PT96416A - Processo para a preparacao de novas glicose isomerases possuindo um ph alterado optimo - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de GIST-BROCADES N.V., holandesa, industrial e comercial, com sede em Wate-ringseweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA DELPT, Holanda e de PLANT GENETIC SYSTEMS N.V., belga, industrial e comercial, com sede em Kolonel Bourgstraat 106 bus 6, 10^0 Bruxelas, Bélgica, (inventores: Anne-Marie Virgi-nie Renee Lambeir, Ignace Las-ters e Nadir Mrabet, residentes na Bélgica e Wilhelmu» Johannes Quax, Jan Metske Van der Laan e Onno Misset, residentes na Holanda), para: "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DB NOVAS GLICOSE ISOMERASES POSSUIN-DO UM PH ALTERADO ÓPTIMO".

Descrição

ÂMBITO TÉCNICO A presente invenção refere-se à aplicação da tecnologia da engenharia de proteínas para melhorar as propriedades das metaloenzimas · É proporcionado um processo para a sje lecção de aminoácidos que após alteração influenciam o perfil de actividade-pH das metaloenzimas. 0 referido processo é aplicado à glicose isomerase. A presente invenção também proporcio-* na moléculas de glicose isomerase que sofreram mutação com um

valor de pH óptimo alterado. Especificamente a parte ácida do perfil de pH-actividade é desviado para valores mais baixos de pH. A presente invenção proporciona ainda glicose isomerases recombinantes que podem ser aplicadas com vantagem na produção de xaropes de frutose, em particular xaropes de milho com alto teor de frutose.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Aplicação industrial da glicose isomerase

Na produção industrial de amido as enzimas de degradação jogam um papel importante . A enzima ot -amilase é uti lizada para a liquefacção do amido em dextrinas com um grau de polimerização de cerca de 7 a 10. Posteriormente a enzima o(-ami loglucosidase ó utilizada para a sacarificação que resulta num xarope contendo 92-26% de glicose, A isomerização reversível da glicose em frutose ó catalisada pela enzima glicose (ou xilose) isomerase. A nomenclatura correcta desta enzima e D-xilose-cetol -isomerase (BC 5·3·1»5) devido à preferência da enzima para a xilose. Contudo, devido à grande aplicação da enzima na conversão da glicose para frutose ela I vulgarmente designada por glicose isomerase. A conqtante de equilíbrio para esta isomerização S px^óxima da unidade de forma a que se convertem em condições de processamento óptimo cerca de 50^ da glicose. A mistura de equilíbrio de glicose e frutose e conhecida como xarope com elevado teor de frutose. A frutose I mais doce para o gosto humano do que a glicose ou sacarose o que a toma economicamente competitiva como substituto de açúcar.

Poi verificado qué muitos microorganismos que produziam glicose isomerase, tinham aplicação industrial. Uma revisaõ detalhada da utilização de glicose isomerases foi dada por Wen-Pin Chen em "Process Boichemistry”, lj> Junho/Julho (1980) 30-41 e Agosto/Setembro (1980) 36-41. Á referência de ¥en-Pin Chen descreve condições 2 -

tHM

de cultura para microorganismos, bem como a recuperqçâo e processos de purificação para a enzima. Além disso ele também resume as propriedades das glicoses isomerases como por exemplo a especificidade de substrato, temperatura óptima e pH óptimo, estabilidade térmica e necessidades de iões metálicos. A glicose isomerase requer um catião bivalente 24* por exemplo Mg , Co , Mn ou uma combinação destes catiões para a sua actividade catalítica. A determinação das estruturas tridimensionais dqs diferentes glicose isomerases revelou a prtí sença de 2 iões metálicos na unidade monomérica (Parber e col., Protein Eng. 1 (1987) 459-466j Rey e col., Proteins 4 (1987) 165-172; Henrick e col., Protein Eng. JL (1987) 467-475).

Para além de um papel no mecanismo catalítico, os catiões bi vai entes são também referidos como alimentando a termoestabilidade de algumas glicose isomerases (m, Callens e col. ém "Enzyme Microb. Technol”. 1988 (lO), 695-700). Além disso, a actividade da glicose isomerase é muito inibida pelos iões Ag e Hg , Gu , Zn e Ca .

As glicose isomerases têm geralmente os seus va lores óptimos de pH entre 7,0 e 9,0. Existem várias razões para que seja benéfico utilizar a glicose isomerase a um valor mais baixo de pH. Três destas razões sãoí a) estabilidade das moléculas de açúcar, b) adaptação a fases de processos anteriores e/ou posteriores e c) estabilidade da enzima, que serão descritas a seguir para melhor ilustração. a) em condições alcalinas e a.temperaturas elevadas a formação de produtos secundários coloridos e a produção de açúcar não-metabolizado (D-Psicose) constitui um grande problema. 0 valor de pH de serviço desejado deve ser cerca de 0,6. X volta deste valor de pH será mínima a degradação da glicose e da fru-tose. b) Um valor de pH óptimo diminuído é também desejável pa- - 3 -

ra a glicose isomerase quando esta enzima é para ser utilizada em combinação com outras enzimas» ou entre outras fases enzimá-ticas, por exemplo na produção de xaropes de alto teor de fruto se. Neste processo uma das outras fases enzimáticas, a sacarificação por of-glucoamilase» é efectuada a um valor de pH de c) A maior parte das glicose isomerases conhecidas são aplicadas a um valor de pH de 7»5· Este valor de pH é um compromisso entre uma actividade inicial superior a um valor de pH superior e uma maior estabilidade da enzima imobilizada a um valor de pH inferior, resultando numa produtividade óptima no valor do pH escolhido (R. V. Tilburg, Thesis: "En-gineering Aspects of Biocatalysts in Industrial Starch Conver-sion Technology", Defeltse Universitaire Pers, 1938), A aplicação da glicose isomerase a um valor de pH inferior a 7»5 podia beneficiar da maior meia vida e combinado com uma maior actividade especifica, aumentaria consequentemente a produtividade da enzima imobilizada para esse valor de pH inferior, A partir do que foi acima referido pode concluir-se que existe uma necessidade de glicose isomerases com maior actividade a valores de pH inferiores em condições de processamento.

Foram escrutinados muitos microrganismos para a glicose isomerase com um valor de pH óptimo inferior. Apesar de muitos esforços, esta técnica não conduziu a novas glicose isomerases comerciais.

Para se ser capaz de alterar o perfil de pH-ac-tividade de glicose isomerases na direcção de pH inferior por engenharia de proteínas é importante reconhecer os efeitos subjacentes que dão origem a diminuição rápida no comportamento ca talítico a valores de pH ácidos.

Papel dos iSes metálicos nas enzimas

Podem ser consideradas duas funções diferentes para os iões metálicos.

Em primeiro lugar os iões metálicos podem ter a k a

ura papel estrutural. Isto significa que eles estão envolvidos na manutenção da estrutura tridimensional adequada e, portanto, contribuem para a termo estabilidade da molécula de enzima. , 2+

Como exemplo desse papel estrutural e estabilizante e o Ca na família das subtilisinas das proteinases de serina.

