BG60869B1 - Метод за получаване на глюкозоизомераза с променен рн-оптимум - Google Patents
Метод за получаване на глюкозоизомераза с променен рн-оптимум Download PDFInfo
- Publication number
- BG60869B1 BG60869B1 BG93586A BG9358691A BG60869B1 BG 60869 B1 BG60869 B1 BG 60869B1 BG 93586 A BG93586 A BG 93586A BG 9358691 A BG9358691 A BG 9358691A BG 60869 B1 BG60869 B1 BG 60869B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- glucose isomerase
- activity
- glucose
- amino acid
- enzyme
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 85
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 abstract description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 abstract description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 57
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 57
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 56
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 38
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 23
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 18
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 14
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 14
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 14
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 14
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 14
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000187843 Actinoplanes missouriensis Species 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 10
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 9
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 9
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 8
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 7
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 7
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 7
- 102220539749 Ubiquitin-like modifier-activating enzyme 5_H290N_mutation Human genes 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 5
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 5
- ZAQJHHRNXZUBTE-WUJLRWPWSA-N D-xylulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102220482963 UHRF1-binding protein 1_H54N_mutation Human genes 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 4
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 4
- 102200060141 rs74315507 Human genes 0.000 description 4
- 241000187844 Actinoplanes Species 0.000 description 3
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 3
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 3
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 241000187177 Streptomyces thermovulgaris Species 0.000 description 3
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 3
- 235000021433 fructose syrup Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 102200057511 rs587779858 Human genes 0.000 description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 3
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 3
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 3
- LONLXRPIYFRSMN-WNQIDUERSA-N (2r)-2-amino-3-sulfanylpropanoic acid;9h-carbazole Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O.C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 LONLXRPIYFRSMN-WNQIDUERSA-N 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000203809 Actinomycetales Species 0.000 description 2
- 241000187712 Actinoplanes sp. Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108010009384 L-Iditol 2-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- -1 Mg 2+ Chemical class 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 102100026974 Sorbitol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 241001468239 Streptomyces murinus Species 0.000 description 2
- 241000187417 Streptomyces rubiginosus Species 0.000 description 2
- 241000187176 Streptomyces violaceoruber Species 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 2
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 2
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 2
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 2
- WNQJZQMIEZWFIN-UHFFFAOYSA-N 1-(benzenesulfonyl)-4-(2-chlorobenzoyl)piperazine Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(=O)N1CCN(S(=O)(=O)C=2C=CC=CC=2)CC1 WNQJZQMIEZWFIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003287 1H-imidazol-4-ylmethyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[*])=C1[H] 0.000 description 1
- OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanedioic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C(N)CCC(O)=O OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 7028-40-2 Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 101100123358 Caenorhabditis elegans his-54 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N D-ribulose 1,5-bisphosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)COP(O)(O)=O YAHZABJORDUQGO-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000194041 Lactococcus lactis subsp. lactis Species 0.000 description 1
- 108010059724 Micrococcal Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010071934 Muconate cycloisomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004020 Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108090000417 Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014969 Streptococcus diacetilactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000187134 Streptomyces olivochromogenes Species 0.000 description 1
- 241000970854 Streptomyces violaceusniger Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007357 dehydrogenase reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005595 deprotonation Effects 0.000 description 1
- 238000010537 deprotonation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000003804 effect on potassium Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002307 glutamic acids Chemical class 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000005442 molecular electronic Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
- C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Методът се използва за подобряване свойствата на металоензими. По него се получават рекомбинантни глюкозоизомерази с променен рн оптимум, позволяващ разграждането на нишесте при ниско рн.
Description
ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА
Настоящото изобретение се отнася до прилагането на протеин-инженерингова технология за подобряване свойствата на металоензими. Предлага се метод за селекциониране на аминокиселини, които след заместване оказват влияние върху кривата на зависимостта pH-активност на металоензимите. Методът се прилага за глюкозоизомераза. Настоящото изобретение предлага също мутантни глюкоизомеразни молекули с променен pH-оптимум. Частта от кривата рНактивност, свързана с киселото pH, е изместена към по-ниски стойности на pH.
Изобретението се отнася и до метод за получаване на рекомбинантни глюкоизомерази, които намират приложение при производството на фруктозни сиропи, по-специално на царевични сиропи с високо съдържание на фруктоза.
При промишлено разграждане на скорбялата ензимите играят важна роля. Ензимът алфа-амилаза се използва за втечняване на скорбялата до декстрин при степен на полимеризиране от 7 до 10. След това се използва ензим алфа-амилоглюкозидаза за озахаряване, при което се получава сироп, съдържащ от 92 до 96 % глюкоза. Обратимата изомеризация на глюкозата до фруктоза се катализира от ензима глюкозо-/или ксилоза/-изомераза. Наименованието на този ензим според номенклатурата на ензимите е D-ксилозо-кетол-изомераза /ЕС 5.3.1.5/ поради предпочитанието на ензима към ксилоза. Но поради главното му приложение при превръщането на глюкоза до фруктоза, обикновено той се нарича глюкоизомераза. Равновесната константа на тази изомеризация е близка до единица, така че при оптимални условия на процеса има около 50 % превръщане на глюкозата. Равновесната смес на глюкоза и фруктоза е известна като сироп с високо съдържание на фруктоза.
Фруктозата е много по-сладка за вкуса на човека, отколкото глюкозата или захарозата, което я прави икономически конкурентна като заместител на захарта.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Голям брой микроорганизми, за които е установено, че продуцират глюкозоизомераза, се използват в промишлеността. Подробен преглед на промишленото използване на глюкоизомераза е направен от Wen-Pin Chen в Process Biochemistry, 15 June/July /1980/ 3041 u August/September (1980) 36-41.
