerinen järjestelmä.

Yleensä voidaan olettaa, että kun kokonaishomologia on yli 65 %, mieluimmin yli 74 % (minimaalinen homologia Actinoplanes missourlensls- ja Streptomyces-glukoosi-lsomeraasln välillä Amoren ja Hollenbergin mukaan, Nucl.Acids.Res. 17, 7515 (1989)) ja vielä mieluummin yli 85 % ja kun 3D-raken-ne on samanlainen, aminohappojen korvaaminen johtaa samanlaisiin muutoksiin pH-optimissa. Erityisesti odotetaan, että glukoosi-isomeraasit, jotka saadaan Actinomycetales-lahkoon kuuluvista lajeista, omaavat niin suuriasteisen samankaltaisuuden, että valituissa kohdissa suoritetuista 22 102542 aminohappokorvautumisista johtuva pH-optimin muutos on samanlainen. Actinoplanes missouriensis on edullinen glukoo-si-isomeraasin lähde (mitätöitäväksi.

Kuviossa 1 on esitetty kaavamaisesti Actinoplanes mlssou-riensis-glukoosi-isomeraasin aktiivikohta.

Kuvio 2 esittää erilaisten glukoosi-isomeraasien ryhmitellyt aminohapposekvenssit.

Tässä selityksessä käytetään aminohapoille sekä kolme kirjainta käsittävää että yksikirjaimista koodia (katso esim. Stryer, L.Biochemistry, s. 13, 2. pain., w.H.Freeman and Comp., NY, 1981).

D-qlukoosi-isomeraasigeenln kloonaus ja ilmentäminen

D-glukoosi-isomeraasia (GI) käytetään synonyymisesti D-ksyloosi-isomeraasi(D-ksyloosi)-ketoli-isomeraasista (EC

5.3.1.5), entsyymistä, j oka muuttaa D-ksyloosin D-ksylu-loosiksi. D-glukoosi-isomeraasia, joka on peräisin Actinoplanes missouriensis1ista ja joka on valmistettu käyttäen E.coli-kantoja, merkitään EcoAmi (DSM) GI. Actinoplanes mlssouriensls-geenln, joka koodittaa GI:tä, erottamiseksi analogisesta E.coli xylA-geenistä, ensiksi mainittu merkitään GI.

Menetelmät DNA-molekyylien manipuloimiseksi on kuvattu julkaisuissa Maniatis et ai. (1982, Cold Spring Harbor Laboratory) ja Ausubel et ai. (1987, Current Protocols in * Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. New York). Kloo naus ja Actinoplanes missouriensis DSM 43046:sta saadun glukoosi-isomeraasigeenin DNA-sekvenssimääritys on kuvattu julkaisussa EP-A-0351029. GI:n saatu aminohapposekvenssi on numeroitu ja sitä on verrattu muihin glukoosi-isomeraa-seihin kuviossa 2. Seuraavassa aminohappojen numerointi vastaa kuviota 2.

23 102542

Villityyppiset ja imitantti-GI-entsyymit tuotettiin E.coli-kannassa K514, kuten kuvataan julkaisussa EP-A-0351029.

Ilmentymistuotteen entsymaattlsen aktiivisuuden testaaminen

Glukoosi-isomeraasin entsymaattinen aktiivisuus testattiin seuraavassa esitetyllä tavalla (entsymaattlsen aktiivisuuden 1 yksikkö tuottaa 1,0 mikromoolia tuotetta, joka on D-ksyluloosi tai D-fruktoosi, per minuutti; tästä johtuen spesifinen aktiivisuus (spa) on ilmoitettu yksikköinä per GI-entsyymien mg.

Gl-aktiivisuus testattiin suoraan mittaamalla absorbanssin lisäys aallonpituudella 278 nm ksyluloosilla, joka muodostui kun ksyloosi isomeroitiin glukoosi-isomeraaseilla 35 °C:ssa. Tämä koe suoritettiin 50 mM:ssa trietanoliamiini-puskuria, jonka pH oli 7,5 ja joka sisälsi 10 mM MgS04:ää, 0,1 M:n ksyloosia läsnäollessa. Glukoosi-isomeraasin lopullinen konsentraatio kokeessa oli ±0,01 mg/ml, tämä kon-sentraatio määritettiin tarkasti, ennen kuin laimennettiin entsymaattiseen koeseokseen, absorptiospektroskopisesti käyttäen ekstinktiokerrointa 1,08 aallonpituudella 278 nm 1,0 mg/ml:n entsyymiliuokselle.

