ES2253733T3

ES2253733T3 - Nuevas glucosa isomerasas con un ph optimo alterado.

Info

Publication number: ES2253733T3
Application number: ES91200002T
Authority: ES
Inventors: Anne-Marie Virginie Renee Lambeir; Ignace Lasters; Nadir Mrabet; Wilhelmus Johannes Quax; Jan Metske Van Der Laan; Onno Misset
Original assignee: Bayer Bioscience NV; Genencor International Inc
Current assignee: Bayer CropScience NV; Danisco US Inc
Priority date: 1990-01-04
Filing date: 1991-01-02
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2011-01-02
Also published as: JPH06319543A; FI102542B1; EP0436502A2; HUT61328A; ATE310080T1; FI102542B; EP0436502A3; FI910024A; IE910011A1; AU6865291A; PT96416A; CA2033658A1; HU910016D0; BG93586A; DE69133491T2; EP0436502B1; CA2033658C; US5384257A; KR910014503A; BG60869B1

Abstract

UN METODO PARA LA SELECCION DE RESIDUOS DE AMINOACIDOS QUE A TRAVES DE SU SUBSTITUCION CREARA LA FORMACION DE UN ENZIMA CON UN PH ALTERADO OPTIMO. EL METODO ES ESPECIFICO PARA METALOENZIMAS QUE ESTAN INACTIVADAS A UN BAJO PH DEBIDO A SU DISOCIACION DE IONES DE METAL. SE BASA EL METODO EN ALTERAR EL PK SUB A COORDINANDO RESTOS O ALTERANDO LOS K DE LA ENVOLTURA DE METAL. DE ACUERDO CON ESTE METODO SE PUEDEN DESARROLLAR NUEVAS ISOMERASAS DE GLUCOSA CON UN PH ALTERADO OPTIMO. ESTAS ALTERADAS PROPIEDADES FACILITAN ALMIDON DEGRADADO PARA SER PROGRAMADO A VALORES DE PH MAS BAJOS.

Description

Nuevas glucosa isomerasas con un pH óptimo alterado.

Campo técnico

La presente invención se refiere a la aplicación de la tecnología de ingeniería de proteínas para la mejora de las propiedades de las metaloenzimas. Se proporciona método para seleccionar aminoácidos que después de ser alterados influyen en el perfil de actividad de pH de las metaloenzimas. Dicho método se aplica a la glucosa isomerasa. La presente invención también proporciona moléculas mutadas de glucosa isomerasa con un óptimo de pH alterado. Específicamente, la parte ácida del perfil de actividad de pH es desplazada hacia valores de pH menores.

Adicionalmente, la presente invención proporciona glucosa isomerasas recombinantes que pueden ser aplicadas de forma ventajosa en la producción de jarabes de fructosa, en particular de jarabes de maíz de elevada fructosa.

Antecedentes de la invención Aplicación industrial de la glucosa isomerasa

En la degradación industrial del almidón las enzimas desempeñan un importante papel. La enzima \alpha-amilasa se usa para la licuefacción de almidón en dextrinas con un grado de polimerización de aproximadamente 7-10. Posteriormente, la enzima \alpha-amiloglucosidasa se usa para la sacarificación, que da lugar a un jarabe que contiene un 92-96% de glucosa. La isomerización reversible de la glucosa para dar fructosa se ve catalizada por la enzima glucosa (o xilosa) isomerasa. La nomenclatura correcta para esta enzima es D-xilosa-ketol-isomerasa (EC 5.3.1.5) por la preferencia de la enzima por la xilosa. Sin embargo, debido a la mayor aplicación de la enzima en la conversión de glucosa en fructosa, es más comúnmente denominada glucosa isomerasa. La constante de equilibrio de esta isomerización es próxima a la unidad, de tal modo que en las condiciones óptimas del proceso se convierte aproximadamente el 50% de la glucosa. La mezcla de equilibrio de glucosa y fructosa es conocida como jarabe de fructosa superior.

La fructosa es mucho más dulce para el gusto humano que la glucosa o la sacarosa, lo que la convierte en un sustituto económicamente competitivo del azúcar.

Se han aplicado industrialmente muchos microorganismos que producen glucosa isomerasa. Wen-Pin Chen proporcionó una revisión detallada del uso industrial de las glucosa isomerasas en Process Biochemistry, 15 Junio/Julio (1980) 30-41 y Agosto/Septiembre (1980) 36-41.

La referencia de Wen-Pin describe las condiciones de cultivo para los microorganismos, así como los métodos de recuperación y de purificación de la enzima. Además, también resume propiedades de las glucosa isomerasas tales como la especificidad de sustrato, los óptimos de temperatura y los óptimos de pH, la estabilidad térmica y el requerimiento de iones metálicos.

La glucosa isomerasa requiere para su actividad catalítica un catión bivalente tal como Mg^{2+}, Co^{2+}, Mn^{2+} o una combinación de estos cationes. La determinación de las estructuras 3D de las diferentes glucosa isomerasas ha revelado la presencia de dos iones metálicos en la unidad monomérica (Farber y col., Protein Eng. 1 (1987) 459-466; Rey y col., Proteins 4 (1987) 165-172; Henrick y col., Protein Eng. 1 (1987) 467-475).

Además de su papel en el mecanismo catalítico, también se ha descubierto que los cationes bivalentes incrementan la termoestabilidad de algunas glucosa isomerasas (M. Callens y col. en Enzyme Microb. Technol. 1988 (10), 695-700). Además, la actividad catalítica de la glucosa isomerasa se ve inhibida gravemente por Ag^{+}, Hg^{2+}, Cu^{2+}, Zn^{2+} y Ca^{2+}.

Normalmente, las glucosa isomerasas presentan el óptimo de pH entre 7,0 y 9,0. Existen varias razones para justificar porqué sería beneficioso usar glucosa isomerasa con un valor de pH inferior. Tres de estas razones;

a) la estabilidad de las moléculas de azúcar,

b) la adaptación a etapas previas y/o posteriores del proceso y

c) la estabilidad de la enzima,

serán descritas con más detalle a continuación a modo de ilustración.

a): En condiciones alcalinas y a elevadas temperaturas, la formación de subproductos coloreados y la producción de un azúcar no metabolizable (D-Psicosa) son un problema. El pH de trabajo deseado debería estar entorno a 6,0. Con este pH la degradación de la glucosa y de la fructosa debería ser mínima.

b): También es deseable un óptimo de pH rebajado para la glucosa isomerasa si esta enzima se va a usar en combinación con otras enzimas, o entre otras etapas enzimáticas, por ejemplo en la fabricación de jarabes de fructosa superiores. En este proceso, una de las otras etapas enzimáticas, la sacarificación mediante \alpha-gluco-amilasa se lleva a cabo a pH 4,5.

c): La mayoría de las glucosa isomerasas conocidas se aplican a pH 7,5. Este valor de pH es un compromiso entre una mayor actividad inicial a un pH mayor y una mejor estabilidad de la enzima inmovilizada a un pH menor, dando como resultado una productividad óptima al pH elegido (R. v. Tilburg, Tesis: "Engineering aspects of Biocatalysts in Industrial Starch Conversion Technology", Delftse Universitaire Pers, 1983). La aplicación de la glucosa isomerasa a un pH inferior a 7,5 podría beneficiarse de una mayor vida media y, en combinación con una mejorada y mayor actividad específica, aumentaría en consecuencia la productividad de la enzima inmovilizada a ese menor pH.

De lo anterior se puede concluir que existe una necesidad de glucosa isomerasas con una mayor actividad a valores de pH menores en las condiciones del proceso.

Se analizaron muchos microorganismos en busca de una glucosa isomerasa con un óptimo de pH menor. A pesar de los esfuerzos, esta estrategia no condujo a nuevas glucosa isomerasas comerciales.