Wen-Pin Chen описва условията за култивиране на микроорганизми, както и методите за получаване и пречистване на ензима. Освен това са обобщени и свойствата на глюкозоизомеразата, като специфичност на субстрата, оптимална температура и оптимално pH, термостабилност и изисквания за метален йон.
Глюкозоизомеразата изисква двувалентен катион като Mg2+, Со2+, Мт2+ или комбинация от тези катиони за нейната каталитична активност. Определянето на 3 D /триизмерните/ структури на различни глюкозоизомерази показва присъствие на два метални йона в мономерната единица (Farber et al., Protein Eng.I (1987) 459-466; Rey et al., Proteins 4 (1987) 165-172; Henrick et al., Protein Eng.I (1987) 467-475).
Независимо от ролята на каталитичния механизъм, се съобщава че двувалентните катиони повишават и термостабилността на някои глюкозоизомерази (М. Callens et al., Enzym Microb. Technol. 1988 (10), 695-700). Освен това, каталитичната активност на глюкозоизомеразата силно се инхибира от Ag+, Hg2+,Cu2+, Zn2+, Са2+.
Глюкозоизомеразите имат обикновено pH-оптимум между 7,0 и 9,0. Има няколко причини, поради които е по-полезно използването на глюкозоизомеразите при ниска рНстойност. Три от тези причини са:
а/ стабилност на захарните молекули, б/ адаптиране към преходните и/или последващите стъпки на процеса и в/ стабилност на ензима, които са описани по-долу за илюстрация, а/ При алкални условия и при повишена температура образуването на оцветени странични продукти и продукцията на неметаболизируема захар /D-псикоза/ представлява проблем. Желаната работна стойност на pH трябва да бъде около 6,0. Около тази стойност на pH разграждането на глюкозата и фрукто зата е минимално.
б/ Понижаване на pH-оптимума е също желателно при глюкозоизомеразата, когато един ензим се използва в комбинация с други ензими или между други ензимни етапи, например при получаването на сироп с високо съдържание на фруктоза. При този процес, един от другите ензимни етапи, озахаряването с алфа-глюкозоамилаза, се осъществява при pH 4,5.
в/ Повечето от известните глюкозоизомерази се прилагат при pH 7,5. Тази рНстойност е компромис между по-висока начална активност при по-високо pH и по-добра стабилност на имобилизирания ензим при пониско pH, в резултат на което се осигурява оптимална продуктивност при избраното pH (R. V. Tilburg, Thesis:”Engineering aspects of Biocatalysts in Industrial Starch Conversion Technology”, Delftse Universitaire Pers, 1983). Използването на глюкомеразата при pH пониско от 7,5 благоприятства по-продължителния полуживот и, комбинирано с подобрената по-висока специфична активност, което води до повишаване продуктивността на имобилизирания ензим при по-ниско pH.
От посоченото може да се заключи, че има нужда от глюкозоизомерази с по-висока активност при по-ниски pH стойности на работните условия.
Голям брой микроорганизми се скринират за глюкозоизомераза с по-нисък pH оптимум. Независимо от многото усилия, този подход не е довел до нови търговски глюкозоизомерази.
С оглед да се промени зависимостта на pH-активност на глюкозоизомеразите към пониско pH чрез технологии за конструиране на белтъци е важно да се знаят ефектите, които причиняват начало на бързо понижаване на каталитичното действие при кисело pH.
Трябва да се имат предвид две различни функции на металните йони при ензимите.
Първо, металните йони могат да играят структурна роля. Това означава, че те са включени при поддържането на Зв-структурата и, поради това, допринасят за термостабилността на ензимната молекула. Пример за такава структурна и стабилизираща роля е Са2+ в групата на субтилизина от сериновите протеинази.
Второ, металните йони могат да действат като кофактор при каталитичния механизъм. В този случай ензимната активност е силно зависима от наличността на металния йон в активния център. Металния йон може например да служи като мост между ензима и субстрата /т.е. Са2+ във фосфолипазите свързва фосфатната група на субстрата/ или може да активира водата, така че да се получи мощен нуклеофилен хидроксилен йон /Zn2+-OH' /.
Примерите са Zn2+ -протеазите като термолизин и карбоксипептидаза, карбоанхидраза (Zn2+), фосфолипаза-А2/Са2+, стафилококова нуклеаза /Са27 и алкална фосфатаза /Mg2+, Са27.
Примери за алфа/бета ензими, които изискват катиони за поляризиране на карбоксилна или карбонилна група с оглед пренасяне на водород са глюкозо/ксилозоизомераза (Mg2*), рибулолозо-1,5-дифосфат карбоксилаза/оксигеназа (RUBISCO) (Mg2+),eHoaa3a (Mg2+), дрождева алдолаза (Mg2+, К1+), мандолат рацемаза (Mg2+), муконат циклоизомераза (Mg2+). В присъствие на метални хелатиращи агенти (EDTA) тези ензими напълно губят своята активност.
Свързването на метални йони в молекулата на протеина включва обикновено координацията на 4 или 6 лиганди. В зависимост от типа метален йон са установени различни лиганди. Например магнезий и калций обикновено образуват лиганди с кислородните атоми от карбонилната група на главната верига на протеина, от карбонилната група на страничната верига на глутаминова или аспарагинова киселина, или от карбоксилната група на страничната верига на аспаргиновата или глутаминовата киселини. Цинковите и медните йони обикновено образуват лиганди чрез азотни атоми от страничната верига на хистидина или серни атоми от цистеина или метионина.