Em segundo lugar, os iões metálicos podem ac- tuar como cofactores no mecanismo catalítico. Neste caso a ac- tividade da enzima é estritamente dependente da presença do ião metálico no ponto activo. 0 ião metálico pode por exemplo ser- 2+ vir como ponte entre a enzima e o substrato (por exemplo Ca em fosfolipase liga o grupo fosfato do substrato) ou pode acti-var a água para se tornar um ião hidroxilo nucleéfilo potente (ZnZ*-OlT). 2+

Os exemplos são as Zn -proteases como por exem 2+ """ pio termolisina e carboxipeptidase, anidrase carbónica (Zn ), fosfolipase-A_ (Ca ), nuclease de estafilococos (Ca ) e fosfa A . 2+ 2+\ **" tases alcalinas (Mg , Ca ). Exemplos de enzimas de corpo al-fa-beta que necessitam de catões para polarizar um grupo carbo-xilo ou carbonilo de modo a transferir o hidrogénio são a glico se isomerase/xilose (Mg2%), rlbulose-l,5-bifosfato carboxilase/ o * /oxigenase (RUBISCO) (Mg ), enolase (Mg ), aldolase de fungo (Mg2*, K*) , mandolato racemase (Mg2*) , muconato cicloisomerase (Mn ). Na presença de agentes quelantes metálicos (como por exemplo EDTA) estas enzimas perdem completamente a sua activi-dade. A ligação de iões metálicos numa molécula de proteína envolve geralmente uma coordenação de 4 ou 6 ligantes. Dependendo do tipo de ião metálico, são encontrados diferentes ligantes. Por exemplo o magnésio e o cálcio são habitualmente ligados por átomos de oxigénio de um grupo carbonilo da cadeia principal da proteína, um grupo carbonilo de uma cadeia lateral de glutamina ou asparagina ou o carboxilato de uma cadeia lateral de ácido aspártico ou glutâmico. Os iões de zinco e de cobre são geralmente ligados por átomos de azoto de uma cadeia lateral de histidina ou os átomos de enxofre de cisteína e me-* tionina. « 5 *

A actividade de uma enzima é dependente do valor de pH do meio aquoso. Esta dependência é causada pela (<M-protonaçao de grupos ionizáveis no ponto activo da enzima, por um lado, e grupos ionizáveis do substrato, ou produto (se preser te) por outro lado. Os grupos ionizáveis na proteína envolvem as cadeias laterais dos aminoácidos básicos lisina, arginina e his-tidina (contendo uma carga positiva na forma protonada), e os aminoácidos acídicos como o ácido aspártico, ácido gutânico, cisteína e tirosina (contendo todos uma carga negativa após des-protonação). Além disso, o grupo amino do terminal N e do grupo carboxilo do terminal Ne do grupo carboxilo do terminal C contém uma carga positiva e negativa respectivamente. Os valores de pKa de alguns aminoácidos são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1, Grupos ionizáveis de aminoácidos ocorrendo em proteí nas pK a Carga positiva (base) N-terminal 7.5-8.5 Lisina 10.5 Arginina 12.5 Histidina 6.0-7.0 Carga negativa (ácido) C-terminal 3.0-4.0 Ácido aspáã&tico 3.9 Ácido glutâmico 4.3 Cisteína 8.3 Tirosina 10.1 = 6 =

~ Deve notar-se que estes valores de pK& são vá lidos para compostos modelo e qúe podem ocorrer grandes variações quer dentro quer entre diferentes proteínas, devido ao ambiente específico do grupo ionizável. Os efeitos electroestáti-cos jogam um papel fundamental na função e estruturas das enzimas (ver J.A. Matthew et col., "CRC Criticai Reviews in Bioche-mistry”, 18 (1985) 91-197). A presença de uma carga positiva próxima de um grupo ionizável fará diminuir o seu valor de pKa enquanto que uma carga negativa provocará um aumento no valor de pK . A grandeza do efeito diminui com a distância entre o

SL grupo removível e a carga. Além disso, o valor desta diminuição é dependente da constante dieléctica do meio. Resíduos especiaJL mente catalíticos podem revelar valores de pK. que se desviam destas médias (ver por exemplo Persht, Bnzyme structure and me-chanism, 1985, W.H. Freeman, New York), A dependência de pH de uma reacção catalisada com enzimas pode ser definida na dependência de pH da constante de Michaelis Km e a dependência de pH da constante de velocidade Kcat (equivalente a V / ). Estes parâmetros representam a liga-çâo do substrato no estado estável e no estado de transição res pectivamente. Â (des)protonação dependente de pH das cadeias la terais de aminoácidos que afectam a ligação de ambas as formas de substrato, ou que estão por outro lado envolvidas na reacção catalítica (por exemplo absorção e libertação de protões como acontece na catálise básica geral), determinam, portanto, o per fil de pH-actividade de uma enzima.

Por exemplo a protonação da histidina na tríade catalítica das proteases de Serina (quer as famílias da tri£ sina quer da subtilisina) I responsável pela perda de activida-de para valores de pH mais baixos ( <7)· Neste caso, 0 valor de pK da actividade de enzima está directamente relacionada com o a valor de pK deste resíduo de histidina. a

Como segundo exemplo, os dois resíduos de ácido aspártico nas proteases de aspartilo, como por exemplo peps_i na e quimosina, podem ser mencionados. Estes grupos determinam * o pH óptimo destas proteases. 0 arranjo estrutural típico dos = 7 =

ácidos aspárticos faz com que eles tenham valores de pK dife- a rentes conduzindo ao perfil de pH-actividade com a forma de cam paínha.

Sabe-se que alterando a carga superficial por modificação química acentuada pode conduzir a alterações significativas na dependência de pH na catálise. Contudo em muitos casos esta técnica conduz a uma desactivação e/ou alterações estruturais indesejadas da enzima dado que estes processos são bastante não específicos. A modificação química selectiva das lisinas em citocroma c revelou ter um efeito no potencial re-dox (D.C. Rees, J. Mol. Biol. 173, 323-326 (1980)). Contudo, es. tes resultados foram criticados dado que o reagente químico bru to utilizado para a modificação podia perturbar a estrutura da proteína.

Utilizando a estrutura tridimensional de uma proteína para prever a possibilidade de perturbação estrutural e mutagénese dirigida a certos sítios, é possível modificar a distribuição de cargas numa proteína numa forma muito selectiva,

Fersht e colaboradores mostraram que é possível manipular o perfil de pH-actividade da subtilisina por mutagénese dirigida a sítios (Thomas e col, Nature, 318. 375-37^ (1985)·, Russell et col, J. Mol. Biol., 193. 803-813 (1987); Russel e Fersht, Nature 328. ^96-500 (1987)). A introdução de grupos de carga negativa a 10-15 1 do sítio activo à superfície da proteína aumenta o valor de pK da histidina no sítio activo, €t

Alteraativamente, tornando a superfície mais positivamente carregada diminui-se o valor do pK dos grupos acídicos. Alterando « a o os valores de Asp99 a 13 Angstroms em Glul56 a 15 Ansgtroms no sítio activo para uma lisina diminui-se o valor do pK& do sítio activo da histidina de 0,6 unidades de pH. Alterando ambos os resíduos simultaneamente para se obter um mutante duplo com uma alteração de 4 unidades de carga diminui-se o valor do pK de 10 unidades de pH. Parece que as alteraçSes Coulômbicas podem ser cumulativas. 8 =

Mutantes de glicose isomerase 0 documento WO 89/01520 (Cetus) refere um número de muteínas da xilose isomerase que podem ser obtidas de Streptomvces rubiginosus e que podem ter uma maior estabilidade. A selecção de sítios possíveis que podem sofrer a mutação é baseada em critérios que diferem dos utilizados na presente invenção. São referidos rnais de 300 mutantes mas não são apresentados dados referindo as características e as alteraçães nas enzimas mutantes.

Metodologias para se obterem enzimas com superiores propriedades

Podem ser desenvolvidas ou criadas de várias formas enzimas com melhores propriedades, por exemplo, por processos de escrutínio clássicos, por modificação química de proteínas existentes, ou utilizando técnicas modernas de engenharia genéticas de proteínas, A mutagénese orientada para sítios (SBM) é a maneira mais específica de se obterem enzimas modificadas, permitindo a substituição específica de um ou mais aminoácidos por outro aminoácido pretendido,

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona novas metalo-enzimas mutantes obtidas por expressão de genes que codificam as referidas enzimas possuindo sequências de aminoácidos que diferem em pelo menos um aminoácido das metaloenzimas naturais correspondentes e que apresentam propriedades catalíticas alteradas. Especificamente, o perfil de pH-actividade é alterado modificando a distribuição de carga global em tomo do sítio activo.