•

Spesifinen aktiivisuus määritettiin D-sorbitoli-dehydraa-si-kytkentä-kokeessa, jossa D-ksyluloosin entsymaattinen määritys suoritettiin 35 eC:ssa, kuten aikaisemmin on kuvattu (Kersters-Hilderson et ai., Enzyme Microb.Technol. £ (1987) 145) 50 mM:ssa trietanoliamiinia, jonka pH oli 7,5 ja jossa oli 10 mM MgS04:ää ja 0,1 M ksyloosia, ±2 x 10-8 M:n D-sorbitoli-dehydraasia (L-iditoli: NAD-oksidoreduk-taasi, EC 1.1.14) ja 0,15 nM:n NADH:ta läsnäollessa paitsi, että myös inkubointipuskuri sisälsi l mM:n etyleeni-bis(oksoetyleeninitrilo)tetraetikkahappoa (EGTA). Glukoosi-isomeraasin lopullinen konsentraatio tässä kokeessa oli 24 102542 ±2,5 x 10"3 mg/ml, tämä konsentraatio määritettiin tarkasti edellä esitetyllä tavalla.

Glukoosin ollessa substraatti GI-aktiivisuus voidaan testata mittaamalla isomerointireaktion aikana tuotettu D-fruktoosi käyttäen kysteiini-karbatsoli-menetelmää (cys-teine-carbazole method CCM), joka perustuu ketosokerien reaktioon karbatsolin kanssa hapoissa, tuottaen purppuran-värisen tuotteen (Dische ja Borenfreund, J.Biol.Chem. 192 (1951) 583).

Esimerkki 1

Glukoosi-isomeraasiaktiivisuuden pH-riippuvuus villityyppisen ja mutanttiglukoosi-isomeraasin pH-aktiivi-suusprofiilin määrittämiseksi, aktiivisuus mitattiin pH:n (5,2 - 8,0) funktiona 10 mM:n MgS04:ää ja 200 mM:n ksyloo-sia läsnäollessa (käytettiin suoraa koemenetelmää). Mutan-teilla, joilla oli hyvin alhainen aktiivisuus, käytettiin kytkettyä sorbitoli-dehydraasikoemenetelmää pH-alueella 5,8 - 8,4. Huolehdittiin siitä, että sorbitoli-dehydraasi-reaktio ei muodostunut nopeutta rajoittavaksi pH:n ääriarvoilla.

*

Glukoosi-isomeraasin (t.s. villityyppisen yhdistelmäent-syymin, joka oli peräisin Actinoplanes missouriensis1sta,) pH-aktiivisuusprofiili 200 mM:n ksyloosia ja erilaisten aktivoivien kationien läsnäollessa on esitetty kuviossa 3. Siinä havaitaan aktiivisuuden väheneminen sekä happamalla pH:11a alle 7,0 että alkalisella pH:11a yli 8,0.

Sopiva steady-state-kineettinen mekanismi glukoosi-isome-raasille käsittää entsyymi-metalli-sokeri-kompleksin nopean muodostamisen, joka muutetaan tuotteeksi nopeutta rajoittavassa vaiheessa (niin sanottu pikatasapaino, satun- 25 102542 naisesti järjestynyt mekanismi - katso kuvio 4). Tasapaino- ja lyhytaikaiset kineettiset fluoresenssimittaukset (pysäytetty virtaus) osoittavat, että läsnä on kaksi metallin sitoutumiskohtaa. Pysäytetyn virtauksen kokeessa metalli-ionit sitovat peräkkäin. Erittäin affiniteettinen metalli näyttelee roolia aktiivisen konformaation ylläpitämisessä ja siitä syystä se on niin sanottu "konforma-tionaalinen" kohta. Toinen metallin sitoutumiskohta ottaa vastaan aktivoivan kationin, mistä syystä tämä kohta tavallisesti esitetään "katalyyttisenä" kohtana. Reaktiokaa-vio, joka on esitetty kuviossa 4, näyttää olevan riittävä steady-state-kokeiden ja pysäytetyn virtauksen kokeiden analysoimiseksi ja vertailemiseksi. Periaatteessa steady-state-tulokset eivät eroa näiden kahden metallisitoutumis-kohdan välillä mutta oletetaan, että päävaikutukset tulevat katalyyttisestä metallisitoutumisesta.