Активността на един ензим зависи от рНстойността на водната среда. Тази зависимост се причинява от /де/протониране на йонизируемите групи в активния център на ензима, от една страна, и йонизируемите групи на субстрата или продукта /при наличие/, от друга страна. Йонизируеми групи в протеините включват страничните вериги на основните аминокиселини лизин, аргинин и хистидин / носещи положителен заряд в протонираща форма/, и киселите аминокиселини аспаргинова киселина, глутаминова киселина, цистеин и ти розин /всичките носещи отрицателен заряд при депротониране/. Освен това, амино групата на N-края и карбоксилната група на С-края са съответно с положителен и отрицателен заряд. рКа-стойностите на някои аминокиселини са посочени в таблица 1.
Таблица 1. Йонизиращи групи на аминокиселини, срещащи се в протеини / Cantor and Schimmel, 1980, Biophsical chemistry, W.H; Freeman, San Fransisco/.
PK
Положителен заряд /основа/
N - край 7,5-8,5
Лизин10,5
Аргинин12,5
Хистидин 6,0-7,0
Отрицателен заряд /киселина/
С - Край 3,0-4,0
Аспаргинова киселина3,9
Глутаминова киселина4,3
Цистеин8,3
Тирозин10,1
Тези рКа-стойности са валидни за моделни съединения и се явяват големи вариации както и между отделните протеини, поради специфичната среда, заобикаляща йонизируемата група. Известно е, че електростатичните ефекти играят основна роля при функцията и структурата на ензимите (J.A. Matthew et al CRC Critical Reviews in Biochemistry, 18 (1985) 91-197). Наличието на положителен заряд близо до йонизируема група ще понижи неговото рКа, докато отрицателен заряд ще причини повишаване рКа. Степента на ефекта намалява с разстоянието между йонизируемата група и заряда. Освен това, степента на това положение зависи и от диелектричната константа на средата. Специално каталитичните остатъци могат да имат рКа-стойности, които се отклоняват от средните (Fersht, Enzyme structure and mechanism, 1985, W.H. Freeman, New York).
pH-зависимостта на една ензим-катализирана реакция може да бъде разделена на рНзависимост на константата на MichaelisK и pHш Г зависимост на оборотната константа ки1 /еквивалентна на v /. Тези параметри представляват свързването на субстрата в основно състояние и преходно състояние. Профилът рНактивност на ензима се определя от зависещата от pH /де/протонизация на страничната верига на аминокиселината, която оказва влияние на свързването на двете форми на субстрата, или която е свързана с каталитичния процес /например отнемане или отдаване на протон както при основната катализа/.
Например, протонирането на хистидина в каталитичната тройка на сериновите протеази /както трипсинова, така и субтилизинова фамилия/ е отговорно за загубата на активност при по ниски pH-стойности /по-малко от 7/. В този случай, рКа на ензимната активност директно се свърза с рКа на хистидиновия остатък.
Като втори пример могат да се споменат двата остатъка на аспарагиновата киселина в аспаргилпротеазите, като пепсин и химозин. Тези групи определят рН-оптимума на тези протеази. Различните рКа-стойности на аспарагиновите киселини, дължащи се на типичното структурно подреждане водят до камбанообразен pH-профил на активност.
Известно е, че промяната на повърхностния заряд чрез екстензивно химично модифициране може да доведе до значителни промени в pH -зависимостта от катализата. В много случаи обаче този подход води до инактивиране и/или до неочаквани структурни промени на ензима, защото тези методи са по-скоро неспецифични. Известно е, че селективното химическо модифициране на лизините в цитохром има ефект върху редокспотенциала (D. С. Rees, J. Mol. Biol. 173, 323326 (1980). Тези резултати са критикувани поради множеството химически реактиви за модифицирането, които може да променят структурата на протеина.
Използвайки 3 D-структурата на един протеин за представяне възможността за структурно преобразуване и сайт-насочена мутагенеза, е възможно да се модифицира разпределението на заряда в протеини по твърде селективен начин.
Fersht и сътрудници посочват, че е възможно да се променя pH-профила на активност на субтилизина чрез сайт-насочена мутагенеза (Thomas et al., Nature, 318, 375-376 (1985); Russell et al., J. Mol. Biol., 193, 803813 (1987); Russell and Fersht, Nature 328, 496500 (1987). Въвеждането на групи c отрицателен заряд на разстояние 10-15 А от активния център на повърхността на протеина повишава рКа-стойността на активния страничен хистидин. Обратно, с повишаване на положителния заряд на повърхността се пони жава рКа на киселите групи. Променяйки Asp99 на 13 А или Glu 156 на 15 А от активния център с лизин, се понижава рКа на активния страничен хистидин с 0,6 pH-единици. Променяйки едновременно двата участъка, за да се получи двоен мутант с промяна на четири зарядни единици, рК, се понижава с 1 рН-единица. Изглежда, че промените в Кулоновите взаимодействия могат да бъдат кумулативни.
В WO 89/01520 (Cetus) са описани известен брой мутеини на ксилозоизомеразата с повишена стабилност, които могат да бъдат получени от Streptomyces rubiginosus. Изборът на възможни сайтове, които могат да бъдат подложени на мутация се основава на критерии, различни от онези използвани в настоящото изобретение. Изброени са повече от 300 мутанта, но не са представени данни относно характеристиките и промените на мутантните ензимни молекули.
Ензими с подобрени свойства могат да се получат или да се открият по различни начини, например чрез класически скринирани методи, чрез химическо модифициране на съществуващи протеини или чрез използване на съвременни генетични и протеинови инженерингови технологии.
Сайт-насочената мутагенеза (SDM) е най-специфичният начин за получаване на модифицирани ензими, позволяващ специфично заместване на една или повече аминокиселини с друга желана аминокиселина.
СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Изобретението предлага нови мутантни металоензими, получени чрез експресия на гени, кодиращи споменатите ензими с аминокиселинни последователности, които се различават най-малко по една аминокиселина от съответния див тип металоензими и които проявяват променени каталитични свойства. Специфично, кривата pH-активност се променя чрез изменение на общата разпределение на заряди около активния център.
В един от предпочитаните варианти за изпълнение на изобретението глюкозоизомеразите се подлагат на мутация.
Друг аспект на изобретението е да се създаде метод за избиране в дивия тип ензим на сайтове, които могат да се използват чрез сайт-насочена мутагенеза с цел промяна на кривата pH-активност.
От друга страна, настоящото изобретение осигурява глюкозоизомерази с по-кисел pH-оптимум в сравнение с този на дивия тип глюкозоизомерази.
Настоящото изобретение описва модификацията на ензимите за подобряване на тяхната промишлена приложимост. Използва се рекомбинантната ДНК-технология. Тази технология осигурява силно оръжие за получаване на желаните аминокиселинни замествания в избрания протеин. Поради фактически неограничения брой възможни аминокиселинни замествания, за предпочитане е да се използва селективен подход. Настоящият подход разчита на добре координираното прилагане на белтъчна кристалография, молекулярно моделиране и електронно изчислителни методи, ензимология и кинетика, молекулярна биология и химични технологии на белтъците. Стратегията за идентифициране на целените мутации е новаторска в смисъл, че се разбира, че точковите мутации рядко причиняват само локални нарушения. Мутациите обикновено засягат едновременно няколко различни свойства на протеина, поради което, въпреки че в описаните стратегии се използват добре установени структурно-функционални отношения, те също предлагат рационалния път за избягване или коригиране на нежелани промени на вторични свойства.
Широкомащабни биохимически изследвания на определени мутанти водят до идентифициране на мутанти с подобрени свойства.
Под “подобрени свойства”, както се използва във връзка с настоящите глюкозоизомеразни ензими, се има предвид ензими, при които частта на кривата pH-активност в киселото pH се измества към по-кисел рН-оптимум по отношение на съответния рН-оптимум на дивия тип ензими.
Установено е, че кривата рН-активност на дивия тип глюкозоизомераза показва понижение на активността при кисело pH под 7,0 и при алкално pH над 8,0 /пример 1-фигура 3/. Както е посочено по-горе, за предпочитане е да се използва глюкозоизомераза при пониско pH.
Установи се, че понижаването на активността в киселата част на зависимостта рНактивност се причинява от протонирането на една или повече странични аминокиселинни вериги, които са директно свързани в коорди нирането на каталитичния метален йон на глюкозоизомеразата. Това произтича от факта, че явните асоциационни константи за свързване на метал, както се определя от кинетиката на стационарното състояние, показва подобна pH-зависимост /пример 1-фигура 5/. Това може да бъде описано чрез следния модел:
К ass
МЯСТО + Mg2 + MHCTOlMg2*
РК място: Н+ в който “място” се отнася до геометричното място на свързване, съставено от различни /способни да бъдат йонизирани/ лиганди. Ензимът е активен само когато мястото е заето от Mg2+ -йон, който от своя страна може да свързва само към непротонирано място за свързване на метал /’’място”/, а не към протонирано такова /’’място: Н+”/. Зависимото от pH протониране място за свързване на метал се характеризира чрез рКа, докато непротонираното място за свързване на метал се характеризира с асоциационна константа Kass. Действителната асоциационна константа на свързването при метал е функция от същинските Кая, рКа, pH и може да се опише както следва:
К ”°=К х /1 + 10»* - pH/-1 ass ass a r
Скоростта на реакцията е пропорционална на частта от ензимни молекули, които са в комплекс с Mg2+. Тази част нараства с по-високото (Mg2+) х Кма
Въпреки че представеният модел е описан след наблюдение върху глюкозоизомераза, е явно, че този модел и методът, изведен от това, могат да се използват за металоензими изобщо при положение, че инактивирането при ниско pH се дължи на дисоциация на металните йони.
Понижаването на активността при алкално pH се дължи на намаляване на максималната скорост (V ), отразяваща депротонирането на аминокиселинен остатък, което е съществено за каталитичния механизъм.
От модела описан по-горе, който може да бъде използван за изясняване понижаването на активността в частта на кривата рНактивност, свързана с киселото pH, може да се изведе така, че с оглед повишаване активността на глюкозоизомеразата при по-ниски рНстойности, да се повиши Kajj и/или да се понижи рКа.
Поради това, в един вариант на изпълнение на изобретението ДНК последователности кодиращи металоензими като глюкозоизомераза, се подлагат на мутагенеза по такъв начин, че мутантните протеини да дават промяна в кривата pH-активност като резултат от промяната на рКа на страничните аминокиселинни вериги действащи като лиганди при свързването на метални йони.
С оглед изместване на рКа на металкоординиращите лиганди към по-кисело pH, трябва да се въведат остатъци, които повишават общия положителен заряд около мястото за свързване на металния йон на металоензимите. Следователно, зависимостта на активността на металоензимите от pH, за които активността в киселата част на pH-оптимума се причинява от рКа на свързването на метален йон, се изменя съответно. Тази промяна на заряда стабилизира отрицателния заряд на йонизируемите групи, които са отговорни за зависимостта на свързването на метален йон от pH посредством широк обхват електростатични ефекти.
Според предпочитания вариант на изпълнение изместването на кривата рН-активност на глюкозоизомеразата към по-кисело pH се постига чрез повишаване на общия положителен заряд около активния център на глюкозоизомеразата.