Numa das realizaçães preferidas da invenção sofrem mutação as glicose isomerases.

Constitui outro aspecto da invenção proporcionar um processo para a escolha de sítios, nas enzimas de tipo natural, que podem ser explorados para a mutagénese orientada = 9 -

a sítios de modo a modular o perfil de pH-actividade.

Em ainda outro aspecto da presente invenção são proporcionadas glicose isomerases com um valor de pH ácido óptimo em relação a glicose isomerase de tipo natural.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra uma representação esquemática do sítio activo da glicose isomerase de Actinoplanus rnis-souriensis. derivada da estrutura tridimensional do complexo de glicose isomerase-xilitol. 0 inibidor é representado eom ©

linhas a cheio no centro da figura. Para os resíduos de aminoá-cido apenas são desenhados os átomos que estão envolvidos por ligação de hidrogénio. Os nomes dos resíduos de aminoácidos estão em caixas desenhadas com linhas a cheio, e as moléculas de solvente estão em caixas desenhadas por linhas a tracejado. Os sítios de ligação metálica são indicados por figuras ovais numeradas de 395 e 58o. As linhas a tracejado indicam interacçSes electroestáticas: as linhas a ponteado fino representam liga-çães de hidrogénio, as linhas a tracejado grosso a ligação proposta dos metais. Os resíduos estritamente conservados são marcados com um asterisco. Para os resíduos não conservados são indicadas as substituiçães não encontradas.

A Figura 2 mostra o alinhamento de sequências de aminoácidos de glicose isomerases de fontes diferentes, E apresentada a sequência completa de Actinoplanus missouriensis glicose isomerase. A sequência de aminoácidos de Ampullariella glicose isomerase difere das sequências publicadas (Saari, J. Bacteriol., 169» (1987) 612) por um resíduo: Prolina 177 na s_e quência publicada foi verificado ser arginina. Δ sequência de Streptomyces thermovuígaris foi apenas estabelecida até ao aminoácido 346. Os resíduos indeterminados são deixados em branco. Uma linha indica a ausência do resíduo de aminoácido nesta posição quando comparado com qualquer das outras sequências. As espécies diferentes são indicadas pelos seguintes pontos:

Ami. : Actinoplanes missouriensis DSM 4643 * 10 *

Arrtp. Svi. Smu. Sth. Art. Bsu. Eco. Lxy. : Ámpullarella species ATCC31351 * Streptomyces violaceoruber LMG 7183 : Streptomyces murinus s Streptomyces thermovulgaris DSM s Arthrobacter species : Baoillus subtilus s Escherichia coli : Lactobacillus xylosus 0 alinhamento da estrutura secundária foi fedi ta na estrutura de Aotinoplanus missouriensis. As hélices no cor po são envolvidas por linhas a cheio. As bandas β estão nas caixas a sombreado. A Figura 3 mostra o perfil de pH-actividade da glicose isomerase na presença de 2Q0mM de xilose e lOmM de magnésio (quadrados) e lmM de manganês (círculos). A Figura h mostra o esquema reaceional para a isomerização catalisada por glicose isomerase na presença de iSes metálicos. E = enzima, S = substrato, M « ião metálico, P = produto. A Figura 5 mostra a dependência do pH da reacção da glicose isomerase com xilose e Mg quando observada para experiências de estado estacionário, K^, e são constantes de equilíbrio explicadas no texto e nos esquemas de reacção dados na Figura h, A Figura 6 mostra o perfil de pH-actividade para os mutantes K29Í® e IC29^0 na presença de 200 mM de xilose e 100 mM de magnésio. A Figura 7 mostra os perfis de pH-actividade para E186Q e E186D na presença

de 200 mM de xilose e 10 mM de A Figura 8 mostra os perfis de pH-actividade 24· para E186D e E186Q na presença de 200 mM de xilose 1 mM de Mn . A Figura 9 mostra o perfil de pH-actividade • do mutante D255N na presença de 200 mM de xilose e 1 mM de man-. ganes. 11 *

_ As Figuras 10 a 20 mostram os perfis normali zados de pH-actividade para os seguintes mutantesí F254K (Fig. 10), F94R (Fig. 11), FÓ1K (Fig. 12), A25K (Fig, 13), D57N (Fig. 14), L258K (Fig. 15), Q204K (Fig. l6), R23Q (Fig. 1?), H5^N (Fig. 18), H290N (Fig. 19), T95D (Fig. 20).

As condições são mencionadas nas Figuras. A Figura 21 mostra o perfil de pH-actividade normalizado para o mutante F61KK253&· As condiçSes são mencionadas na Figura.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção descreve a modificação das enzimas para melhorar a sua aplicação industrial. A invenção faz uso de técnicas de ADN recombinante. Essas técnicas proporcionam uma grande ferramenta para sè obterem as substituições de aminoácidos pretendidas na proteína de escolha. Dada a quanti dade virtualmente ilimitada de substituições de aminoácidos possíveis I preferível utilizar uma técnica selectiva. A presente técnica baseia-se na aplicação bem coordenada de cristalografia de proteínas, modelação molecular e processos de computação, en-zimologia e cinética, biologia molecular e técnicas de químicas de proteínas. As estratégias para a identificação das mutações pretendidas são inovadoras no sentido de ser reconhecido que as mutações pontuais raramente provocam apenas perturbações locais. As mutações afectam geralmente várias propriedades diferentes da proteína de uma vez sé. Assim, embora as estratégias referidas façam uso de relação estrutura-função bem estabelecidas, elas também proporcionam uma via racional para evitar ou corrigir alterações indesejadas de propriedades secundárias. A investigação bioquímica extensa nos mutantes concebidos resulta na identificação de mutantes com propriedades superiores.

Por "propriedades superiores" tal como aqui utilizado em ligação com as presentes enzimas de glicose isome-rase pretende-ne significar enzimas em que a região ácida do per , fil de pH-actividade é desviado para um pH mais ácido optimo em * 12

relação às enzimas de tipo natural correspondentes.

Foi estabelecido que o perfil de pH-activida-de da glicose isomerase de tipo natural revela uma diminuição na actividade a um valor de pH ácido inferior a 7»0 © a um valor de pH alcalino acima de pH 8,0 (Exemplo 1 - Figura 3)· Tal como aci ma referido seria preferível utilizar glicose isomerase a um valor de pH inferior.

Foi verificado com surpresa que a queda na actividade do lado ácido do perfil de pH-actividade I provocadp pela protonação de uma ou mais cadeias de aminoácidos, que estão directamente envolvidas na coordenação catião do metálico ca talítico da glicose isomerase. Isto foi deduzido do facto de as constantes de associação aparente para a ligação metálica, deter minadas por cinética de estado estacionário, revelarem uma depen dência de pH semelhante (Exemplo 1 - Figura 5)· Isto pode ser descrito pelo seguinte modelos

K sítio ass . t,. ,, 2-r —A sxtxosMg

PK 1 sítioíH* em que "sítio" refere-se ao sítio de ligação geométrica constituído pelos diferentes ligantes (ionizáveis). A enzima é apenas actxva quando o sítio é ocupado por um ião Mg , que por sua vez, se pode apenas ligar ao sítio de ligação metálica não pro-tonada ("sítio") e não ao protonado ("sítio:H*'n). A protonação dependente de pH do sítio de ligação metálica é caracterizado pelo valor de pK , enquanto que a ligação metálica ao sítio não protonado é caracterizado pela constante de associação K . A constante de associação aparente para a ligação metálica é função do verdadeiro valor de E , do valor de pK e do valor de SIS S St pH e pode ser descrito da forma seguinte: K aparente « K (1 * ^QpKa~pH)^-l ass ass ' ' A velocidade da reacção é proporcional à * 13 -

2* ass fracção das moléculas de enzima que estão complexadas com Mg' Esta fracção aumenta para valores maxs elevados de Mg aparente.