Ksyloosimuuttumisen alkunopeuden (v) analyysi ksyloosi- ja magnesiumkonsentraatioiden funktiona tekee mahdolliseksi neljän parametrin määrittämisen: maksimaalinen nopeus, ta-sapainovakiot magnesiumin sitoutumiselle vapaaseen entsyymiin (Kj^), entsyymi-sokeri-kompleksiin (K4) ja tasapaino-vakiot ksyloosin sitoutumiselle vapaaseen entsyymiin (K2) ja entsyymi-magnesium-kompleksiin (K3).

vmaks. 1 1 1 - = 1 + - + - + - V K3*[S] K4*[M] K3*K1*[S]*[M] jossa [M] ja [S] tarkoittavat metalli-ionin ja vastaavasti ksyloosin konsentraatiota.

Magnesiumioni- ja ksyloosikonsentraatioiden systemaattisella muutoksella oli mahdollista saada arvot maksimaaliselle nopeudelle ja kaikille neljälle tasapainovakiolle. Kuviossa 5 on esitetty näiden parametrien pH-riippuvuus.

26 1 0 2 5 4 2

Verrattaessa kuvioiden 3 ja 5 tuloksia, havaitaan, että metalli-ionisitoutuminen määrittelee täysin pH-profiilin happaman puolen.

Kuvion 5 tulokset eivät ole riittävän tarkkoja sisältyvien ionisaatioiden lukumäärän laskemiseksi. Käyrien logKj^ 4 vastaan pH kulmakerroin (kerroin >1) osoittaa kuitenkin, että voi esiintyä useampia·kuin yksi ionisoituminen. Samankaltaisuus κχ:η ja K4:n pH-riippuvuudessa osoittaa, että samat ionisoivat ryhmät ovat tärkeät molemmille näille reaktioille (käsittäen saman kohdan).

Esimerkki 2

Glukoosi-isomeraasin sellaisten aminohappotähteiden valitseminen, joiden korvaaminen muuttaa metalliin sitoutuvien, ionisoituvien aminohappojen pKa-arvoja

Glukoosi-isomeraasin ollessa kyseessä, kriteereitä mahdollisten korvautumiseen soveltuvien asemien valitsemiseksi, kuten esitetään tämän keksinnön yksityiskohtaisessa kuvauksessa, sovellettiin käyttäen eri lähteistä saatujen sekvenssien vertailua (kuvio 2) ja Actlnoplanes mlssourl-ensis-glukoosl-isomeraasin hyvin selvitettyä rakennetta kompleksissa, jonka se muodostaa ksylitoli-inhibiittorin kanssa (katso kuvio 1 ja "Rakennetiedot" edellä). Hyvin selvitetty rakenne, jossa on 2,2 Ä:n resoluutio, paljastaa inhibiittorin ja kahden metallisitoutumisen aseman. Acti-noplanes missouriensls-qlukoosl-lsomeraasin aktiivikohta on esitetty kaavamaisesti kuviossa 1.

Glukoosi-isomeraasirakenteesta, joka muodostui komplekseista koboltin ja ksylitolin kanssa, valittiin ne tähteet, joissa korvaus positiivisemmin varautuneella aminohappotähteellä johtaa positiivisen varauksen nettolisäykseen 15 Ä:n säteellä kohteena olevista ionisoituvista ryh- 27 102542 mistä. Glukoosi-isomeraasin ollessa kyseessä kohteina ovat ionisoituvat ryhmät, jotka osallistuvat aktiivisuuteen tarvittavien metalli-ionien koordinaatioon. Nämä ionisoituvat kohderyhmät käsittävät Glul81:n, Glu217:n, Asp245:n, Asp255:n, Asp292:n karboksyyliryhmät ja His220:n NE:n.