Около неутралното pH може да се получи явно нарастване на положителния заряд чрез:
-заместване на отрицателно зареден остатък (Asp или Glu) с неутрален,
-заместване на неутрален остатък с положително зареден такъв (Arg или Lys),
-заместване на отрицателно зареден остатък с положителен такъв.
При избора на остатъци, подходящи да бъдат подложени на мутагенеза, могат да бъдат формулирани следните критерии:
I/ Да се подбират позиции, при които заместването ще доведе до явно нарастване на положителния заряд в радиус от 15 А около остатъка от мишената. Остатъците от мишени са йонизируемите групи, които са включени в координирането на катиона.
От тази група се елиминират:
-всички позиции, които вече съдържат положителен заряд: аргинин или лизин,
-всички позиции, в които не могат да се подслонят аргинин или лизин, защото тези остатъци биха довели до недопустимо застъпване на силите на Ван дер Ваалс с атомите от скелета на протеина,
-всички позиции, в които аргинин или лизин биха изисквали екстензивно адаптиране на допълнителни позиции от прякото обкръжение с оглед да се избегне застъпването на силите на Ван дер Ваалс,
-всички позиции, в които заместването с аргинин или лизин, би довело до скрит некомпенсиран заряд в хидрофобната група,
-всички позиции, при които остатъците не трябва да бъдат замествани, защото те са включени в характерното структурно подреждане като: мостове от соли, образуване на спирали, стабилизиране на спиралите чрез задържане на отрицателния заряд в началото на спиралата, иницииране на спирали, например пролини, в началото на спиралата, Phi-psi ъгли, които са извън позволената зона на остатъка, който подлежи да бъде въведен.
II/ В предпочитания вариант на изпълнение следните аминокиселини също се изключват:
-всички остатъци, които се използват при катализата, свързване на кофактор /като метални йони и нуклеотиди/,
-всички позиции, които са стриктно консервативни при хомоложни ензими /ако има такива/.
III/ Следователно може да се даде предимство на всяко възможно място на мутация. Това се извършва чрез изследване на структурното обкръжение на остатъка, на разстояние до остатъците “мишени”, на водородната връзка, с която остатъкът е свързан на споменатото място, до което разтворителят има достъп.
С оглед да се избегне маскиране на електростатичните взаимодействия чрез противоположно натоварени йони, за предпочитане е да се въвеждат заряди на места, където не могат да бъдат защитени от остатъците-мишени чрез разтворител. Така поради разликата в диелектричните свойства между протеина и разтворителя, е по-вероятно да причинят ефект заряди, които не могат да бъдат солватирани напълно, поради това, че са скрити във вътрешността на протеина или частично скрити във вдлъбнатината на повърхността на протеина, отколкото заряди, които са напълно солватирани. Освен това, в случая с глюкозоизомеразата, превръщането на глюкозата във фруктоза се извършва при ниска йонна сила, и поради това защитата чрез противоположно заредени йони се очаква да влияе послабо върху новосъздаденото взаимодействие заряд-заряд, в новата глюкозоизомераза, описана в изобретението.
Критерии за определяне слабото предпочитание на избраните по-горе места, когато се заместват с положителен заряд, са:
-въвеждане на положителен заряд и/или отстраняването на отрицателен заряд засяга целостта на четвъртичната структура
-мястото е напълно достъпно за разтворител, така че се очаква въведеният заряд да бъде защитен от остатъците-мишени чрез разтворителя, което следователно ще намали ефекта върху рКа на остатъците-мишени.
Подобно, повишаването на общия отрицателен заряд около мястото на свързване на метален йон измества рКа към по-алкални рНстойности.
При друг предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, изместването на кривата на pH-активност, зависимостта към по-ниско pH се постига чрез повишаване на К .
ass
Изместването на кривата рН-активност на металоензимите към по-кисело pH, може да се постигне чрез повишаване на асоциационната константа за свързване на метален йон. Асоциационната константа на свързване на метален йон може да нарастне чрез оптимизиране на координацията на металите с лигандите. Това може да се постигне чрез въвеждане на по-добри лиганди или чрез въвеждането на повече лиганди. Електростатическите взаимодействия могат да подпомогнат асоциационната константа за свързване на метален йон на много по-големи разстояния.
При друг предпочитан вариант на изпълнение, участъкът на кривата рН-активност в киселото pH на глюкозоизомеразата се измества към по-ниското pH чрез повишаване на асоциационната константа за свързване на метални йони.
Глюкозоизомеразата свързва два магнезиеви йона на субединица, при което се получава свързване на осем катиона на тетрамер, като с това се повишава общият заряд с +16 / виж фигура 1/. Двете места на свързване са разположени в С-края на бета-веригата. Мястото на свързване “долу” е разположено дълбоко във веригата, в ксилитолния комплекс и директно свързва два кислорода от инхибитора. Второто място на свързване “горе” е разположено близо до края на бета-верига близо до вдлъбнатината на активния център и интерфейса субединицата.
Обикновено, когато един положително зареден йон се свързва към втора частица, константите на свързване и дисоцииране, както и общата равновесна константа, зависят от заряда на втората частица. Явява се отблъскване, когато частицата е също положително заредена, докато противоположните заряди се привличат. За малки йони, в някои случаи и за протеини, този ефект може да бъде количествено определен чрез измерване на зависимостта на скоростта на реакцията от йонната сила. Степента на свързване на йони със срещуположен заряд намалява с повишаване на йонната сила, степента на свързване на едноименни заряди се повишава с повишаване на йонната сила, и когато една от частиците не е заредена, то няма действие на йонната сила.