Embora o presente modelo tenha sido descrito após uma observação feita em glicose isomerase, e óbvio que este modelo, e o processo descrito a partir dele, pode ser utilizado para metaloenzimas em geral, desde que a desactivação para valores de pH baixos seja devida à dissociação dos iSes metálicos. A queda na actividade observada a um valor de pH alcalino á devida a uma diminuição na velocidade máxima (V máx), reflectindo a despro tonação de um resíduo de aminoáci-dos que é essencial para o mecanismo catalítico. A partir do modelo acima descrito, que pode ser utilizado para explicar a diminuição na actividade no lado acídico do perfil de pH-actividade, pode ser deduzido que, para aumentar a actividade da glicose isomerase para valores de pH inferiores, K tem de ser aumentado e/ou o valor de pKa tem de ser diminuído.

Assim, numa reálização da invenção, as sequen cias de ADN codificando para metaloenzimas como por exemplo glicose isomerases sofrem mutação de forma a que as proteínas mutan tes revelem uma alteração no perfil de pH-actividade como resultado no valor de pKa das cadeias de aminoácidos naturais que ac-tuam como ligantes na ligação metálica.

Desvio no perfil de pH-actividade de metaloenzimas para valores de pH inferiores, por alteração do valor de pKa de cadeias late»· rais de aminoácidos

Para alterar os valores de pK& dos ligantes de coordenação metálica para um valor de pH mais ácido, têm de ser introduzidos resíduos que aumentam a carga positiva global em torno do sítio de ligação metálica das metaloenzimas. Consequentemente, a dependência de pH da actividade de metaloenzimas, para a qual a actividade do lado acídico do pH óptimo, I dependente do valor de pK^ da ligação metálica, alterar-se-á de for-1 ma adequada. Esta alteração de carga estabilizará a carga negati = 14“

va dos grupos ionizáveis que são responsáveis pela dependência de pH da ligação metálica através de efeitos electroestáticos a longa distancia.

De acordo com uma realização preferida o dejs vio no perfil de pH-actividade da glicose isomerase para um valor de pH mais acídico é conseguido por aumento de carga positiva global em torno do sítio activo da glicose isomerase. X volta do pH neutro pode ser obtido um aumento líquido na carga positiva por: - substituição de um resíduo de carga negativa (Asp ou Glu) por um neutro -substituição de um resíduo neutro por um carregado positivamente (Arg ou Lys) - substituição de um resíduo carregado negativamente por um resíduo carregado positivamente.

Para a selecção dos resíduos, que são adequados para sofrerem a mutação, podem ser considerados os seguintes critérios: I. Escolha das posições em que a substituição conduzirá a um aumento líquido na carga positiva dentro de um raio de 15 Angstroms em torno dos resíduos alvo. Os resíduos alvo são os grupos ionizáveis que estão envolvidos na coordenação do catião.

Eliminar desta escolha: - Todas as posições que já contêm uma carga positiva: arginina ou lisina· - Todas as posições que não podem conter uma arginina ou uma lisina dado que estes resíduos conduziam a forças de Van der Waals inadmissíveis que se sobrepõem aos átomos do esqueleto de proteína. - Todas as posições para as quais uma arginina ou uma lisina necessitariam de uma grande adaptação de posições adicionais no ambiente directo de modo a evitar a sobreposição de Van der Waals. = 15 =

tuição em arginina ou lisina conduziria a uma carga escondida não compensada no agregado hidrofébico, - Todas as posições para as quais os resíduos não devem ser substituídos dado que estão envolvidos em arranjos estruturais típicos como por exemplos pontes salinas, empacotamento de hélices, estabilização de hélices por manutenção de uma carga negativa no início de uma hélice, iniciação de hélices, por exemplo prolinas no início de uma hélice, ângulos Pi- psi que estão fora das regiões permitidas para o resíduo que se pretende inserir. IX. Numa realização preferida os seguintes amino- ácidos são também eliminados da escolhas - Todos os resíduos que estão implicados na catálise, ligação de cofactor (como por exemplo iões metálicos e nucleótidos). - Todas as posições que parecem ser estritamente conservadas entre enzimas homologas (se disponíveis). IIIi Posteriormente pode ser atribuída uma priori dade a cada sítio de mutação possível. Isto é feito por inspec-ção do ambiente estrutural do resíduo, a distância para os resíduos ••alvo", o padrão da ligação de hidrogénio em que o resíduo do referido sítio está envolvido e a acessibilidade do solvente.

Para evitar mascarar as xnteracções electros-táticas por contra-iões, é de preferir a introdução de cargas nos sítios que podem ser blindados dos resíduos alvo pelo solvente. Assim em geral, devido à diferença entre as propriedades dieléctricas entre a proteína e o solvente, as cargas, que não podem ser completamente solvatadas devido ao facto de elas estarem escondidas em cavidades na superfície de proteína, são mais prováveis de provocar efeitos do que as cargas que são completa-mente solvatadas. Além disso, no caso da glicose isomerase, a conversão de glicose para frutose é efectuada a uma força iéni-ca baixa, e portanto, a blindagem por contra iões deve interferir menos seriamente com a nova interacção carga-carga concebi- = l6 =

da na glicose isomerase descrita na realização da invenção.

Os critérios para a atribuição de baixa prioridade para os sítios acima escolhidos, quando se substitui uma carga positiva são: - A introdução de uma carga positiva e/ou eliminação de uma carga negativa afectará a integridade da estrutura quaternária. - 0 sítio I completamente acessível aos solventes de forma a que a carga introduzida deve ser blindada dos resíduos alvos pelo solvente, o que diminuirá portanto o efeito no valor de pK dos resíduos alvos. 21

Do mesmo modo, aumentando a carga negativa global em torno do sítio de ligação metálica desviará o valor de ρΚ& para valores de pH mais básicos.

Desvio do perfil de pH-actividade das metaloenzimas para valo- res de pH inferiores, por aumento do valor de K para a liga-

ctSS ção metálica

Noutra realização preferida da presente invenção o desvio do perfil pH-actividade para um valor de pH inferior é conseguido por aumento do valor de K .

aS S 0 desvio do perfil de pH-actividade das metaloenzimas para um valor de pH mais ácido pode ser conseguido por aumento da constante de associação para a ligação metálica. A constante de associação para a ligação metálica pode ser aumentada por optimização da coordenação dos metais pelos ligan-tes. Isto pode ser efectuado por meio da introdução de melhores ligantes ou por introdução de mais ligantes. As interacções electrostáticas podem contribuir para a constante de associação para a ligação metálica em distâncias muito maiores.

Noutra realização preferida a zona ácida do perfil de pH-actividade da glicose isomerase é desviada para va lores de pH inferiores por aumento da constante de associação para aligação metálica. A glicose isomerase liga-se a dois iSes de = 17 =

magnésio por subunidade, resultando na ligação de 8 catiões por tetramero, aumentando assim a carga total de -M6 (ver Figura l) Ambos os sítios de ligação estão localizados no terminal C do corpo. Os sítios de ligação "Inferiores” estão localizados bastante profundamente no corpo e, no complexo de xilitol, liga d^ rectamente 2 oxigénios do inibidor. 0 segundo sítio de ligação ("Superior”) está localizado próximo do terminal do corpo-β próximo da cavidade do sítio activo e da interface da subunida-de.