Con el fin de ser capaces de cambiar el perfil de actividad-pH de las glucosa isomerasas hacia pH inferiores mediante el empleo de ingeniería de proteínas, es importante conocer los efectos subyacentes que dan lugar a un rápido descenso de la actividad catalítica a pH ácido.

El papel de los iones metálicos en las enzimas

Se pueden prever dos funciones diferentes de los iones metálicos en las enzimas.

En primer lugar, los iones metálicos pueden desempeñar un papel estructural. Esto significa que están involucrados en el mantenimiento de la estructura 3D adecuada y, por tanto, contribuyen a la estabilidad (térmica) de la molécula enzimática. Un ejemplo de este tipo de función estructural y estabilizante es el Ca^{2+} en la familia subtilisina de las serina proteinasas.

En segundo lugar, los iones metálicos pueden actuar como un cofactor en el mecanismo catalítico. En este caso la actividad enzimática depende estrictamente de la presencia del ion metálico en el centro activo. El ion metálico puede, por ejemplo, hacer de puente entre la enzima y el sustrato (por ejemplo, el Ca^{2+} en la fosfolipasa se une al grupo fosfato del sustrato) o puede activar el agua para convertirse en un ion hidroxilo fuertemente nucleófilo (Zn^{2+}-OH^{-}).

Ejemplos de esto son las Zn^{2+}-proteasas, tales como la termolisina y la carboxipeptidasa, la anhidrasa carbónica (Zn^{2+}), la fosfolipasa-A_{2} (Ca^{2+}), la nucleasa estafilococal (Ca^{2+}) y las fosfatasas alcalinas (Mg^{2+}, Ca^{2+}). Entre los ejemplos de enzimas de barril alfa/beta que requieren cationes para polarizar un grupo carboxilo o uno carbonilo con el fin de transferir hidrógeno están la glucosa/xilosa isomerasa (Mg^{2+}), la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (RU-BISCO) (Mg^{2+}), la enolasa (Mg^{2+}), la aldolasa de levadura (Mg^{2+}, K^{1+}), la racemasa de mandolato (Mg^{2+}), la cicloisomerasa de muconato (Mn^{2+}). En presencia de agentes quelantes de metales (tales como el EDTA), estas enzimas pierden su actividad por completo.

La unión de iones metálicos a una molécula proteica normalmente incluye la coordinación de 4 ó 6 ligandos. Dependiendo del tipo de ion metálico se tienen diferentes ligandos. Por ejemplo, el magnesio y el calcio normalmente son ligados mediante átomos de oxígeno procedentes de un grupo carbonilo de la cadena principal de la proteína, de un grupo carbonilo de una cadena lateral de glutamina o de asparagina o del carboxilato de una cadena lateral de ácido aspártico o glutámico. Los iones de cinc y de cobre normalmente están ligados a través de átomos de nitrógeno procedentes de una cadena lateral de histidina, o de átomos de azufre de cisteína y metionina.

Factores que determinan la dependencia de pH de una enzima

La actividad de una enzima depende del valor de pH del medio acuoso. Esta dependencia se debe, por un lado, a la (des)protonación de grupos ionizables en el centro activo de la enzima, y, por otro lado, a grupos ionizables del sustrato o del producto (si lo hay). Los grupos ionizables de las proteínas incluyen las cadenas laterales de los aminoácidos básicos lisina, arginina e histidina (que portan una carga positiva en la forma protonada), y los aminoácidos ácidos ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína y tirosina (que portan todos una carga negativa tras la desprotonación). Además, el grupo amino de los extremos N y el grupo carboxilo de los extremos C portan respectivamente una carga positiva y una carga negativa. En la Tabla 1 se presentan los valores de pK_{a} de algunos aminoácidos.

TABLA 1 Grupos ionizables de aminoácidos presentes en proteínas [Cantor y Schimmel, 1980, Biophysical Chemistry, W.H. Freeman, San Francisco]

	pK_{a}
Carga positiva (base)
Extremo N	7,5-8,5
Lisina	10,5
Arginina	12,5
Histidina	6,0-7,0
Carga negativa (ácido)
Extremo C	3,0-4,0
Ácido aspártico	3,9
Ácido glutámico	4,3
Cisteína	8,3
Tirosina	10,1

Cabe destacar que estos valores de pK_{a} son válidos para los compuestos modelo y que se pueden producir grandes variaciones tanto a nivel de la misma proteína como entre diferentes proteínas, debido al entorno específico del grupo ionizable. Se sabe que los efectos electroestáticos desempeñan un papel fundamental en la función y en la estructura de las enzimas (véase J.A. Matthew y col., CRC Critical Reviews in Biochemistry, 18 (1985) 91-197). La presencia de una carga positiva cerca de un grupo ionizable disminuirá su pK_{a}, mientras que una carga negativa provocará un aumento del pK_{a}. La magnitud del efecto disminuye con la distancia entre el grupo ionizable y la carga. Además, la magnitud de esta disminución depende de la constante dieléctrica del medio. En especial, los residuos catalíticos pueden revelar valores de pK_{a} que se desvían de estos valores medios (véase por ejemplo Fersht, Enzyme structure and mechanism, 1985, W.H. Freeman, Nueva York).

La dependencia de pH de una reacción catalizada enzimáticamente puede dividirse en la dependencia con respecto al pH de la constante de Michaelis K_{m} y de la constante cinética de refresco k_{cat} (equivalente a V_{max}). Estos parámetros representan la unión del sustrato en su estado fundamental y en estado de transición, respectivamente. La (des)protonación dependiente del pH de las cadenas laterales de aminoácidos que afectan a la unión de ambas formas de sustrato, o que están involucradas en el evento catalítico (por ejemplo, la captación y la liberación de protones como en la catálisis básica general), por tanto, determina el perfil de actividad de pH de una enzima.

Por ejemplo, la protonación de la histidina en la tríada catalítica de las serina proteasas (tanto la familia de las tripsinas como de las sutilisinas) es la responsable de la pérdida de actividad a valores de pH inferiores (<7). En este caso, el pK_{a} de la actividad enzimática está directamente relacionado con el pK_{a} de este residuo de histidina.

Como segundo ejemplo pueden mencionarse los dos residuos de ácido aspártico de las aspartil proteasas, tales como la pepsina y la quimosina. Estos grupos determinan el óptimo de pH de estas proteasas. La disposición estructural típica de los ácidos aspárticos hace que presenten diferentes valores de pK_{a} que conducen al perfil pH-actividad con forma de campana.

Se sabe que la alteración de la carga superficial mediante una modificación química extensiva puede conducir a cambios significativos en la dependencia de la catálisis con respecto al pH. Sin embargo, en muchos casos esta estrategia conduce a la desactivación y/o a cambios estructurales de la enzima no deseados debido a que estos métodos son bastante poco específicos. Se ha demostrado que la modificación química selectiva de las lisinas en el citocromo c presenta un efecto sobre el potencial redox (D.C. Rees, J. Mol. Biol. 173, 323-326 (1980)). Sin embargo, estos resultados han sido criticados debido a que el reactivo voluminoso empleados para la modificación podría perturbar la estructura de la proteína.

Usando la estructura 3D de una proteína para anticipar la posibilidad de una perturbación estructural y de una mutagénesis dirigida, es posible modificar la distribución de carga de una proteína de un modo muy selectivo.