Афинитетът на глюкозоизомеразата към магнезиевия йон намалява с повишаване на йонната сила, което е в състояние с общия отрицателен заряд на мястото на свързване на глюкозоизомеразата. Свързването на катиона може да бъде променено чрез въвеждане на заредени аминокиселини на повърхността на протеина, по пътя на навлизане на катиона в активния център. По-специално изобретението се отнася до използването на електростатични сили за промяна на константата на скорост на свързване на катиона. Глюкозоизомеразата може да бъде образувана така, че да повишава скоростта на свързване на катиона чрез добавяне на отрицателен заряд /или премахване на положителен заряд/ близо до вдлъбнатината на активния център или за намаляване на скоростта на свързване на катиона чрез добавяне на положителен заряд /или премахване на отрицателен заряд/ близо до вдлъбнатината на активния център. ТЪЙ като по-голяма скорост не се очаква съществено да се повлияе, една промяна на скоростта ще доведе до промяна на общата константа на свързване на катиона. Тъй като областите, разположени при С-краищата на бета структурата, оформят входа на активния център, възможните места за мутация се търсят в тази област. За да се избегне възможно засягане на стабилността на структурата, заместването при бета-веригите или алфа-спиралите няма да бъде разглеждано Може да се използва следното:
-да се подберат всички остатъци в областта между С-краищата на бета-веригите и N-краищата на алфа-спиралите,
-да не се разглеждат остатъци, при които заместването води до понижаване на чистия положителен заряд в радиус от 15 А около металните лиганди. Въвеждането на отрицателни заряди твърде близо до мястото за свързване на метален йон измества рКа на металните лиганди към по-високо рН, което унищожава ефекта от повишената Кам при пониско рН,
-да се изчисли достъпна повърхност на останалите остатъци в рамките на протеина, като се използва образец с радиус 1,4 А. Да се отстранят остатъците които са скрити, в смисъл, че те имат по-малко от 10 А2 достъпна повърхност.
Информацията относно ЗО-структурата на ензима /или на комплекса ензим: субстрат или ензим:инхибитор/ е от голямо значение за предвиждания, които могат да бъдат въведени.
Има съобщение за структурни данни за глюкозоизомераза на Streptomyces rubiginosus (Carrell et al, J. Biol. Chem. 259 (1984) 32303236; Carrell et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, (1989) 440-4444) Streptomyces olivochromogenus (Farber et al, Protein Eng.I, (1987); Farber et al. Biochemistry 28 (1987) 7289-7297), Arthrobacter (Hendrick et dl., J. Mol. Biol. 208 (1989) 127-157) u Streptomyces alvus ( Dauter et al. FEBS :ett. 247, 1-8).
Въпреки, че не разполагаме с данни за всички аминокиселинни последователности на тези ензими, забележителна е ЗО-структурната хомоложност с глюкозоизомераза от Actinoplanes missouriensis (F. Rey et al., Proteins 4 (1988) 165-172).
C цел да се посочи общата приложимост на метода, описан в настоящата заявка, гени с различен произход, кодиращи глюкозоизомераза, се клонират и секвенират. Аминокиселинните последователности на глюкозоизомеразата са изведени от гените на Streptomyces violaceoruber, Streptomyces murinus, Arthrobacter spec., Streptomyces thermovulgaris са хомоложни. Публикуваните аминокиселинни последователности на глюкозоизомеразата от Ampullariella sp. (Saari, ibid.) u Streptomyces violaceoniger (Nucl. Dcids Res. 16 (1988) 9337), изведени от нуклеотидните последователности на съответните гени, проявяват близка хомоложност към глюкозоизомеразата от Actinoplanes missouriensis. Освен това в WO 89/01520 се посочва, че аминокиселинната последователност на глюкозоизомеразата от Streptomyces rubiginosus е хомоложна на глюкозоизомеразата от Ampullariella sp.
Въпреки липсата на ЗО-структурни данни за повечето глюкозоизомерази, може да се заключи, че всички глюкозоизомерази от Actinomycetales имат сходна тетрамерна организация.
Може да се приеме, че когато общата хомоложност е по-голяма от 65 %, за предпочитане по-голяма от 74 % /минимална хомоложност между глюкозоизомеразите от Actinoplanes missouriensis u Streptomyces, Amore and Hollenberg, Nucl. Acids Res.17 7515 (1989) и по-за предпочитане над 85 %, и когато 3Dструктурата е сходна, заместването на аминокиселини води до сходни промени в рНоптимума. Очаква се, специфично, глюкозоизомеразите от видове, спадащи към род Actinomycetales, да имат такава степен на сходство, че промяната на pH-оптимума, дължаща се на заместване на аминокиселини на избрани места да е сходна. Actinoplanes missouriencsis е предпочитаният източник на глюкозоизомераза, подходяща за мутации.
Фигура 1 дава схематично представяне на активния център на глюкозоизомераза от Actinoplanes missouriensis.
Фигура 2 показва линейни аминокиселинни последователности на различни глюкозоизомерази.
В настоящото описание се използва както трибуквеният, така и еднобуквеният код на аминокиселините (Stryer, L. Biochemistry, p.13, 2nd ed, W. Н. Freeman and Comp., NY, 1981).
D-глюкозоизомераза (GI) се използва като синоним на D-ксилозоизомераза /D-ксилозокетол-изомераза, ЕС 5.3.1.5/ ензим, който превръща D-ксилоза в D-ксилулоза. D-глюкозоизомеразата от Actinoplanes missouriensis, получена от конструирани щамове E.coli, се означава като EcoAmi (DSM) GI. За да се различава генът от Actinoplanesmissouriensis, ко диращ за GI от аналогичния ген от Е. coli xylA, първият се означава GI.