Em geral, quando um ião positivamente carregado se liga a uma segunda partícula, as constantes de velocidade de associação e de dissociação bem como a constante de afinidade do equilíbrio global dependem da carga da segunda partícula. Ocorre uma repulsão quando a partícula está também positi vamente carregada e ocorre uma atracção entre cargas opostas. Para pequenos iões, e em certos casos também para proteínas, es te efeito pode ser quantificado pelo estudo da dependência da força iónica da velocidade de reacção. A velocidade de associação de iões com carga contrária diminuirá com o aumento da for ça iónica, e a velocidade de associação dás mesmas cargas aumen tará com o aumento da força iónica, e quando uma das partículas não estiver carregada não existe efeito da força iónica. A afinidade da glicose isomerase para o magnésio diminui com o aumento da força iónica o que é consistente com uma carga negativa global do sítio de ligação da glicose isomerase, A ligação do catião pode ser alterada pela introdução de aminoácidos carregados à superfície das proteínas ao lon go da trajectória do catião após entrada no sítio activo. Mais especificamente, esta invenção refere-se à utilização de forças electrostáticas para alterar a constante de velocidade de associação do catião. A glicose isomerase pode ser concebida de for ma a aumentar a velocidade de associação para o catião por adição de carga negativa (ou eliminação da carga positiva) próxima do canal do sítio activo, ou diminuindo a velocidade de associa ção para o catião por adição de carga negativa (ou eliminação da carga negativa) próxima do canal do sítio activo. Dado que o « 18 = desvio da velocidade não deve ser bastante afactado, um desvio na velocidade resultará numa alteração da constante de associação global do catião. Dado que as regiões em anel situadas nos terminais C do corpo formam a entrada do sítio activo, os sítios de mutação possíveis são encontrados nestas regiões. Para evitar uma possível interferência com a estabilidade do corpo, as substituições nas ^-bandas ou «{-hélices não serão consideradas. Pode ser utilizada a seguinte regras - Escolher todos os resíduos na região entre os terminais G das β-bandas e os terminais N das «(-hélices. - Rejeitar de consideração posterior todos os resíduos em que a substituição conduz a uma diminuição da carga positiva líquida numa esfera com o raio de 15 Angstrons à volta dos ligantes metálicos. A introdução de cargas negativas muito próximas do sítio de ligação metálica desviará o valor de pK& dos ligantes metálicos para um valor de pH superior, o que cancelará o efeito de aumentar de K para valores de pH inferiores. - Calcular para cada um dos resíduos restantes a sua área superficial acessível no contexto da proteína e utilizar uma sonda com o raio de 1,4 X. Rejeitar os resíduos que estão escondidos no sentido de que têm menos área superfi- . ®2 ciai acessxvel de 10 A ,

INFORMAÇÃO ESTRUTURAL A informação na estrutura tridimensional da enzima (ou complexo de enzimas substrato ou enzimas inibidor) não tem muita importância para se poderem fazer previsões sobre as mutações que podem ser introduzidas.

Foram referidos os dados estruturais para a glicose isomerase de Streptomyces rubiginosus (Carrell e col, J. Biol. Ghem, 259 (198¾) 3230-3236)} Carrell e col, Psjoc.

Natl, Acad. Sei USA 86, (1989) 440-4444) Streptomyces olivoch.ro mogenus (Farber e col, Protein Eng. 1, (1987) 467-4755 Farber e col. Biochemistry 28 ¢1987) 7289-7297), Arthrobaoter (Hendrick e col., J, Mol. Biol» 208 (1989) 127-157) e Streptomyces albus

2h7, 1-8). (Dauter e col. FEBS Lett.

Embora nem todos os dados sobre sequências de aminoácidos estejam disponíveis para estas enzimas a homolo-gia estrutural tridimensional com glicose isomerase de Actinoplanes missouriensis é surpreendente (ver F. Rey e col., Pro-teins 4 (1988) 165-172). Para mostrar a aplicação geral do processo referido nesta especificação os genes para a glicose isomerase originários de várias espécies foram clonados e sequen-ciados* As sequências de aminoácidos de glicose isomerases tal como deduzidas dos genes de Streptomvces violaceoruber. Strep-tomyces murinus. Arthrobacter spec. e Streptomvces thermovulgaris são homologas. As sequências de aminoácidos publicadas para as glicose isomerases de Ampullariella sp. (Saari, ibid») e Streptomvces violaceoniger (Nucl. Acids Res. 16 (1988) 9337)» deduzidas das sequências de nucleótidos dos genes respectivos, revelam uma homologia próxima de glicose isomerase de Actino-planes missouriensis. Além disso, o documento ¥089/01520 refere que a sequência de aminoácidos de glicose isomerase de Streptomvces rubiginosus é homóloga a glicose isomerase Ampullariella sp.

Apesar da ausência de dados estruturais tridimensionais para a maior parte das glicose isomerases, pode concluir-se que todas as glicose isomerases de Actinomvcetales têm uma organização tetramérica semelhante.

Em geral» pode considerar-se que quando a homologia global é superior a 65$» de preferência superior a 7kfo, (homologia mínima entre glicose isomerases de Actinoplanes missouriensis e Spreptomyces. de acordo com a Amore e Hollen-berg, Nucl. Acids Res. 1£ 7515 (1989))» e mais preferivelmente superior a 85$ e quando a estrutura tridimensional é semelhante, as substituições de aminoácidos conduziram a alterações semelhantes no pH óptimo. Especificamente é de esperar que as gli cose isomerases das espécies que pertencem à ordem de Actinomy-cetales como tendo um elevado grau de semelhança que as alterações do pH óptimo devidas às substituições de aminoácidos nos • sítios escolhidos são semelhantes. A Actinoplanes missouriensis 20 -

é a fonte preferida de glicose isomerase para sofrer a mutação. A Figura 1 mostra a representação esquemática do sítio activo de isomerase glicose de Aotinoplanes mis-souriensis. A Figura 2 mostra as sequências alinhadas de aminoácidos de várias glicose isomerases.

Na presente especificação é utilizado o código de uma letra para os aminoácidos (ver por exemplo e.g» Stryer, L. Biochemistry, p.13, 2» ed, ¥.H. Freeman and Comp., NY, 1981).

PARIE EXPERIMENTAL

Clonação e expressão do gene de D-glicose isomerase Á D-glicose isomerase (GI) é usada sinonima-mente para a D-x±lose isomerase ((D -xilose) cetol-isomerase, BC 5.3.1.5)» uma enzima que converte a D-xilose em D-xilulose. A D-glicose isomerase de Actlnoplanes missouriensis produzida por estirpes de B« coli processadas e designadas como EcoAmi (DSM) GI. Para distinguir o gene de Actinoplanes missouriensis que codifica para GI do análogo do gene de B. coli xylA. o primeiro será designado como GI.

Os processos para a manipulação de moléculas de ADN são descritas em Maniatis e col. (1982, Cold Sprong Harbor Laboratory) e Ausubel e col. (1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. New York). A deter minação das sequências de clonação e de ADN do gene de glicose isomerase de Actinoplanes missouriensis DSM 430^6 é descrita em EP-A-O35IO29O. A sequência de aminoácidos derivada de GI é numerada e comparada com outras glicose isomerases na Figura 2. A seguir, a numeração de aminoácidos refere-se à Figura 2,

As enzimas GI de tipo natural e mutantes foram produzidas em B. coli estirpe K^lk cultivada da formacbs-crita em EP-A-0351029· 21 ** * •f

Avaliação da actividade enzimática do produto de expressão» A actividade enzimática da glicose isomerase foi avaliada da forma descrita a seguir (l unidade de actividade enzimática produz 1,0 micromoles do produto D-xilulose ou D« -frutose por minuto; portanto, a actividade específica -spa- é expressa em unidades por mg de enzimas «) .