Kriteerin I soveltamisen jälkeen jäljelle jäi 80 mahdollista mutaatiokohtaa. Nämä kohdat on lueteltu seuraavassa:

Ala5, Phell, Leul5, Trp20, Gln21, Ala25, Phe26, Asp28, Ala29, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe53, His54, Asp56, Phe61, Ile85, Met88, Phe94, Thr95, Phel04, Glnl22, Thrl33,

Leul34, Vall35, Alal43, Tyrl45, Tyrl58, Asnl63, Serl69,

Glul81, Asnl85, Glyl89, Ilel91, Prol94, Hisl98, Gln204,

Leu211, Phe212, Asn215, Glu217, Thr218, His220, Gln222,

Ser224, Asn225, Leu226, Phe228, Thr229, Gly231, Leu236,

His238, His243, Asp245, Asn247, His250, Phe254, Asp255,

Gln256, Asp257, Leu258, Val259, Phe260, His262, Leu271,

Tyr285, Asp286, His290, Asp292, Tyr293, Thr298, Glu299,

Trp305, Ala310, Met314, Val380, Asn383.

Sen jälkeen, kun katalyyttiset tähteet ja voimakkaasti konservoituneet tähteet (kriteeri II) on hylätty, seuraa-vat 62 tähdettä jäävät jäljelle:

Ala5, Leul5, Gln21, Ala25, Phe26, Asp28, Ala29, Gly47, Tyr49, Thr52, Asp56, Phe61, Ile85, Met88, Thr95, Phel04, Gini22, Thrl33, Leul34, Alal43, Tyrl45, Tyrl58, Asnl63,

Serl69, Asnl85, Glyl89, Ilel91, Prol94, Hisl98, Gln204,

Leu211, Phe212, Thr218, Gln222, Ser224, Asn225, Leu226, ’· Phe228, Thr229, Gly231, Leu236, His238, His243, His250,

Phe254, Gln256, Asp257, Leu258, Val259, His262, Leu271,

Tyr285, Asp286, His290, Tyr293, Thr298, Glu299, Trp305,

Ala310, Met314, Val380, Asn383.

Sen jälkeen jokaiselle näistä 62 mahdollisesta mutaatio-kohdasta arvioitiin prioriteetti kriteerin III mukaisesti.

28 1 0 2 5 4 2

Seuraavien 24 kohdan arvioitiin olevan edullisia mutage-noitaviksi: Ala25, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe61, Ile85, Thr95, Gini22, Thrl33, Tyrl45, Tyrl58, Glyl89, Ilel91, Gln204, Thr218, Gln222, Leu226, Thr229, Gly231, Leu236, Gln256, Leu258, Tyr293 ja Val380.

Joko yhden tai useamman 80 valitun aminohappotähteen mutaatio positiivisesti varautuneiksi tähteiksi johtaa glu-koosi-isomeraasin metallisitoutumisen pKa:n pienenemiseen. Tämä voi johtaa pH-aktiivisuusprofiilin vastaavaan siirtymiseen alhaisemmalle pH:lie.

Vastaavasti joko yhden tai usean 80 valitun aminohappotähteen mutaatio negatiivisesti varautuneiksi tähteiksi johtaa glukoosi-isomeraasin metallisitoutumisen pKa:n kasvamiseen. Tämä voi johtaa pH-aktiivisuusprofiilin vastaavaan siirtymiseen korkeammalle pH:lie.

Esimerkki 3

Lys294-mutatoinnin vaikutus pH-aktlivisuusprofliliin

Glukoosi-isomeraasissa asemassa 292 positiivinen varaus sijaitsee noin 8 Ä:n etäisyydellä korkeimmasta täytetystä : ' metallisitoutumiskohdasta glukoosi-isomeraasi-ksylitoli- kompleksissa (395 kuviossa 1). Tässä kohdassa tehtiin mutaatio korvaamalla lysiini arginiinilla. Tämä mutaatio säilyttää positiivisen varauksen asemassa 294. Tämän positiivisen varauksen säilyminen havaitaan siitä, että tämän mutantin pH-aktiivisuusprofiili on samanlainen kuin villi-tyyppisen entsyymin.