Maniatis et al.(1982, Cold Sprang Harbor Laboratory) и Ausubel et al. (1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons Inc. New York), описват методи за манипулиране на ДНК-молекули. Клониране и определяне на ДНК-последователности на гена на глюкозоизомеразата от Actinoplanes missouriensis DSM 43046 са описани в ЕР-А0351029. Получената аминокиселинна последователност на GIе номерирана и сравнена с други глюкозоизомерази на фиг.2. В следващото изложение номерирането на аминокиселините се отнася до фиг.2.
Див тип и мутантен тип GI ензими се получават в Е. coli щам К514 култивиран както е описано в ЕР-А-0351029.
Ензимната активност на глюкозоизомеразата се изследва както е описано по-долу / 1 единица ензимна активност продуцира 1,0 микромол от продукта D-ксилулоза или Dфруктоза за минута, следователно, специфичната активност-spa-ce изразява в единици за милиграм GI ензим/.
GI активността може да се изследва директно чрез измерване повишаването на адсорбирането при 278 nm на ксилулоза, получена при 35°С чрез изомеризация на ксилоза от глюкозоизомераза. Това изследване се извършва в 50 тМ триетаноламинов буфер, pH 7,5 съдържащ 10 mM MgSO4, в присъствие на 0,1 М ксилоза. Крайната концентрация на глюкозоизомераза при изследването е 0,01 mg/ml точно определена, преди разреждането в изследвана ензимна смес, чрез абсорбционна спектрография при използване на екстинкционен коефициент 1,08 при 278 nm за разтвор на ензим от 1,0 mg/ml.
Специфичната активност се определя в двойното изследване D-сорбитолдехидрогеназа, ензимното определяне на D-ксилулоза се извършва при 35°С, както е описано по-горе (Kersters-Hilderson et al., Enzyme Microl. (1987) 145) в 50 триетаноламин, pH 7,5, 10 mM магнезиев сулфат и 0,1 M ксилоза в присъствие на 2 х 10-8 М D-сорбитолдехидрогеназа /Lидитол:НАО-оксидоредуктаза, ЕС 1.1.14/ и 0,15 nM NADH, освен че инкубационният буфер, включва също 1 тМ етиленбис /оксиетиленнитрило/ тетраоцетна киселина /EGTA/ . Крайната концентрация на глюкозоизомера зата при това изследване е 2,5 χ 10'3 mg/ml и е точно определена, както е описано по-горе.
GI-активността при субстрат глюкоза може да се изследва чрез измерване на Dфруктозата, получена по време на реакцията на изомеризацията, като се използва методът на цистеин-карбазол /ССМ/, който се основава на реакцията на кетозахарите с карбазол в киселина, при което се получава червен продукт (Disch and Borengreund, J. Biol. Chem. 192 (1951) 583).
ОПИСАНИЕ HA ФИГУРИТЕ
Фигура 1 схематично представя активния център на глюкозоизомераза от Actinoplanus missouriensis, получен от триизмерната структура на комплекса глюкозоизомераза-ксилол. Инхибиторът е посочен с подробности в центъра на фигурата. За аминокиселинните остатъци са нанесени само тези атоми, които са включени във водородните връзки. Наименованията на аминокиселинните остатъци са дадени в кутийки с плътно очертание, молекулите на разтворителя са в кутийки, очертани с прекъснати линии. Местата за свързване на метални йони са посочени чрез кръгчета номерирани, 395 и 580. Прекъснатите линии показват електростатичните взаимодействия, пунктираните линии представляват водородните връзки, плътните прекъснати линии показват предложеното свързване на метали и йони. Стриктно запазените остатъци са отбелязани със звездичка. За незапазените остатъци са посочени установените замествания.
Фигура 2 показва подреждането на аминокиселинните последователности на глюкозоизомерази с различен произход. Посочена е пълната последователност на глюкозоизомераза от Actinoplanes missouriensis. Аминокиселинната последователност на глюкозоизомераза от Ampullariella се различава от тази в публикуваните последователности (Saari, J. Bacteriol., 169, (1987) 612) по един остатък: открито е, че пролин 177 в публикуваната последователност е аргинин.
Последователността на Streptomyces thermovulgaris е установена само до аминокиселина 346. Неопределените остатъци са оставени празни. Точката означава липса на аминокиселина в тази позиция в сравнение с която и да е от другите последователности. Различните видове са означени със следните символи:
Ami.: Actinoplanes missouriensis DSM 4643 Amp.: Ampullarella species ATCC 31351 SVI.: Streptomyces violaceoruber LMG 7183
Smu.: Streptomyces murinus
Sth.: Streptomyces thermovulgaris DSM 40444
Art.: Arthrobacter species
Esu.: Bacillus subtilus
Eco.: Escherichia coli
Lny.: Lactobacillus xylosus
Определянето на вторичната структура е направено в структурата на Actinoplanus missouriensis. Спиралите в структурата са обградени с плътни линии. Бета-веригите са в защриховани кутийки.
Фигура 3 показва кривата рН-активност на глюкозоизомеразата в присъствие на 200 тМ ксилоза и 10 тМ магнезий /квадратчета/ и 1 тМ манган /кръгчета/.
Фигура 4 показва реакционната схема на изомеризация катализирана от глюкозоизомераза, в присъствие на метален йон. Е = ензим, S = субстрат, М = метален йон, Р = продукт.
Фигура 5 показва pH-зависимостта на реакцията на глюкозоизомераза с ксилоза и Mg2+, както е посочено чрез експерименти. К,, К2, К3 и К4 са равновесни константи обяснени в текста и в реакционната схема, посочена на фиг.4.
Фигура 6 показва кривата рН-активност за мутантите K294R и K294q в присъствие на 200 тМ ксилоза и 10 тМ магнезий.