Fersht y colaboradores han demostrado que es posible manipular el perfil pH-actividad de la subtilisina mediante mutagénesis dirigida (Thomas y col., Nature, 318, 375-376 (1985); Russell y col., J. Mol. Biol., 193, 803-813 (1987); Russel y Fersht, Nature 328, 496-500 (1987)). La introducción de grupos cargados negativamente a 10-15 Å del centro activo en la superficie de la proteína eleva el valor de pK_{a} del centro activo de histidina. Y a la inversa, hacer la superficie más cargada positivamente disminuye el pK_{a} de los grupos ácidos. Cambiar el Asp99 a 13 Angstroms o el Glu156 a 15 Angstroms del centro activo por una lisina disminuye el pK_{a} del centro activo de histidina en 0,6 unidades de pH. Cambiar ambos residuos simultáneamente para proporcionar un mutante doble con un cambio de cuatro unidades de carga, disminuye el pK_{a} en 1,0 unidades de pH. Parece que los cambios en las interacciones Culómbicas pueden ser acumulativos.

Mutantes de glucosa isomerasa

El documento WO 89/01520 (CETUR) enumera una serie de luteínas de la xilosa isomerasa que pueden ser obtenidas a partir de Streptomyces rubiginosus y que pueden presentar una estabilidad incrementada. La selección de posibles posiciones que pueden ser mutadas se basa en criterios que se distinguen de los usados en la presente invención. Se enumeran más de 300 mutantes, pero no se presentan datos acerca de las características y de las alteraciones en las moléculas de enzimas mutantes.

Metodologías para obtener enzimas con propiedades mejoradas

Se pueden desarrollar o descubrir enzimas con propiedades mejoradas por diferentes vías, por ejemplo mediante métodos de escrutinio clásicos, mediante modificación química de proteínas existentes, o mediante el uso de técnicas de genética moderna y de ingeniería de proteínas.

La mutagénesis dirigida (SDM, del inglés "site-directed mutagenesis") es el modo más específico de obtener enzimas modificadas, lo que permite una sustitución específica de uno o más aminoácidos por otro aminoácido deseado cualquiera.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona métodos que se refieren a la producción de nuevas metaloenzimas mutantes mediante la expresión de genes que codifican dichas enzimas que presentan secuencias de aminoácidos que difieren en al menos un aminoácido con respecto a las metaloenzimas naturales correspondientes, y que exhiben propiedades catalíticas alteradas. Específicamente, el perfil pH-actividad es alterado cambiando la distribución global de carga en las proximidades del centro activo.

A este respecto, la invención proporciona un método para alterar el perfil pH-actividad de una enzima glucosa isomerasa natural de tal modo que dicho perfil, o su parte ácida, es desplazada hacia un pH menor, lo que comprende la sustitución de un residuo de aminoácido cargado negativamente por uno neutro o por uno cargado positivamente, o la sustitución de un residuo neutro por uno cargado positivamente, en el que dicha sustitución se produce en una posición seleccionada del grupo que consiste en: Ala25, Phe61, Gln204 y Leu258; en el que dichos residuos de la glucosa isomerasa proceden de Actinoplanes missouriensis cuya secuencia se muestra en la Figura 2, o la posición correspondiente en una glucosa isomerasa homóloga.

Adicionalmente, la invención proporciona un proceso para obtener una molécula mutante de glucosa isomerasa que comprende: (a) obtener una secuencia de ADN que codifica una glucosa isomerasa; (b) mutar esta secuencia en las posiciones de nucleótidos seleccionadas para proporcionar una enzima alterada en cualquiera de las posiciones Ala25, Phe61, Gln204 y Leu258 mediante una sustitución de un residuo de aminoácido cargado negativamente por uno neutro o por uno cargado positivamente, o mediante la sustitución de un residuo neutro por uno cargado positivamente, en el que dichos residuos de la glucosa isomerasa proceden de Actinoplanes missouriensis cuya secuencia se muestra en la Figura 2, o la posición correspondiente en una glucosa isomerasa homóloga; (c) clonar la secuencia alterada en un vector de expresión de tal modo que la secuencia de ADN pueda ser expresada; (d) transformar un organismo o célula hospedante con dicho vector; (e) cultivar dicho organismo hospedante; y, (f) aislar la glucosa isomerasa alterada.

Dicho proceso puede comprender adicionalmente el uso de la glucosa isomerasa mutante para la producción de un jarabe de fructosa.

En los anteriores aspectos de la invención, la glucosa isomerasa natural puede proceder de un microorganismo del orden Actinomycetales, tal como la Actinoplanes missouriensis, y, en concreto, las sustituciones de aminoácidos pueden ser A25K, F61K, Q204K y L258K.

Cuando la glucosa isomerasa es la isomerasa de Actinoplanes missouriensis de la Figura 2, la sustitución puede ser F61K+K253R.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una representación esquemática del centro activo de la glucosa isomerasa procedente de Actinoplanes missouriensis obtenida a partir de la estructura tridimensional del complejo glucosa isomerasa - xilitol. El inhibidor se muestra con todo detalle en el centro de la figura. En el caso de los residuos de aminoácido, sólo se muestran los átomos que participan en los enlaces de hidrógeno. Los nombres de los residuos de aminoácido se presentan en recuadros dibujados con líneas continuas, las moléculas de disolvente se encuentran en recuadros dibujados con líneas discontinuas. Las posiciones de unión de metales están indicadas mediante óvalos numerados con 395 y 580. Las líneas discontinuas indican interacciones electroestáticas: las líneas delgadas punteadas representan enlaces de hidrógeno, las líneas gruesas discontinuas representan la ligación propuesta para los metales. Los residuos conservados estrictamente están marcados con un asterisco. En el caso de los residuos no conservados, las sustituciones que se producen están indicadas.

La Figura 2 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de glucosa isomerasas procedentes de diferentes fuentes. Se presenta la secuencia completa de la glucosa isomerasa de Actinoplanes missouriensis. La secuencia de aminoácidos de la glucosa isomerasa de Ampullariella difiere de la secuencia publicada (Saari, J. Bacterial., 169, (1987) 612) en un residuo: se descubrió que la Prolina 177 de la secuencia publicada era una Arginina.

La secuencia de Streptomyces thermovulgaris sólo ha sido determinada hasta el aminoácido 346. Los residuos no determinados están en blanco. Un punto indica la ausencia de un residuo de aminoácido en la posición indicada en comparación con cualquiera de las otras secuencias. Las diferentes especies están indicadas con los siguientes símbolos:

Ami.:: Actinoplanes missouriensis DSM 4643

Amp.:: Ampullarella species ATCC31351

Svi.:: Streptomyces violaceoruber LMG 7183

Smu.:: Streptomyces murinus

Sth.:: Streptomyces thermovulgaris DSM 40444

Art.:: Arthrobacter species

Bsu.:: Bacillus subtilus

Eco.:: Escherichia coli

Lxy.:: Lactobacillus xylosus

La asignación de la estructura secundaria se realizó en la estructura de la Actinoplanus missouriensis. Las hélices del barril están marcadas con líneas continuas. Las cadenas \beta se encuentran en recuadros sombreados.

La Figura 3 muestra el perfil pH-actividad de la glucosa isomerasa en presencia de xilosa 200 mM y de magnesio 10 mM (cuadrados) y manganeso 1 mM (círculos).

La Figura 4 muestra el esquema de reacción correspondiente a la isomerización catalizada por la glucosa isomerasa en presencia de iones metálicos.

E = enzima, S = sustrato, M = ion metálico, P = producto.

La Figura 5 muestra la dependencia con respecto al pH de la reacción de la glucosa isomerasa con la xilosa y el Mg^{2+} tal como se observa en los experimentos de estado estacionario. K_{1}, K_{2}, K_{3} y K_{4} son las constantes de equilibrio explicadas en el texto y en el esquema de reacción de la Figura 4.

La Figura 6 muestra el perfil pH-actividad correspondiente a los mutantes K294R y K294Q en presencia de xilosa 200 mM y de magnesio 10 mM.

La Figura 7 muestra los perfiles pH-actividad correspondientes al E186Q y al E186D en presencia de xilosa 200 mM y de Mg^{2+} 10 mM.