A actividade de GI pode ser determinada di-reotamente por medida do aumento na absorvência a 278 nm da xi-lulose produzida a 35° 0 por isomerização da xilose por glicose isomerases. Esta determinação foi efectuada em tampão de trie-tanolamina 50 mM, pH 7»5» contendo 10 mM de MgSO^, na presença de 0,1 M de xilose. A concentração final da glicose isomera-se no ensaio era de * 0,01 mg/ml, e foi determinada com precisão, antes da diluição na mistura de ensaio enzimático, por es-pectroscopia de absorção utilizando um coeficiente de extinção de 1,08 a 278 nm para uma solução de enzima de 1,0 mg/ml. Â actividade específica foi determinada no ensaio Acoplado de D-sorbitol Desidrogenase. determinação enzimática de D-xilulose foi efectuado a 35° C como anteriormente descrito (Kersters-Hilderson e col., Enzyme Microb. Technol. 2 (19S7) 1^5) em 50 mM de trietanolamina, pH 7»5» 10 mM de «»õ

MgSO^, e 0,1 M de xilose na presença de + 2 x 10~ M de D-sor-bitol desidrogenase (L-iditol : NAD oxidoredutase» EC 1.1.14), e 0,15nM de NADH, com a excepção de o tampão de incubação também incluir ImM de ácido etilenobis(oxietilenonitrilo) tetraacé tico (EGTA). A concentração final de glicose isomerase nesse

O ensaio era + 2,5 x 10“ . mg/ml, e determinada com precisão da forma acima descrita.

Utilizando a glicose como substrato a actividade GI pode ser avaliada por medida da D-frutose produzida durante a reacção de isomerização utilizando o processo de eis-teína-carbazole (CCM) que é baseado na reacção dos ceto açúcares com carbazole em ácidos para se obter um produto de cor pui púrea (Dische e Borenfreund, J. Biol. Chem. 192 (l95l) 583).

22 «

EXEMPLO 1

Dependência do pH da actividade da glicose isomerase

Para determinar o perfil de pH-actividade da glicose isomerase de tipo natural e mutante, foi medida a actividade em função do pH (5»2-8,o) na presença de lOníM de MgSO^ e 200 mM de xilose (utilizando o método de ensaio direc-to). Para os mutantes com actividade muito baixa foi utilizado o ensaio acoplado de sorbitol desidrogenase cora pH entre 5f8 e 8,4. Foi tido o cuidado de a reacção de sorbitol desidrogena se não se tornar limitadora da velocidade para valores de pH extremos. 0 perfil de pH-actividade da glicose isomerase (isto é a enzima recombinante de tipo natural de Actino-planes missouriensis na presença de 200 mM de xilose e diferentes catiSes activantes é representado na Figura 3. Ele revela uma diminuição na actividade a um valor do pH ácido inferior a 7,0 e a um valor do pH alcalino inferior a 8,0. 0 mecanismo cinético de estado estacionário adequado para a glicose isomerase envolve a rápida formação de um complexo de enzima-metal-açúcar que é convertido no produto numa fase de limitação de velocidade (o designado mecanismo de equilíbrio rápido, de ordem aleatória - ver Figura 4)* As medidas de fluorescência cinética de equilíbrio e transiente (caudal parado) indicam a presença de dois sítios de ligação de iães metálicos. Na experiência de caudal parado os iSes metálicos ligam-se consecutivamente. 0 metal de elevada afinidade joga um papel na manutenção de uma conformação activa e é assin designada de sítio "de conformação", 0 segundo sítio de ligação de metais acomoda o catião de activação, portanto este sítio é habitualmente indicado como o sítio "catalítico". 0 esquema de reacção que se mostra na Figura 4 parece ser adequado para analisar e comparar experiências de estado estacionário e de caudal parado. Em princípio os resultados do estado estacionário não distinguem entre os dois sítios de ligação de metais, \ mas admite-se que o efeito principal vem da ligação metálica * 23 s catalítica. A análise da velocidade inicial (v) da conversão da xilose em função das concentrações de xilose e de magnésio permite determinar quatro parâmetrosí a velocidade máxima, as constantes de equilíbrio para a ligação de magnésio à enzima livre (K^)| o complexo de enzima-açúcar (K^), e as constantes de equilíbrio da ligação de xilose à enzima livre (K^) e complexo de enzima-magnésio (K^), V , max = 1 + 1 4. 1K3*z ã/ V 3 KgSiK^^s em que DO - DJ representam a concentração do ião metálico e da xilose respectivamente.

Por variação sistemática das concentrações do ião de magnésio e da xilose foi possível obter valores para a velocidade máxima e para todas as quatro constantes de equilíbrio. A Figura 5 mostra a dependência do pH destes parâmetros. A comparação dos resultados das Figuras 3 e 5, mostra que a parte ácida do perfil de pH é completamente determinada pela ligação de ião metálico.

Dos dados apresentados na Figura 5 não são suficientemente precisos para se poder calcular o número de ionizações envolvidas. 0 declive das curvas de log ^ em função de pH (declive > l) indica contudo, que mais do que tuna ionização pode estar envolvida, A semelhança na dependência do pH de e indica que os mesmos grupos de ionização são importantes para ambos os processos (envolvendo 0 mesmo sítio). EXEMPLO 2

Selecoão dos resíduos de aminoácido na glicose isomerase em que a substituição altera os valores de dos aminoácidos ionizá-veiafi de ligação metálica

No caso da glicose isomerase, os critérios para a selecção das posições possíveis para a substituição, tal • como referido na descrição detalhada desta invenção, foram apli-

cados utilizando as sequências alinhadas de diferentes fontes (Figura 2) e a estrutura altamente refinada de Actinoplanes « missouriensis glicose isomerase no complexo com o inibidor xi- litol (ver Figura 1 e "Informação Estrutural", na "Descrição detalhada da invenção"). A estrutura altamente refinada com uma o resolução de 2,2 Ángtroms revela a posição do inibidor e dos dois sítios de ligação metálica. $ apresentada na Figura 1 uma representação esquemática do ponto activo da glicose isomerase de Actinoplanes missouriensis« A partir da estrutura de glicose isomerase complexada com cobalto e xilitol foram escolhidos os resíduos em que a substituição num resíduo de aminoácido mais positivamente carregado conduz a um aumento líquido na carga positiva dentro de um raio de 15 Ingstroms em volta dos grupos ionizáveis. No caso de glicose isomerase os alvos são os grupos ionizáveis que estão envolvidos na doordenação dos iães metálicos necessários para a actividade. Estes grupos ionizáveis alvo implicam os grupos carboxilo de Glul8l, Glu217, Asp245» Asp255» Asp292 e o NE de His220.

Após aplicação do critério I, foram retidas 80 pontos de mutação possível. Estes pontos são apresentados re sumidamente em seguidas

Ala5, Phell, Leul5, Trp20, Gln21, Ala25, Phe26, Asp28, Ala29, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe53, His54» Asp56, Asp57, Phe6l,

Ile85, Met88, Phe94, Thr95, Phel04, Glnl22, Thrl33, Leul34, Vall33, Alai43, Tyrl4-5, Tyrl58, Asnl63, Serlé9» GlulSl, Asnl85, Glul86, Glyl89, Ilel91, Prol94, Hisl98, Gln204, Leu211, Phe212, Asn215, Glu2l7, Thr2l8, His220, Glu221,

Gln222, Ser224, Leu236, His238, Asp255, Gln25ó, Leu271, Tyr285, Glu299, Trp305,

Asn225, His243* AsP257, Asp286, Ala310,

Leu226, Asp245» Leu258, His290, Met3l4,

Phe228, Asn247, Val259, Asp292, Val380,

Thr229, His250, Phe260,Tyr293, Asn383.