Kuitenkin kun asemasta 294 positiivinen varaus poistetaan korvaamalla lysiini 294 glutamiinilla, havaittiin pH-ak-tiivisuusprofiilin siirtyminen kohti alkalista puolta noin 0,5 pH-yksiköllä. pH-aktiivisuusprofiilit K294R:lle ja K294Q:lle on esitetty kuviossa 6.

29 102542 Tämä esimerkki kuvaa sitä, että on mahdollista manipuloida glukoosi-isomeraasin aktiivikohdassa yhden tai useamman funktionaalisen ryhmän pK&:ta, muuttamalla proteiinin net-tovarausta aktiivikohdan ympärillä.

Esimerkki 4

Glul86:n mutatoinnin 1a maqneslumlonlen korvaamisen mangaani-ioneilla vaikutus pH-aktiivisuusprofiillin

Mutantissa E186Q negatiivinen varaus korvataan neutraalilla, mikä aikaansaa nettolisäyksen positiivisessa varauksessa 15 A:n säteellä metalliligandien ympärillä. E186Q-mutantin pH-aktiivisuusprofiili magnesiumionien läsnäollessa on esitetty kuviossa 7. pH-profiilin alkalinen pää on siirtynyt huomattavasti alhaisemmalle pH:lie. Kun magnesiumin sijasta käytetään mangaania E186Q:n pH-profiili siirtyy alhaisemmalle pHrlle ja sen optimi-pH ja sen aktiivisuus on korkeampi kuin villityyppisellä (kuvio 8).

Käyttötarkoituksiin, joissa voidaan käyttää muita metalli-ioneja kuin magnesiumia, yhdistelmä E186Q yhdessä mangaanin kanssa alhaisella pH:11a on mielenkiintoinen valinta.

: Suoritimme myös mutaation E186D, joka on säilyttävä va rauksen suhteen. Tämän mutantin pH-aktiivisuusprofiili on esitetty kuvioissa 7 ja 8. Aktiivisuuden pH-riippuvuus E186D-mutantilla ei ole merkittävästi erilainen villityyp-piseen entsyymiin verrattaessa. Negatiivisen varauksen poistaminen asemasta 186 ei siirtänyt pH-aktiivisuuspro-fiilia happamampaan pH-arvoon. Tämä esimerkki korostaa sitä, että mutaation E186Q perussyy säilyy.

Esimerkki 5 30 102542

Asp255;n korvaamisen vaikutus pH-aktiivisuusprofliliin

Negatiivisesti varautuneen asparagiinihapon korvaaminen asemassa 255, joka itse asiassa on glukoosi-isomeraasissa metalliligandi, neutraalilla asparagiinilla aikaansaa pH-aktiivisuusprofiilin siirtymisen alhaisemmalle pH:lie mangaanin läsnäollessa. pH-optimi siirtyy noin 2 pH-yksikköä happamamman pH:n suuntaan.

pH-aktiivisuusprofiili on esitetty kuviossa 9.

Esimerkki 6

Glukoosi-isomeraasit, joilla on muuttunut pH-aktiivisuus-profiill

Glukoosi-isomeraasin mutantit, jotka luotiin keksinnön yksityiskohtaisessa kuvauksessa esitettyjen menetelmien mukaisesti, testattiin niiden pH-aktiivisuuden suhteen olosuhteissa, jotka on esitetty kuvioissa (10-20).

Mutantin pH-aktiivisuusprofiilin muodostaa toisaalta mu-: taation vaikutus pKa-arvoon ja toisaalta vaikutus Kass- arvoon.

Seuraavien mutanttien tulokset on esitetty kuvioissa: F254 (kuvio 10), F94R (kuvio 11), F61K (kuvio 12), A25K (kuvio 13), D57N (kuvio 14), L258K (kuvio 15), Q204K (kuvio 16), R23Q (kuvio 17), H54N (kuvio 18), H290N (kuvio 19) T95D (kuvio 20).