La Figura 8 muestra los perfiles pH-actividad correspondientes al E186D y al E186Q en presencia de xilosa 200 mM y de Mn^{2+} 1 mM.

La Figura 9 muestra el perfil pH-actividad del mutante D255N en presencia de xilosa 200 mM y de manganeso 1 mM.

Las Figuras 10 a 20 muestran los perfiles pH-actividad normalizados correspondientes a los siguientes mutantes:

F254K (Fig. 10), F94R (Fig. 11), F61K (Fig. 12), A25K (Fig. 13), D57N (Fig. 14), L258K (Fig. 15), Q204K (Fig. 16), R23Q (Fig. 17), H54N (Fig. 18), H290N (Fig. 19), T95D (Fig. 20).

Las condiciones son las mencionadas en las Figuras.

\newpage

La Figura 21 muestra el perfil pH-actividad normalizado correspondiente al mutante F61KK253R. Las condiciones son las mencionadas en la Figura.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe la modificación de enzimas para mejorar su aplicabilidad industrial. La invención hace uso de técnicas recombinantes de ADN. Dichas técnicas constituyen una potente herramienta para obtener las sustituciones de aminoácidos deseadas en la proteína elegida. Debido a la cantidad virtualmente ilimitada de posibles sustituciones de aminoácidos, es preferible usar una estrategia selectiva. La presente metodología se basa en la aplicación bien coordinada de la cristalografía de proteínas, de la modelización molecular y métodos computacionales, de la enzimología y la cinética, de la biología molecular y técnicas de química de proteínas. Las estrategias para la identificación de mutaciones dirigidas son innovadoras en el sentido de que se reconoce que las mutaciones puntuales raramente provocan únicamente perturbaciones locales. Generalmente, las mutaciones afectan simultáneamente a varias propiedades diferentes de la proteína. Por tanto, aunque las estrategias descritas hacen uso de relaciones estructura-función bien establecidas, también proporcionan un modo racional de evitar o de corregir las alteraciones no deseadas en propiedades secundarias.

Una investigación bioquímica intensiva sobre los mutantes diseñados da como resultado la identificación de mutantes con propiedades mejoradas.

Con "propiedades mejoradas", tal como se usa aquí en relación con las presentes enzimas de glucosa isomerasa, nos referimos a enzimas en las que la parte ácida del perfil pH-actividad está desplazada hacia un óptimo de pH más ácido en relación a las correspondientes enzimas naturales.

Se estableció que el perfil pH-actividad de la glucosa isomerasa natural revela un descenso en la actividad a pH ácido por debajo de 7,0 y a pH alcalino por encima de pH 8,0 (Ejemplo 1 - Figura 3). Tal como se ha discutido anteriormente, sería preferible usar glucosa isomerasa a un menor pH.

Sorprendentemente, se descubrió que la caída en la actividad en el lado ácido del perfil pH-actividad está provocada por la protonación de una o más cadenas laterales de los aminoácidos, que están directamente involucradas en la coordinación del ion metálico catalítico de la glucosa isomerasa. Esto se dedujo a partir del hecho de que las constantes de asociación aparentes para la unión del metal, determinadas mediante cinética de estado estacionario, mostraron una dependencia similar con respecto al pH (Ejemplo 1 - Figura 5). Esto puede describirse mediante el siguiente modelo:

1

en el que "centro" se refiere al centro de unión geométrica compuesto por diferentes ligandos (ionizables). La enzima es activa únicamente cuando la posición está ocupada por un ion Mg^{2+}, el cual, a su vez, tan sólo puede unirse a la posición de unión de metal no protonada ("centro") y no a la protonada ("centro:H^{+}"). La protonación dependiente del pH del centro de unión del metal se caracteriza por el pK_{a}, mientras que la unión del metal al centro no protonado se caracteriza por la constante de asociación K_{as}. La constante de asociación aparente para la unión del metal es función de la verdadera K_{as}, del pK_{a} y del pH, y puede describirse de la siguiente forma:

K_{as}{}^{aparente} = K_{as} \text{*} \ (1 + 10^{pKa-pH})^{-1}

La velocidad de reacción es proporcional a la fracción de moléculas de enzima que están acomplejadas con Mg^{2+}. Esta fracción aumenta cuando aumenta [Mg^{2+}]*K_{as}{}^{aparente}.

Aunque el modelo presentado fue descrito después de una observación realizada con la glucosa isomerasa, es obvio que este modelo, y el método derivado de él, pueden ser usados para metaloenzimas en general, ya que la desactivación a pH bajo es debida a la disociación de los iones metálicos.

La caída observada en la actividad a pH alcalino es debida a un descenso en la velocidad máxima (V_{max}), que refleja la desprotonación de un residuo de aminoácido que es esencial para el mecanismo catalítico.

A partir del modelo descrito, que puede ser usado para explicar el descenso de la actividad en la vertiente ácida del perfil pH-actividad, se puede deducir que con el fin de aumentar la actividad de la glucosa isomerasa a valores de pH más bajos, la K_{as} tiene que ser incrementada y/o el pK_{a} tiene que disminuir.

Por tanto, las secuencias de ADN que codifican metaloenzimas tales como las glucosa isomerasa pueden ser mutadas de tal modo que las proteínas mutantes revelan un cambio en el perfil pH-actividad como resultado de un cambio en el pK_{a} de las cadenas laterales de aminoácidos que actúan como ligandos en la unión de metales.

Desplazamiento del perfil pH-actividad de metaloenzimas hacia pH menores, a través del cambio del pK_{a} de las cadenas laterales de aminoácidos

Con el fin de desplazar los pK_{a}'s de los ligandos que coordinan metales hacia un pH más ácido, se tienen que introducir residuos que aumenten la carga global positiva alrededor del centro de unión del metal en las metaloenzimas. Por consiguiente, la dependencia con respecto al pH de la actividad de las metaloenzimas, para las cuales la actividad al lado ácido del óptimo de pH es generada por el pK_{a} de la unión del metal, cambiará en consonancia. Esta alteración de cargas estabilizará la carga negativa de los grupos ionizables que son responsables de la dependencia con respecto al pH de la unión del metal a través de efectos electrostáticos de largo alcance.

De acuerdo con una realización preferida, el desplazamiento del perfil pH-actividad de la glucosa isomerasa hacia un pH más ácido se logra aumentando la carga positiva global alrededor del centro activo de la glucosa isomera-
sa.

Alrededor del pH neutro se puede obtener un incremento neto en la carga positiva mediante los siguientes procedimientos:

\bullet: Sustituyendo un residuo cargado negativamente (Asp ó Glu) por uno neutro.

\bullet: Sustituyendo un residuo neutro por uno cargado positivamente (Arg ó Lys).

\bullet: Sustituyendo un residuo cargado negativamente por uno cargado positivamente.

Para la selección de los residuos adecuados para ser mutados se pueden formular los siguientes criterios:

I.: Seleccionar aquellas posiciones en las que la sustitución dará lugar a un incremento neto de la carga positiva en un radio de 15 Angstroms alrededor de los residuos objetivo. Los residuos objetivo son los grupos ionizables que están involucrados en la coordinación del catión.

: Eliminar de esta colección:

\bullet: Todas las posiciones que ya contengan una carga positiva: arginina o lisina.

\bullet: Todas las posiciones que no puedan alojar una arginina o una lisina debido a que estos residuos darían lugar a inadmisible solapamiento de Van der Waals con los átomos de la cadena principal de la proteína.

\bullet: Todas las posiciones en las que una arginina o una lisina necesitarían una adaptación intensiva de posiciones adicionales en el entorno directo, con el fin de evitar solapamientos de Van der Waals.

\bullet: Todas las posiciones en las que la sustitución de una arginina o de una lisina daría lugar a una carga subyacente descompensada en un grupo hidrofóbico.