Gly231, Phe254, His2Ó2, Thr298,

Após desprezar os resíduos catalíticos e os resíduos estritamente conservados (critério II) ficam os seguin tes 62 resíduos. - 25 =

Ala5,

Leul5»

Gln21,

Ala25, Phe26, Asp28, Ala29, Gly47, Tyr49,

Thr52, Àsp56, Phe6l, Ile85, Met88, Thr95, Phel04, Glnl22, Thrl33, Leul34, Alai43 , Tyrl45, Tyrl58, Asnl63, Serl69, Asnl85, Glyl89, Ilel91| Prol94, Hisl98, Gln204, Leu211, Phe212, Thr2l8, Gln222, Ser224, Asn225, Leu226, Phe228, Thr229, Gly231, Leu236, His238, His243, His250, Phe254, Gln256, Asp257, Leu258, Val259, His262, Leu271, Tyr285» Asp286, His290, Tyr293, Thr298, Glu299, Trp305, Ala310,

Met3l4, Val380, Asn383.

Posteriormente foi atribuída uma prioridade a cada um destes 62 pontos de mutação possível de acordo com o critério IIX. Os 24 sítios seguintes foram atribuídos como tendo uma probabilidade inferior para a mutagénese; Ala25» Gly47, Tyr49, Thr52, Phe6l, Xle85, Thr95, Glnl22, Thrl33, Tyrl45, Tyrl58, Glyl89, Ilel91, Gln204, Thr2l8, Gln222, Leu226, Thr229, Gly23l, Leu236, Gln256, Leu238, Tyr293 e Val380. A mutação de um ou vários dos 80 resíduos de aminoácidos seleccionados em resíduos positivamente carregados resultará numa diminuição do valor de PK& da ligação metálica da glicose isomerase. Isto pode resultar num deslocamento correspondente do perfil de pH-actividade na direcção de valores de pH mais baixos1

Correspondentemente, a mutação de qualquer um ou vários dos 80 resíduos de aminoácidos seleccionados em re síduos negativamente carregados resultará num aumento do valor de pK& da ligação metálica da glicose isomerase. Isso pode resultar num desvio correspondente do perfil de pH-actividade na direcção de valores de pH superiores. EXEMPLO 3

Efeito da mutação de Lys 294 no perfil de pH-actividade

Na posição 294 da glucose isomerase está o localizada uma carga positiva, a cerca de 8 Angstrons do ponto de ligação metálica mais ocupado do complexo de glicose isome-rase-xilitol (395 na Figura l)» Foi feita uma mutação neste pon • to, substituindo a lisina por arginina. Esta mutação conserva 1 26 as

a carga positiva na posição 29k» Consistindo com esta conservação da carga positiva é a observação de que o perfil de pH-ac-tividade deste mutante I semelhante ao da enzima de tipo natural .

Contudo, quando na posição 2$k a carga positiva é removida por substituição da lisina 2$k por uma gluta-mina é observado um desvio do perfil de pH-actividade na direc-ção do ponto alcalino de aproximadamente 0,5 unidades de pH. Os perfis de pH-actividade para K29^R e K29^-Q são ápresentados na Figura 6,

Este exemplo ilustra que é possível manipular o valor de pK de um ou mais grupos funcionais, no ponto ac tivo da glicose isomerase, por alteração da carga líquida da proteína em tomo do sítio activo. EXEMPLO k

Efeito de Glul86 mutante e substituição dos iões de magnésio por iSes de manganês no perfil de pH-actividade

No E186Q mutante uma carga negativa é substituída por uma neutra o que dá origem a um aumento líquido na θ carga positiva dentro de um raio de 15 Angstrons em torno dos ligantes metálicos. 0 perfil de pH-actividade do mutante E186Q na presença do magnésio é representado na Figura 7. A parte alcalina da curva de pH I desviada significativamente na direcção do pH inferior. Na presença de manganês do lugar de magnésio a curva de pH-actividade de E186Q é desviada para um valor de pH inferior e no seu valor de pH optimo a sua actividade é superior do que para o tipo natural (Figura 8).

Para as aplicações em iões diferentes de magnésio podem ser utilizados a combinação de B186Q com manganês a um valor baixo de pH é uma opção interessante.

Foi também efectuada a mutação de E186D que é conservativa em relação à carga. 0 perfil de pH-activida-de deste mutante é representado nas Figuras 7 ® 8» Δ dependência do pH da actividade para a mutante E186D não é significativamente diferente da correspondente à enzima de tipo natural. — 27 — i

A remoção da carga negativa na posição 186 desviou a curva de pH-actividade para um valor de pH mais ácido. Este exemplo revela que ocorre a mutação de E186Q. EXEMPLO 5

Efeito da substituição de Asp255 no perfil de pH-actividade

A substituição do ácido aspártico oom carga negativa na posição 255t que I de facto um ligante de ligação metálica na glicose isomerase por asparagina neutra» dá origem a um desvio do perfil de pH-actividade na direcção de PH inferior na presença de manganês. Os valores de desvio óptimo colocam-se de cerca de duas unidades de pH na direcção de valores de pH ácidos. 0 perfil de pH-actividade é apresentado na

Figura 9· EXEMPLO 6

Glicose isomerases com um perfil de pH-actividade alterado

Os mutantes de glicose isomerase que foram criados de acordo com os processos descritos na descrição detalhada da invenção, foram ensaiadls para determinar a sua relação de pH-actividade em condições que são indicadas nas Figuras (l0-20). 0 perfil de pH-actividade de um mutante ê o resultado do efeito da mutação no valor de pK por um lado, e do efeito 3. de K por outro lado. ass

Os resultados para os mutantes seguintes são dados nas Figurass F254K (Fig.10), F94R (Fig.ll), F6lK (Fig.12), A25K (Fig.13), D57N (Fig.l4) , L258K (Fig.15), Q204k (Fig.16), R23Q (Fig.17),' H54N (Fig.l8), H290N (Fig.19), T95D (Fig.20).

Para os mutantes em que foi introduzida uma carga positiva (F254K, F94R, FélK, A258K, Q204k) ou uma car ga negativa neutralizada (D57N)» pode observar-se que a parte ácida da curva de pH-actividade é desviada na direcção de pH inferior.

Para os mutantes em que foi introduzida ume. a 28 = carga negativa (T95D) ou foi neutralizada uma carga positiva (R23Q, H54N, H290N, pode observar-se que o perfil de pH-activi-dade I desviado na direcçâo dos valores de pH superiores.

Ambas estas observaçSes estão de acordo com o modelo apresentado na descrição detalhada da invenção.

Contudo, deve ser notado que os mutantes em que foi substituído um aminoácido conservado (F94R, D57N» H54N) dão origem a uma grande diminuição na actividade específica da xilose. Na posição 254 no alinhamento de sequências (Fig. 2) apenas são observados os aminoácidos hidrofóbicos. A introdução do aminoácido carregado (F254K) nesta posição também conduz a uma diminuição acentuada na actividade específica. Assim, pode concluir-se que embora as posiçães de aminoácido (semi) - conservadas possam ser utilizadas para alterar as car-gas de modo a modificar o perfil de pH-actividade eles não são os sítios preferido. EXEMPLO 7

Estabilização de mutantes com um valor de pH óptimo para se ob-Φθγ um comportamento em condiçSes de aplicação

Os mutantes H290N e F6lK dão o desvio esperado na curva de pH-actividade da forma descrita no Exemplo 6, De entre estes mutantes foi imobilizado ο H290N da forma descri-· ta em EP-A-351029 (Exemplo 7)· 0 ensaio de aplicação de glicose isomerase de tipo natural e desta mutante foi efectuado da forma descrita no mesmo pedido (Exemplo 8). A estabilidade é indicada pela constante de decaimento de primeira ordem (κ^, e quan to menor for a constante de decaimento mais estável é a enzima), A tabela 2 dá os valores de para o tipo natural e para as glicoses isomerases mutantes.