Mutanteilla, joihin tuotiin positiivinen varaus (F254K, F94R, F61K, A25K, L258K, Q204K) tai negatiivinen varaus neutraloitiin (D57N), voidaan havaita, että pH-aktiivi- » 102542 suusprofiilin hapan puoli on siirtynyt alhaisemmalle pH:lie.

Mutanteilla, joihin tuotiin negatiivinen varaus (T95D) tai positiivinen varaus neutraloitiin (R23Q, H54N, H290N) voidaan nähdä, että pH-aktiivisuusprofiili on siirtynyt korkeammalle pH:lie.

Nämä molemmat havainnot ovat yhdenpitäviä keksinnön yksi-tyiskohtaisesa kuvauksessa esitetyn mallin kanssa.

Kuitenkin tulee huomata, että mutanteilla, joissa konser-voitunut aminohappo on korvattu (F94R, D57N, H54N), saadaan voimakas väheneminen spesifisessä aktiivisuudessa ksyloosilla. Asemassa 254 sekvenssivertailussa (kuvio 2) havaitaan ainoastaan hydrofobisia aminohappoja. Varatun aminohapon (F254K) tuominen tähän asemaan johtaa myös voimakkaaseen vähenemiseen spesifisessä aktiivisuudessa. Näin ollen voidaan päätellä, että vaikka (semi)konservoituneita aminohappoasemia voidaan käyttää muuttamaan varauksia pH-aktiivisuusprofiilin modifioimiseksi, ne eivät ole edullisia kohtia.

Esimerkki 7

Muuttuneen pH-optimln omaavlen mutanttien stabiloiminen paremman tehon aikaansaamiseksi käyttöolosuhteissa

Mutanteilla H290N ja F61K saadaan odotettu siirtyminen pH-aktiivisuusprofiilissa, kuten kuvataan esimerkissä 6.

\ Näistä mutanteista H290N immobilisoitiin julkaisussa EP-A- 351029 (esimerkki 7) esitetyllä tavalla. Villityyppisen ja tämän mutanttiglukoosi-isomeraasin käyttötestaus suoritettiin kuten esitetään samassa hakemuksessa (esimerkki 8). Stabiliteetti on osoitettu ensimmäisen kertaluvun hajoa-misvakiolla (K^, mitä alhaisempi hajoamisvakio on sitä py- 32 1 0 2 5 4 2 syvämpi entsyymi). Taulukossa 2 esitetään Kd-arvot villi-"tyyppiselle ja mutanttiglukoosi-isomeraaseille.

Taulukko 2

Hajoamisvakio villityyppiselle ja mutanttiglukoosi-iso-meraasille, jotka on immobilisoitu Lewatit1ille.

Kd (x 106 s-1) villityyppinen 2,5 H290N 3,1 K253R 0,7 H290NK253R 1,6 F61KK253R 1,4

Kuten taulukko 2 osoittaa, H290N on destabiloitunut villi-tyyppiseen glukoosi-isomeraasiin verrattuna. K253R:n todettiin stabiloituneen villityyppiseen glukoosi-isomeraasiin nähden yli kolmenkertaisesti. K253R-mutantin pH-aktiivi-suusprofiili on identtinen villityyppisen entsyymin kanssa.

pH-mutantin H290N yhdistelmä stabiilin mutantin K253R:n . " kanssa osoittaa, että pH-mutantit voidaan stabiloida suo rittamalla mutaatioita, joiden on osoitettu stabiloivan villityyppistä entsyymiä.

Lisäksi taulukko 2 osoittaa, että pH-mutantti F61K on stabiloitunut villityyppiseen entsyymiin verrattuna, sen jäl-*. keen kun siihen on liitetty K253R.

F61K:n pH-aktiivisuusprofiilin hapan siirtyminen on säilynyt kaksoismutantissa (kuvio 21). Tämä osoittaa, että mutaatioita, jotka parantavat entsyymien eri ominaisuuksia, voidaan yhdistää uudessa mutantissa, joka omaksuu yksit- 33 102E42 täisten mutaatioiden parantuneet ominaisuudet (parantunut pH-optimi ja parantunut stabiliteetti tässä tapauksessa).