\bullet: Todas las posiciones en las que los residuos no deberían ser sustituidos debido a que están involucrados en disposiciones estructurales típicas tales como: puentes de sal, empaquetamiento de hélices, estabilización de hélices manteniendo una carga negativa en el comienzo de una hélice, iniciación de hélices, por ejemplo las prolinas al comienzo de una hélice, ángulos Phi-psi que se encuentran fuera de la región permitida para el residuo que se va a insertar.

II.: En una realización preferida también se eliminan los siguientes aminoácidos de la colección:

\bullet: Todos los residuos que están implicados en la catálisis, en la unión del cofactor (tales como los iones metálicos y los nucleótidos).

\bullet: Todas las posiciones que parecen estar conservadas de forma estricta entre enzimas homólogas (si se dispone de ellas).

III.: Por consiguiente, se puede atribuir una prioridad a cada posición de mutación posible. Esto se realiza mediante la inspección del entorno estructural del residuo, de la distancia de los residuos "objetivo", de la estructura de enlaces de hidrógeno en la que el residuo de dicha posición está involucrado y de la accesibilidad del disolvente.

: Con el fin de evitar el enmascaramiento de las interacciones electrostáticas mediante contraiones, se prefiere la introducción de cargas en posiciones que no pueden ser escudadas de los residuos objetivo por el disolvente. En general, debido a la diferencia en las propiedades dieléctricas entre la proteína y el disolvente, es más probable que las cargas, que no pueden estar completamente solvatadas debido al hecho de que están enterradas en el interior de la proteína o parcialmente enterradas en huecos de la superficie de la proteína, tengan efectos en comparación con las cargas que se encuentran completamente solvatadas. Además, en el caso de la glucosa isomerasa, la conversión de glucosa a fructosa se lleva a cabo con una baja fuerza iónica, y por tanto, se espera que el apantallamiento debido a los contraiones interfiera menos gravemente con la nueva interacción carga-carga diseñada en la nueva glucosa isomerasa descrita en la realización de la invención.

: Los criterios para establecer una baja prioridad a los anteriores centros seleccionados, cuando se sustituyen por una carga positiva, son:

\bullet: La introducción de una carga positiva y/o la eliminación de una carga negativa afectará a la integridad de la estructura cuaternaria.

\bullet: La posición es completamente accesible al disolvente, de tal modo que se espera que una carga introducida sea apantallada de los residuos objetivo por el disolvente, el cual, por lo tanto, disminuirá el efecto sobre el pK_{a} de los residuos objetivo.

Del mismo modo, el aumento de la carga negativa global alrededor del centro de unión del metal desplazará los pK_{a}'s hacia valores más básicos.

Desplazamiento del perfil pH-actividad de metaloenzimas hacia pH menores, a través del aumento de la K_{as} correspondiente a la unión del metal

En otra realización preferida de la presente invención, el desplazamiento del perfil pH-actividad hacia un pH más bajo se logra aumentando la K_{as}.

El desplazamiento del perfil pH-actividad de las metaloenzimas hacia un pH más ácido se puede lograr aumentando la constante de asociación correspondiente a la unión del metal. La constante de asociación de la unión del metal puede ser aumentada mediante la optimización de la coordinación de los metales y los ligandos. Esto puede realizarse mediante la introducción de mejores ligandos o mediante la introducción de más ligandos. Las interacciones electrostáticas pueden contribuir a la constante de asociación de la unión del metal desde distancias mucho mayores.

En otra realización preferida, la vertiente ácida del perfil pH-actividad de la glucosa isomerasa es desplazado hacia un menor pH mediante el aumento de la constante de asociación de la unión del metal.

La glucosa isomerasa se une a dos iones de magnesio por subunidad, dando como resultado la unión de ocho cationes por tetrámero, aumentado con ello la carga total en +16 (véase la Figura 1). Ambas posiciones de unión están localizadas en el extremo C del barril \beta. Las posiciones de unión "Hacia abajo" están localizadas a bastante profundidad en el barril y, en el complejo xilitol, se unen directamente a dos oxígenos del inhibidor. La segunda posición de unión ("Hacia arriba") está localizada próxima al extremo del barril \beta, cerca de la hendidura del centro activo y de la interfase de la subunidad.

En general, cuando un ion cargado positivamente se une a una segunda partícula, las constantes cinéticas de asociación y de disociación, así como la constante de afinidad de equilibrio global, dependerán de la carga de la segunda partícula. Cuando la partícula también está cargada negativamente se produce una repulsión y entre cargas opuestas se produce una atracción. Para iones pequeños, y en determinados casos también para proteínas, este efecto puede ser cuantificado estudiando la dependencia con respecto a la fuerza iónica de la velocidad de reacción. La velocidad de asociación de los iones cargados opuestamente disminuirá al aumentar la fuerza iónica, la velocidad de asociación de las mismas cargas aumentará al aumentar la fuerza iónica, y cuando una de las partículas no está cargada no existe efecto de la fuerza iónica.

La afinidad de la glucosa isomerasa por el magnesio disminuye al aumentar la fuerza iónica, lo cual es consistente con una carga negativa global de la posición de unión de la glucosa isomerasa. La unión del catión puede ser alterada por la introducción de aminoácidos cargados en la superficie de la proteína a lo largo de la trayectoria del catión al entrar en el centro activo. Más concretamente, esta invención se refiere al uso de fuerzas electrostáticas para alterar la constante cinética de asociación del catión. La glucosa isomerasa puede ser diseñada mediante ingeniería para aumentar la velocidad de asociación del catión mediante la adición de carga negativa (o mediante la eliminación de carga positiva) cerca del canal del centro activo, o para disminuir la velocidad de asociación del catión mediante la adición de carga positiva (o mediante la eliminación de carga negativa) cerca del canal del centro activo. Puesto que no es de esperar que el off-rate se vea afectado sustancialmente, un on-rate alterado dará como resultado una constante alterada para la asociación global del catión. Puesto que las regiones de lazo situadas en el extremo C del barril \beta dan forma a la entrada al centro activo, las posibles posiciones de mutación son buscadas en estas regiones. Para evitar posibles interferencias con la estabilidad del barril, no se considerarán sustituciones en la cadenas \beta o en las hélices \alpha. Se puede usar el siguiente razonamiento:

\bullet: Seleccionar todos los residuos de la región entre los extremos C de las cadenas \beta y los extremos N de las hélices \alpha.

\bullet: Rechazar para consideraciones adicionales todos los residuos en los que la sustitución conduce a un descenso de la carga neta positiva en una esfera de 15 Angstroms de radio alrededor de los ligandos del metal. La introducción de cargas negativas demasiado próximas a la posición de unión del metal desplazará el pK_{a} de los ligandos del metal hacia pH mayores, lo que cancelará el efecto de una K_{as} aumentada a bajo pH.

\bullet: Computar para cada uno de los residuos remanentes su área superficial accesible en el contexto de la proteína, y usar una sonda de radio 1,4 \ring{A}. Rechazar los residuos que están enterrados en el sentido de que presentan menos de 10 \ring{A}^{2} de área superficial accesible.

Información estructural

La información acerca de la estructura 3D de la enzima (o del complejo enzima:sustrato o del complejo enzima:inhibidor) es de gran importancia para poder hacer predicciones sobre las mutaciones que se pueden introducir.

Se han publicados datos estructurales correspondientes a la glucosa isomerasa de la Streptomyces rubiginosus (Carrel y col., J. Biol. Chem. 259 (1984) 3230-3236); Carrel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86, (1989) 440-4444), de la Streptomyces olivochromogenus (Farber y col., Protein Eng. 1, (1987) 467-475; Farber y col., Biochemistry 28 (1987) 7289-7297), Arthrobacter (Hendrick y col., J. Mol. Biol. 208 (1989) 127-157) y de la Streptomyces albus (Dauter y col., FEBS Lett. 247, 1-8).