Tabela 2

Constantes de decaimento para a glucose isomerase de tipo natural e mutante, imobilizadas em Lewatit

Kd (x 10° sec Tipo natural 2.3 H290N 3.1 E253R 0.7 H290NK253R 1.6 FÓ1KK253R IA Como se pode observar na Tabela H290N é desestabilizado quando comparado com a glicose isomera-se de tipo natural. Verificou-se que o K253R estabilizava a gli cose isomerase de tipo natural por um factor superior a 3. O perfil de pH-actividade da mutante K253& ó idêntico ao da enzima de tipo natural, A combinação do pH do H290N mutante com a estabilidade da mutante K253R mostra que os mutantes com pH podem ser estabilizados introduzindo mutações que se verificou estabilizarem a enzima de tipo natural.

Para além disso a Tabela 2 mostra que o F31K mutante com pH é estabilizado em relação à enzima de tipo natural após introdução de K253R. 0 desvio ácido do perfil de pH-actividade de F61K é mantido na dupla mutante (Fig, 2l). Isto mostra que as mutações que melhoram as propriedades diferentes de uma enzima podem ser combinadas numa nova mutante que contem as propriedades superiores das mutações individuais (um valor de pH óptimo superior e uma estabilidade superior neste caso).

Deve ser entendido que os exemplos acima mencionados pretendem demonstrar o conceito da invenção e que não pretendem limitar o seu âmbito. Tendo este facto em conside^ ração I óbvio que as combinações das mutações acima mencionadas com outras mutações que conduzem a caracterxsticas alteradas, por exemplo termoestabilidade, ligação metálica ou especificidade de substrato, são também englobadas pela presente invenção. « 30

Claims (1)

1. - 15 - Processo para a preparação de uma metaloenzima mutante obtida por expressão de um gene que codifica a referida metaloenzima, que difere pelo menos em um amino ácido da enzima natural, em que a enzima exibe um perfil alterado de pH-actividade caracterizado por compreender as seguintes fases: a) obter-se tuna sequência de ADN que codifica tuna metaloenzima mutante, J b) efectuar-se a mutação desta sequência em posiçSes escolhidas de nucleótidos, c) efectuar-se a clonação da sequência que sofreu a mutação para um vector de expressão de modo a que a sequência de ADN possa ser expressada, d) transformar-se um organismo ou célula hospedeiro com o referido vector, e) efectuar-se a cultura do referido organismo hospedeiro, f) isolar-se a metaloenzima mutante. - 25 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter uma metaloenzima mutante em que o perfil alterado de pH-actividade ou pelo menos a sua parte ací-dica é deslocado para um valor de pH inferior. - 3* - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se substituir o resíduo de amino ácido substituído por um resíduo mais positivamente carregado. _ _ Proeesso de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3» caracterizado por a metalo enzima obtida ser a glicose isomerase. = 31 =

   Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se obter uma glicose isomerase mutante a partir de um microorganismo da ordem dos Actinomycetales. - 6& Processo de acordo com a reivindicação 5» caracterizado por se obter uma glicose isomerase mutante a partir de Actinoplanes missouriensis. - 7* - Processo de acordo com as reivindicações 4 a 6, caracterizado por o perfil alterado de pH-actividade ou pelo menos a sua parte acídica ser deslocado para um valor de pH inferior» - 8& - Processo de acordo com as Reivindicações 4 a 7, caracterizado por se obter uma glicose isomerase mutante que tem uma substituição de amino ácidos dentro de uma esfera de 15A em volta dos resíduos alvo. » 9a - Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 4 a 8, caracterizado por se obter uma glicose isomerase mutante em que foi substituído o resíduo de aminoácido substituído por um resíduo mais positivamente carregado. - 10- - Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 4 a 9, caracterizado por se obter uma glicose isomerase mutante em que pelo menos um dos seguintes amino ácidos, ou um amino ácido numa posição correspondente numa glicose isomera se homóloga, é substituído por um amino ácido não encontrado na enzima naturais Ala5, Phell, Leul5, Trp20, Gln21, Ala25» Phe26, Asp28, Ala29, Gly-47, Tyr49, Thr52, Phe53, His54, Asp56, Asp57, Phe6l, Xle85, Met88, Phe94, Thr95, Phel04, Glnl22, Thrl33, LeuX34, Yall35, • Alal43, Tyrl45, Tyrl58, Asnló3, Serló9, Glul8l, Asnl85, Glul86, =* 32 **

   Glyl89, Glu2l7, Thr2l8, Phe228, Thr229, His250, Phe254, His2ô2, Leu271, Glu299, Trp305, Prol94, Hisl98, His220, Glu22l, Gly23l, Leu236, Asp255, Gln256, Tyr285, Asp286, Ala310, Met314, Gln204, Leu211, Gln222, Ser224, His238, His243, Asp257, Leu258, His290, Asp292, Val380, Asn383. Phe2l2, Asn215, Asn225, Leu226, Asp245, Asp.247, Val259, Phe260, Tyr293, Thr298, - 11* - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 9» caracterizado por se obter uma glicose isomerase mutante em que pelo menos um dos seguintes amino ácidos, ou um amino ácido numa posição correspondente numa glicose isomerase homóloga, é substituído por um amino ácido não encontrado na enzima naturais Ala5, Leul5, Gln21, Ala25, Phe26, Asp28, Ala29, Gly47, Tyr49, Thr52, Asp56, Pheôl, Ile85, Met88, Thr95, Phel04, Glnl22, Thrl33, Leul34, Alai43, Tyrl45, Tyrl58, Ásnl63, Serlô9, Asnl85, Glyl89, Ilel91, Prol94, Hisl98, Gln204, Leu211, Phe212, Thr2l8, Gln222, Ser224, Asn225, Leu226, Phe228, Thr229, Gly231, Leu236, His238, His243, His250, Phe254, Gln25Ó, Asp257, Leu258, Val259, His262, Leu271, Tyr285, Asp286, His290, Tyr293, Thr298, Glu299, Trp305, Ala310, Met3l4, Yal380, Asn383. - 125 _ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 9> caracterizado por se obter uma glicose isomerase mutante em que pelo menos um dos seguintes amino ácidos, ou um amino ácido numa posição correspondente numa glicose isomerase homóloga, ó substituído por um amino ácido não encontrado na enzima natural: Ala25, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe6l, Ile85, Thr95, Glnl22, Thrl33, Tyrl45, Tyrl58, Glyl89, Ilel91, Gln204, Thr2l8, Gln222, Leu22é, Thr229, Gly231, Leu236, Gln25é, Leu258, Tyr293 e Val380. - 13§ - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se obter uma glicose isomerase mutante que con * tem pelo menos uma das seguintes substituições de amino ácidos: * 33 = R23Q, Α25Κ, D57N, H54n, F6lK, F94r, T95B, E186D, ei86q, Q2o4k, K253R, F254K, D255N, L258K, H29QN, K294R, K294q. - 14& - Processo para alterar 0 perfil de pH-acti-vidade da glicose isomerase, caracterizado por compreender a substituição de pelo menos um amino ácido por um amino ácido possuindo uma cadeia lateral de carga diferente. - 15§ - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender a substituição de um amino ácido 0 . dentro de uma esfera de 15A em volta dos resxduos alvo, por um amino ácido mais positivamente carregado. - 16§ - Processo para a conversão de moléculas de açúcar caracterizado por se utilizar uma glicose isomerase mu-tante quando preparada de acordo com qualquer das reivindicaçães anteriores. As requerentes reivindicam as prioridades, dos pedidos de patente europeia apresentados em 4 de Janeiro de 1990, sob os nSs. 90200037.1 θ 90200030.6. Lisboa, 3 de Janeiro de 1991· ο ΑΘΕΙΧϋ OFICIAL BA PEOPEEDABE EíBESTMAL

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