On ymmärrettävä, että edellä mainitut esimerkit on tarkoitettu kuvaamaan keksinnön mukaista käsitettä eikä niiden tarkoituksena ole rajoittaa keksinnön piiriä. Tämän valossa on selvää, että edellä mainittujen mutaatioiden yhdistelmät yhdistettynä muihin mutaatioihin, jotka johtavat muuttuneisiin ominaisuuksiin, esim. termostabiliteet-tiin, metallisitoutumiseen tai substraattispesifisyyteen, kuuluvat tämän keksinnön piiriin.

t

Claims (15)

102542

1. Mutanttiglukoosi-isomeraasi, joka saadaan ilmentämällä geeni, joka koodittaa mainittua glukoosi-isomeraasia, joka eroaa ainakin yhdellä aminohapolla villityyppisestä entsyymistä, jonka aminohappoasemat on numeroitu siten kuin kuvassa 2 on esitetty, tunnettu siitä, että sillä on muuttunut pH-aktiivisuusprofiili, siten, että siinä ainakin yksi seuraavista aminohapoista tai aminohappo vastaavassa asemassa homologisessa glukoosi-isome-raasissa on korvattu aminohapolla, jota ei löydy villi-tyyppisestä entsyymistä: Ala5, Phell, Leul5, Trp20, Gln21, Ala25, Phe26, Asp28, Ala29, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe53, His54, Asp56, Phe61 Ile85, Met88, Phe94, Thr95, Phel04, Glnl22, Thrl33, Leul34, Vall35, Alal43, Tyrl45, Tyrl58, Asnl63, Serl69, Glul81, Asnl85, Glyl89, Ilel91, Prol94, Hisl98, Gln204, Leu211, Phe212, Asn215, Glu217, Thr218, His220, Gln222, Ser224, Asn225, Leu226, Phe228, Thr229, Gly231, Leu236, His238, His243, Asp245, Asn247, His250, Phe254, Asp255, Gln256, Asp257, Leu258, Val259, Phe260, His262, Leu271, Tyr285, Asp286, His290, Asp292, Tyr293, Thr298, Glu299, Trp305, Ala310, Met314, Val380, Asn383.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen mutanttiglukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että muuttunut pH-aktiivi-suusprofiili tai ainakin sen hapan puoli on siirtynyt alhaisemmalle pH-arvolle.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen mutanttiglukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että korvattu amino-happotähde on korvattu positiivisemmin varautuneella tähteellä.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen mutanttiglukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että se saadaan Actinomy-cetales-lahkon mikro-organismista. 102542

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen mutanttiglukoosi-isome-raasi, tunnettu siitä, että se saadaan Actino-planes mlssouriensisista.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen mutanttiglukoosi-isome-raasi, tunnettu siitä, että siinä on aminohappo-korvautuminen 15 A:n säteellä kohdetähteistä.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen mutantti-glukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että siinä ainakin yksi seuraavista aminohapoista tai aminohappo vastaavassa asemassa homologisessa glukoosi-isomeraasissa on korvattu aminohapolla, jota ei löydy villityyppisestä entsyymistä: Ala5, Leul5, Gln21, Ala25, Phe26, Asp28, Ala29, Gly47, Tyr49, Thr52, Asp56, Phe61, Ile85, Met88, Thr95, Phel04, Glnl22, Thrl33, Leul34, Alal43, Tyrl45, Tyrl58, Asnl63, Serl69, Asnl85, Glyl89, Ilel91, Prol94, Hisl98, Gln204, Leu211, Phe212, Thr218, Gln222, Ser224, Asn225, Leu226, Phe228, Thr229, Gly231, Leu236, His238, His243, His250, Phe254, Gln256, Asp257, Leu258, Val259, His262, Leu271, Tyr285, Asp286, His290, Tyr293, Thr298, Glu299, Trp305, Ala310, Met314, Val380, Asn383.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen mutantti-glukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että siinä ainakin yksi seuraavista aminohapoista tai aminohappo vastaavassa asemassa homologisessa glukoosi-isomeraasissa on korvattu aminohapolla, jota ei löydy villityyppisestä entsyymistä: Ala25, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe61, Ile85, Thr95, Glnl22, Thrl33, Tyrl45, Tyrl58, Glyl89, Ilel91, Gln204, Thr218, Gln222, Leu226, Thr229, Gly231, Leu236, Gln256, Leu258, Tyr293 ja Val380.