Aunque no se dispone de todos los datos de la secuencia de aminoácidos de estas enzimas, la homología 3D-estructural con la glucosa isomerasa de la Actinoplanes missouriensis es sorprendente (véase F. Rey y col., Proteins 4 (1988) 165-172). Para mostrar la aplicabilidad general del método descrito en esta especificación, se han clonado y secuenciado los genes de glucosa isomerasa procedentes de varias especies. Las secuencias de aminoácidos de glucosa isomerasas obtenidas de los genes de Streptomyces violaceoruber, de Streptomyces murinus, de Arthrobacter spec. y de Streptomyces thermovulgaris son homólogas. Las secuencias de aminoácidos publicadas para las glucosa isomerasas de la Ampullariella sp. (Saari, ibid.) y de la Streptomyces violaceoniger (Nucl. Acids. Res. 16 (1988) 9337), deducidas de las secuencias de nucleótidos de los respectivos genes, muestran una estrecha homología con respecto a la glucosa isomerasa de Actinoplanes missouriensis. Además, el documento WO 89/01520 describe que la secuencia de aminoácidos de la glucosa isomerasa de la Streptomyces rubiginosus es homóloga a la glucosa isomerasa de Ampullariella sp.

A pesar de la ausencia de datos estructurales 3D para la mayoría de glucosa isomerasas, se puede concluir que todas las glucosa isomerasas procedentes de Actinomycetales presentan una organización tetramérica similar.

En general, se puede asumir que cuando la homología global es superior al 65%, preferiblemente superior al 74% (homología mínima entre las glucosa isomerasas de Actinoplanes missouriensis y de Streptomyces, de acuerdo con Amore y Hollenberg, Nucl. Acids Res. 17, 7515 (1989)), y más preferiblemente superior al 85%, y cuando la estructura 3D es similar, las sustituciones de aminoácidos conducen cambios similares en el óptimo de pH. En concreto, uno esperaría que las glucosa isomerasas procedentes de especies que pertenecen al orden de los Actinomycetales que presentan un elevado grado de similitud, tuvieran similares alteraciones en el óptimo de pH debido a sustituciones de aminoácidos en las posiciones seleccionadas. La Actinoplanes missouriensis es la fuente preferida de glucosa isomerasa para ser mutada.

La Figura 1 proporciona una representación esquemática del centro activo de la glucosa isomerasa procedente de Actinoplanes missouriensis.

La Figura 2 muestra las secuencias alineadas de aminoácidos de varias glucosa isomerasas.

En la presente especificación se usa tanto el código de aminoácidos de tres letras como el de una letra (véase por ejemplo, Stryer, L. Biochemistry, pag. 13, 2ª ed., W.H. Freeman and Comp., NY, 1981).

Experimental Clonación y expresión del gen de D-glucosa isomerasa

La D-glucosa isomerasa (GI) se usa de forma sinónima para la D-xilosa isomerasa ((D-xilosa) ketol-isomerasa, EC 5.3.1.5), una enzima que convierte la D-xilosa en D-xilulosa. La D-glucosa isomerasa procedente de Actinoplanes missouriensis producida mediante cepas diseñadas por ingeniería de E. coli se designa como EcoAmi (DSM) GI. Para distinguir el gen de Actinoplanes missouriensis que codifica la GI procedente del gen análogo de E. coli xylA, el primero será designado GI.

Los métodos para la manipulación de moléculas de ADN se describen en Maniatis y col. (1982, Cold Spring Harbor Laboratory) y en Ausubel y col. (1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. Nueva York). La clonación y la determinación de la secuencia de AND del gen de glucosa isomerasa de Actinoplanes missouriensis DSM 43046 se describe en el documento EP-A-0351029.

En la Figura 2 se numera y se compara la secuencia de aminoácidos derivada de la GI con otras glucosa isomerasas. A partir de aquí, la numeración de los aminoácidos se refiere a la Figura 2.

Las enzimas GI naturales y mutantes fueron producidas en la cepa K514 de E. coli, cultivada como se describe en el documento EP-A-0351029.

Ensayo de la actividad enzimática del producto de expresión

La actividad enzimática de la glucosa isomerasa fue ensayada tal como se describe a continuación [1 unidad de actividad enzimática produce 1,0 micromoles de producto (D-xilulosa ó D-fructosa) por minuto; por tanto, la actividad específica (spa) se expresa en unidades por mg de enzimas GI].

La actividad de GI puede evaluarse directamente midiendo el aumento de la absorbancia a 278 nm de la xilulosa producida a 35ºC por isomerización de xilosa mediante glucosa isomerasas. Este ensayo fue llevado a cabo en una disolución tampón de trietanolamina 50 mM, a pH 7,5, que contiene MgSO_{4} 10 mM, en presencia de xilosa 0,1 M. La concentración final de glucosa isomerasa en el ensayo fue ± 0.01 mg/ml, y fue determinada con precesión, antes de ser diluida en la mezcla del ensayo enzimático, mediante espectroscopía de absorción usando un coeficiente de extinción de 1,08 a 278 nm para una disolución de enzima de 1,0 mg/ml.

La actividad específica fue determinada con el Ensayo Acoplado de D-sorbitol Deshidrogenasa, la determinación enzimática de la D-xilulosa fue llevada a cabo a 35ºC tal como se ha descrito anteriormente (Kersters-Hilderson y col., Enzyme Microb. Technol. 9 (1987) 145) en trietanolamina 50 mM, a pH 7,5, MgSO_{4} 10 mM, y xilosa 0,1 M, en presencia de D-sorbitol deshidrogenada ± 2 x 10-8 M (L-iditol: NAD oxidoreductasa, EC 1.1.14), y NADH 0,15 nM, excepto que el tampón de incubación también incluía ácido etilenbis(oxietilennitrilo)tetraacético 1 mM (EGTA). La concentración final de glucosa isomerasa en este ensayo fue de ± 2,5 x 10^{-3} mg/ml, y fue determinada con precisión tal como se ha descrito anteriormente.

Tomando glucosa como sustrato, la actividad de GI se puede evaluar mediante la medida de la D-fructosa producida durante la reacción de isomerización usando el método de cisteína-carbazol (CCM), que se basa en la reacción de cetoazúcares con carbazol en ácidos para dar lugar a un producto púrpura (Dische y Borenfreund, J. Biol. Chem. 192 (1951) 583).

Ejemplo 1 Dependencia de la actividad de la glucosa isomerasa con respecto del pH

Con el objetivo de determinar el perfil pH-actividad de la glucosa isomerasa natural y mutante, se midió la actividad en función del pH (5,2-8,0) en presencia de MgSO_{4} 10 mM y de xilosa 200 mM (usando el método de ensayo directo). Para los mutantes con actividades muy bajas se usó el sistema de ensayo acoplado de sorbitol deshidrogenasa entre pH 5,8 y 8,4. Se extremaron las precauciones para que la reacción de sorbitol deshidrogenasa no fuera la etapa limitante de la cinética a valores extremos de pH.

En la Figura 3 se muestra el perfil pH-actividad de la glucosa isomerasa (es decir, la enzima recombinante natural procedente de Actinoplanus missouriensis) en presencia de xilosa 200 mM y de diferentes cationes activantes. Se observa un descenso en la actividad tanto a pH ácido por debajo de 7,0 como a pH alcalino por encima de 8,0.

El mecanismo cinético de estado estacionario apropiado para la glucosa isomerasa incluye la formación rápida de un complejo enzima-metal-azúcar que se convierte en el producto con una etapa limitante de la cinética (denominada equilibrio rápido, mecanismo de orden aleatorio, véase la Figura 4). Las medidas de fluorescencia de equilibrio y de cinética transitoria (flujo detenido) indican la presencia de dos posiciones de unión de ion metálico. En el experimento de flujo detenido los iones metálicos se unen de forma consecutiva. El metal de elevada afinidad desempeña el papel de mantener una conformación activa y, por tanto, es denominado centro "conformacional". La segunda posición de unión de metal acomoda al catión activante, por lo tanto esta posición normalmente es designada centro "catalítico". El esquema de reacción que se muestra en la Figura 4 parece ser adecuado para analizar y comparar los experimentos de estado estacionario y de flujo detenido. En principio, los resultados de estado estacionario no distinguen entre las dos posiciones de unión de metal, pero se asume que el efecto principal procede de la unión de metal catalítica.

El análisis de la velocidad inicial (v) de la conversión de xilosa en función de las concentraciones de xilosa y de magnesio permite determinar cuatro parámetros: la velocidad máxima, las constantes de equilibrio para la unión de magnesio a la enzima libre (K_{1}), el complejo enzima-azúcar (K_{4}), y las constantes de equilibrio de la unión de xilosa a la enzima libre (K_{2}) y al complejo enzima-magnesio (K_{3}).

\frac{V_{max}}{v} = 1 + \frac{1}{K_{3} * [S]} + \frac{1}{K_{4} * [M]} + \frac{1}{K_{3} * K_{1}*[S]*[M]}

donde [M y [S] representan la concentración del ion metálico y de la xilosa, respectivamente.

Mediante una variación sistemática de las concentraciones de ion de magnesio y de xilosa fue posible obtener valores para velocidad máxima y para las cuatro constantes de equilibrio. La Figura 5 muestra la dependencia de estos parámetros con respecto al pH.

La comparación de los resultados de las Figuras 3 y 5, muestra que la vertiente ácida del perfil de pH está determinada completamente por la unión del ion metálico.

Los datos de la Figura 5 no son suficientemente precisos para calcular el número de ionizaciones involucradas. Sin embargo, la pendiente de las curvas de logK_{1,4} frente al pH (pendiente > 1) indica que puede haber involucrada más de una ionización. La similitud en la dependencia con respecto al pH de K_{1} y K_{4} indica que los mismos grupos ionizantes son importantes para estos dos procesos (incluyendo la misma posición).

Ejemplo 2 Selección de los residuos de aminoácido de la glucosa isomerasa cuya sustitución alterará los valores de pK_{a} de la unión del metal, aminoácidos ionizables.

En el caso de la glucosa isomerasa, los criterios para la selección de posibles posiciones para la sustitución, como se ha esbozado en la descripción detallada de esta invención, fueron aplicados usando las secuencias alineadas procedentes de diferentes fuentes (Figura 2) y la estructura altamente resuelta de la glucosa isomerasa de Actinoplanes missouriensis en complejo con el inhibidor xilitol (véase la Figura 1 y la "Información Estructural" de la "Descripción detallada de la invención"). La estructura altamente resuelta, con una resolución de 2,2 Angstroms, revela la posición del inhibidor y las dos posiciones de unión del metal. En la Figura 1 se proporciona una representación esquemática de la posición activa de la glucosa isomerasa de la Actinoplanes missouriensis.

De la estructura de la glucosa isomerasa acomplejada con cobalto y xilitol se seleccionaron los residuos en los que una sustitución por un residuo de aminoácido más cargado positivamente conducía a un incremento neto de la carga positiva en un radio de 15 Angstroms alrededor de los grupos ionizables objetivo. En el caso de la glucosa isomerasa, los objetivos son los grupos ionizables que están involucrados en la coordinación de los iones metálicos requeridos para la actividad. Estos grupos ionizables objetivo implican los grupos carboxilo de Glu181, Glu217, Asp245, Asp292 y el NE de His220.

Después de la aplicación del criterio I, se obtuvieron 80 posibles posiciones de mutación. Estas posiciones se enumeran a continuación:

2

Después de descartar los residuos catalíticos y los residuos conservados estrictamente (criterio II), quedaron los siguientes 62 residuos:

3

Posteriormente se atribuyó prioridad a cada uno de estos 62 posibles centros de mutación de acuerdo con el criterio III. Las siguientes 24 posiciones fueron atribuidas como de alta prioridad para la mutagénesis: Ala25, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe61, Ile85, Thr95, Gln122, Thr133, Tyr145, Tyr158, Gly189, Ile191, Gln204, Thr218, Gln222, Leu226, Thr229, Gly231, Leu236, Gln256, Leu258, Tyr293 y Val380.

La mutación de uno o de varios de los 80 residuos de aminoácido seleccionados para dar residuos cargados positivamente dará como resultado un descenso del pK_{a} de la unión del metal a la glucosa isomerasa. Esto puede dar como resultado un desplazamiento del perfil pH-actividad hacia un pH menor.

En consonancia, la mutación de uno o de varios de los 80 residuos de aminoácidos para generar residuos cargados negativamente dará como resultado un aumento del pK_{a} de la unión del metal a la glucosa isomerasa. Esto puede dar como resultado un desplazamiento del perfil pH-actividad hacia un pH mayor.

Ejemplo de referencia A

El efecto de mutar Lys 294 sobre el perfil pH-actividad

En la posición 294 de la glucosa isomerasa se encuentra una carga positiva a aproximadamente 8 Angstroms de la posición de unión del metal más ocupada del complejo glucosa isomerasa-xilitol (395 de la Figura 1). Se realizó una mutación en esta posición, sustituyendo la lisina por una arginina. Esta mutación conserva la carga positiva de la posición 294. En consonancia con esta conservación de la carga positiva se haya la observación de que el perfil pH-actividad de este mutante es similar al de la enzima natural.

Sin embargo, si se elimina la carga positiva de la posición 294 sustituyendo la lisina 294 por una glutamina, observamos un desplazamiento del perfil pH-actividad hacia la vertiente alcalina en aproximadamente 0,5 unidades de pH. Los perfiles pH-actividad correspondientes al K294R y al K294Q se muestran en la Figura 6.

Este ejemplo ilustra que es posible manipular el pK_{a} de uno o más grupos funcionales, en el centro activo de la glucosa isomerasa, cambiando la carga neta de la proteína alrededor del centro activo.

Ejemplo de referencia B

El efecto de mutar Glu186 y de sustituir los iones de magnesio por iones de manganeso sobre el perfil pH-actividad

En el mutante E186Q se sustituye una carga negativa por una neutra, lo que da lugar a un incremento neto de la carga positiva en un radio de 15 Angstroms alrededor de los ligandos del metal. El perfil pH-actividad del mutante E186Q en presencia de magnesio se muestra en la Figura 7. La vertiente alcalina del perfil de pH se ve desplazada significativamente hacia un pH menor. En presencia de manganeso en lugar de magnesio, el perfil pH-actividad del E186Q
se ve desplazado hacia un pH menor y a su pH óptimo su actividad es mayor que para la enzima natural (Figura 8).

Para aplicaciones en las que se pueden usar otros iones metálicos distintos del magnesio, la combinación del E186Q con manganeso a pH bajo es una opción interesante.

También llevamos a cabo la mutación E186D que es conservativa en lo que a carga se refiere. El perfil pH-actividad de este mutante se muestra en las Figuras 7 y 8. La dependencia de la actividad con respecto al pH para el mutante E186D no es significativamente diferente a la de la enzima natural. La eliminación de la carga negativa en la posición 186 desplazó el perfil pH-actividad hacia un pH más ácido. Este ejemplo confirma que el razonamiento aplicado a la mutación E186Q es válido.

Ejemplo de referencia C

El efecto de sustituir Asp255 sobre el perfil pH-actividad

La sustitución del ácido aspártico cargado negativamente de la posición 255, que en realidad es un ligando de unión de metal de la glucosa isomerasa, por una asparagina neutra, da lugar a un desplazamiento del perfil pH-actividad hacia un pH menor en presencia de manganeso. El óptimo de pH se ve desplazado aproximadamente 2 unidades de pH hacia un pH más ácido.