9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen mutanttiglukoosi-isome-raasi, tunnettu siitä, että se sisältää ainakin 102542 yhden seuraavista aminohappokorvautumisista: R23Q, A25K, D57N, H54N, F61K, F94R, T95D, E186D, E186Q, Q204K, K253R, F254K, D255N, L258K, H290N, K294R, K294Q.

10. Menetelmä glukoosi-isomeraasin pH-aktiivisuusprofii-lln muuttamiseksi, tunnettu siitä, että ainakin yksi seuraavista aminohapoista korvataan aminohapolla, jolla on eri tavalla varautunut sivuketju: Ala5, Phell, Leul5, Trp20, Gln21, Ala25, Phe26, Asp28, Ala29, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe53, His54, Asp56, Phe61 Ile85, Met88, Phe94, Thr95, Phel04, Glnl22, Thrl33, Leul34, Vall35, Alal43, Tyrl45, Tyrl58, Asnl63, Serl69, Glul81, Asnl85, Glyl89, Ilel91, Prol94, Hisl98, Gln204, Leu211, Phe212, Asn215, Glu217, Thr218, His220, Gln222, Ser224, Asn225, Leu226, Phe228, Thr229, Gly231, Leu236, His238, His243, Asp245, Asn247, His250, Phe254, Asp255, Gln256, Asp257, Leu258, Val259, Phe260, His262, Leu271, Tyr285, Asp286, His290, Asp292, Tyr293, Thr298, Glu299, Trp305, Ala310, Met314, Val380, Asn383.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aminohappo, joka on 15 A:n säteellä kohdetähteistä, korvataan positiivisemmin varautuneella aminohapolla.

12. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukaisen mutanttiglukoosi-isomeraasin saamiseksi, tunnettu siitä että se sisältää seuraavat vaiheet: a) valmistetaan DNA-sekvenssi, joka koodittaa glukoosi-isomeraasia, - b) mutatoidaan tämä sekvenssi valituissa nukleotidiase- missa, c) kloonataan mutatoitu sekvenssi ilmentymisvektoriin siten, että DNA-sekvenssi voidaan ilmentää, d) transformoidaan isäntäorganismi tai solu mainitulla vektorilla, 102542 e) viljellään mainittua isäntäorganlsmia, f) eristetään glukoosi-isomeraasi.

13. Minkä tahansa edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukaisen mutanttiglukoosi-isomeraasin käyttö sokerimolekyy-lien konvertoimiseksi.

14. Menetelmä muuttuneen pH-aktiivisuusprofiilin omaavan mutanttiglukoosi-isomeraasin valmistamiseksi, joka saadaan geenistä, joka koodaa mainittua mutanttiglukoosi-isomeraasia, tunnettu siitä, että mutatoidaan mainittua glukoosi-isomeraasia koodaavan geenin DNA yhdessä tai useammassa nukleotidiasemassa, jotta saadaan aikaan yksi tai useampia aminohappotähteiden substituutioita

15 A:n säteellä kohdeaminohappotähteestä, joka on osallisena metalli-ionin koordinaatiossa, jossa mainittu substituoitu aminohappo (a) ei omaa positiivista varausta, (b) ei ole sellaisessa asemassa, jossa arginiinin tai lysiinin substituutio joko johtaisi ei-hyväksyttävään Van der Waals vuorovaikutukseen proteiinin runkoatomien kanssa tai vaatisi lisätähteiden laajaa mukautumista välittömässä ympäristössä Van der Waals -peittymisen välttämiseksi , * (c) ei ole sellaisessa asemassa, jossa arginiinin tai lysiinin substituutio johtaisi kätkettyyn, kompensoimat-tomaan varaukseen, (d) ei ole osallisena suolasillassa, kierteessä tai phi-psi-kulmissa, jotka ovat hyväksytyn alueen ulkopuolella, (e) ei liity katalyysiin, '· (£) eikä ole sellaisessa asemassa, joka on homologisissa entsyymeissä tiukasti konservoitunut. 102542