El perfil pH-actividad se presenta en la Figura 9.

Ejemplo 3 Glucosa isomerasas con un perfil pH-actividad alterado

Los mutantes de glucosa isomerasa que fueron creados de acuerdo con los métodos descritos en la descripción detallada de la invención fueron evaluados en relación a su perfil pH-actividad en las condiciones indicadas en las Figuras (10 a 20). El perfil pH-actividad de un mutante es el resultado, por un lado, del efecto de la mutación sobre el pK_{a} y, por otro, del efecto de la K_{as}.

\global\parskip0.970000\baselineskip

En las Figuras se presentan los resultados correspondientes a los siguientes mutantes:

F254K (Fig. 10), F94R (Fig. 11), F61K (Fig. 12), A25K (Fig. 13),

D57N (Fig. 14), L258K (Fig. 15), Q204K (Fig. 16), R23Q (Fig. 17),

H54N (Fig. 18), H290N (Fig. 19), T95D (Fig. 20).

Para los mutantes en los que se introdujo una carga positiva (F254K, F94R, F61K, A25K, L258K, Q204K) o en los que se neutralizó una carga negativa (D57N), se puede observar que la vertiente ácida del perfil pH-actividad está desplazada hacia un pH menor.

Para los mutantes en los que se introdujo una carga negativa (T95D) o en los que se neutralizó una carga positiva (R23Q, H54N, H290N), se puede observar que el perfil pH-actividad está desplazado hacia un pH mayor.

Estas dos observaciones están de acuerdo con el modelo presentado en la descripción detallada de la invención.

Sin embargo, debería destacarse que los mutantes en los que se ha sustituido un aminoácido conservado (F94R, D57N, H54N) dan lugar a un descenso drástico de la actividad específica con xilosa. En la posición 254 de la secuencia (Figura 2) sólo se encuentran aminoácidos hidrofóbicos. La introducción de un aminoácido cargado (F254K) en esta posición también conduce a un descenso drástico en la actividad específica. De este modo, se puede concluir que aunque se pueden usar posiciones de aminoácidos (semi)conservadas para alterar las cargas con el fin de modificar el perfil pH-actividad, no son posiciones preferidas.

Ejemplo 4 Estabilización de mutantes con un óptimo de pH alterado para obtener una mejor actividad en las condiciones de aplicación

Los mutantes H290N y F61K proporcionan el desplazamiento esperado en el perfil pH-actividad tal como se describe en el Ejemplo 6. De estos mutantes, el H290N fue inmovilizado como se describe en el documento EP-A-351029 (Ejemplo 7). Se llevó a cabo un ensayo de aplicación de la glucosa isomerasa natural y de este mutante tal como se describe en la misma solicitud (Ejemplo 8). La estabilidad se indica mediante la constante de pérdida de actividad de primer orden (k_{d}, cuanto más baja es la constante de pérdida de actividad más estable es la enzima). La Tabla 2 proporciona los valores de k_{d} correspondientes a la glucosa isomerasa natural y a la mutante.

TABLA 2 Constantes de pérdida de actividad correspondientes a la glucosa isomerasa natural y a la mutante, inmovilizadas con Lewatit

		K_{d} (x 10^{6} seg^{-1})
	Natural	2,5
	H290N	3,1
	K253R	0,7
	H290NK253R	1,6
	F61KK253R	1,4

Como puede observarse en la Tabla 2, el H290N se ve desestabilizado en comparación con la glucosa isomerasa natural. Se descubrió que el K253R estabilizaba a la glucosa isomerasa natural por un factor superior a tres. El perfil pH-actividad correspondiente al mutante K253R es idéntico al de la enzima natural.

La combinación del mutante de pH H290N con el mutante de estabilidad K253R demuestra que los mutantes de pH pueden ser estabilizados introduciendo mutaciones que han demostrado servir para estabilizar la enzima natural.

Además, la Tabla 2 muestra que el mutante de pH F61K se ve estabilizado con respecto a la enzima natural después de la introducción del K253R.

El desplazamiento ácido del perfil pH-actividad del F61K se mantiene en el mutante doble (Figura 21). Esto demuestra que las mutaciones que mejoran diferentes propiedades de una enzima pueden ser combinadas en un nuevo mutante que engloba las propiedades mejoradas de las mutaciones individuales (un óptimo de pH mejorado y una estabilidad mejorada, en este caso).

También debe entenderse que los ejemplos anteriores pretenden demostrar el concepto de la invención, que se define en las reivindicaciones. Debería quedar claro que las combinaciones de las anteriores mutaciones con otras mutaciones que conduzcan a características alteradas, por ejemplo termoestabilidad, unión a metales o especificidad de sustrato, también quedan cubiertas por la presente invención.

\global\parskip0.990000\baselineskip

Claims

1. Un método para alterar el perfil pH-actividad de una enzima glucosa isomerasa natural de tal modo que dicho perfil, o su vertiente ácida, es desplazado hacia un pH menor, que comprende la sustitución de un residuo de aminoácido cargado negativamente (Asp ó Glu) por uno neutro o por uno cargado positivamente, o la sustitución de un residuo neutro por uno cargado positivamente (Arg ó Lys), en el que dicha sustitución se produce en una posición seleccionada del grupo que consiste en:

Ala25, Phe61, Gln204 y Leu258;

en el que dichos residuos de glucosa isomerasa proceden de la Actinoplanes missouriensis, cuya secuencia se muestra en la Figura 2, o de la posición correspondiente de un glucosa isomerasa homóloga.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la glucosa isomerasa natural se obtiene de un microorganismo del orden de las Actinomicetales.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la glucosa isomerasa natural se obtiene de Actinoplanes missouriensis.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la glucosa isomerasa contiene al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: A25K, F61K, Q204K y L258K.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la glucosa isomerasa es la isomerasa de Actinoplanes missouriensis de la Figura 2 y contiene la sustitución F61K+K253R.

6. Un proceso para obtener una molécula de glucosa isomerasa mutante que comprende:

(a): obtener una secuencia de ADN que codifique una glucosa isomerasa;

(b): mutar dicha secuencia en las posiciones de nucleótidos seleccionadas para proporcionar una enzima alterada en cualquiera de las posiciones Ala25, Phe61, Gln204 y Leu258 mediante una sustitución de un residuo de aminoácido cargado negativamente (Asp ó Glu) por uno neutro o por uno cargado positivamente, o mediante la sustitución de un residuo neutro por uno cargado positivamente (Arg ó Lys).

: en el que dichos residuos de glucosa isomerasa proceden de Actinoplanes missouriensis, cuya secuencia se muestra en la Figura 2, o de la posición correspondiente de una glucosa isomerasa homóloga;

(c): clonar la secuencia alterada en un vector de expresión de un modo tal que la secuencia de ADN pueda expresarse;

(d): transformar un organismo o una célula hospedantes con dicho vector;

(e): cultivar dicho organismo hospedante; y,

(f): aislar la glucosa isomerasa alterada.

7. El proceso de la reivindicación 6, en el que la glucosa isomerasa natural se obtiene a partir de un microorganismo del orden de los Actinomycetales.

8. El proceso de la reivindicación 7, en el que la glucosa isomerasa natural se obtiene a partir de Actinoplanes missouriensis.

9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que la glucosa isomerasa contiene al menos una de las siguientes sustituciones de aminoácidos: A25K, F61K, Q204K y L258K.

10. El proceso de la reivindicación 6, en el que la glucosa isomerasa es la isomerasa de Actinoplanes missouriensis de la Figura 2 y contiene la sustitución F61K+K253R.

11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, que además comprende el uso de la glucosa isomerasa mutante para la producción de un jarabe de fructosa.