Фигури 7 показва кривата рН-активност за E186Q u E186D в присъствие на 200 тМ Mg2+.
Фигура 8 показва кривата на зависимостта pH-активност за E186D u E186Q в присъствие на 200 тМ ксилоза и 1 тМ Мп2+.
Фигура 9 показва кривата рН-активност на мутант D255N в присъствие на 200 тМ ксилоза и 1 тМ манган.
Фигури 10 до 20 показват нормалната крива pH-активност за следните мутанти:
F254K /фиг.10/, F94R /фиг.11/, F61K /фиг. 12/, А25К /фиг. 13/, D57N /фиг. 14/, L258K /фиг.15/, Q204K /фиг.16/, R23Q / фиг.17/, H54N /фиг.18/, H290N /фиг.19/, T95D /фиг.20/.
Условията са посочени във фигурите.
Фигура 21 показва нормалната крива pH-активност за мутант F61KK253R. Условията са посочени във фигурата.
ПРИМЕРНИ ИЗПЪЛНЕНИЯ
Пример 1. pH-зависимост на активността на глюкозоизомеразата
С оглед да се определи вида на зависимостта pH-активност на див тип и на мутантна глюкозоизомераза, активността се измерва във функция от pH /5,2-8,0/ в присъствие на 10 mM MgSO4 и 200 тМ ксилоза /използвайки метода за директно изследване/. За мутанти с твърде ниска активност, свързаната система за изследване на сорбитолдехидрогеназа се използва при pH между 5,8 и 8,4. Вземат се мерки сорбитолдехидрогеназната реакция да не става ограничаваща за скоростта при крайни рН-стойности.
На фиг.З е дадена кривата рН-активност на глюкозоизомеразата /например рекомбинантен див тип ензим от Acthinoplanus missouriensis/ в присъствие на 200 шМ ксилоза и различни активиращи катиони. Тя показва понижаване в активността, както при кисело pH под 7,0, така и при алкално pH над 8,0.
Подходящият статичен кинетичен механизъм за глюкозоизомеразата включва бързо образуване на комплекс ензим-метал-захар, който се превръща в продукт при ограничаващ скоростта етап /така наречено бързо уравновесяване-рядко използван механизъм-виж фиг.4/. Флуоресцентните измервания на равновесното и преходно състояние / спрян поток/ показват наличие на две места за свързване на метални йони. При изследването чрез “спрян поток”, металните йони се свързват последователно. Високо афинитетният метал играе роля при поддържането на активна конформация и поради това се нарича “конформационно” място. Второто място на свързване приспособява активирания катион, поради което това място се означава обикновено като “каталитично” място. Реакционната схема, посочена във фиг.4, изглежда отговаря на анализа и сравнява опитите при статичното състояние и при “спрян поток”. Обикновено, резултатите при статично състояние не се различават за двете места на свързване на метални йони, но се приема, че същественият ефект идва от каталитичното място за свързване на метален йон.
Анализът за началната скорост /V/ за превръщане на ксилоза, като функция от кон центрацията на ксилоза и магнезий, позволява определянето на четири параметра: максимална скорост равновесните константи на свързване на магнезий към свободния ензим /К/ и на комплекса ензим-захар /К4/ и равновесните константи на свързване на ксилоза към свободния ензим /К2/ и на комплекса ензиммагнезий /К3/.
V K3*/S/ К4*/М/ K3*Kj*/S/*/M/ където /М/ и /S/ представляват концентрацията, съответно на металния йон и на ксилозата.
Чрез систематично изменение концентрацията на магнезиевия йон и на ксилозата е възможно да се изведат стойности за максимална скорост за всичките четири равновесни константи. Фигура 5 показва рН-зависимостта от тези параметри.
Сравнението на резултатите от фиг.З и 5 показва, че видът на pH кривата в киселата част напълно се определя от свързването на металния йон.
Данните от фиг.5 не са достатъчно точни, за да се пресметне броят на нужните йонизации. Наклонът на участъка от log К14 спрямо pH /наклон>1/ показва обаче, че може да е включена повече от една йонизация. Сходството в pH-зависимостта на К( и К4 показва, че едни и същи йонизиращи групи са важни за тези два процеса /включващи едно и също място/.
Пример 2. Избор на аминокиселинни остатъци в глюкозоизомеразата, чието заместване води до промяна на рКа-стойностите на свързването на метал, йонизируеми аминокиселини.
При глюкозоизомеразата, критериите за избор на възможни за заместване позиции на, както е подчертано в подробното описание на изобретението, се прилагат чрез използване на линейни последователности с различен произход /фиг.2/ и структурата на високо пречистената глюкозоизомераза от Actinoplanes missouriensis в комплекс с инхибитора ксилол /виж фиг.1 и “информация за структурата” в “подробното описание на изобретението”/. От структурата на високо пречистения продукт с разрешителна способност от 2,2 А се вижда положението на инхибитора и на двете места за свързване на метален йон. На фиг. 1 схема тично е представен активния център на глюкозоизомераза от Actinoplanes missourienis.
От структурата на глюкозоизомеразата в комплекс с кобалт и ксилитол, се избират тези остатъци, чието заместване в по-положително заредени аминокиселинни остатъци, води до явно повишаване на положителния заряд в радиус от 15 А от йонизируемите групимишени. В случай на глюкозоизомераза, мишените са йонизируеми групи, които са включени в координацията на нужните за активността метални йони. Тези йонизируеми групи-мишени представляват карбоксилните групи на Glul81, Glu217, Asp245, Asp255, u Ne на His220.
След прилагане на критерий 1, са подбрани 80 възможни сайта за мутации. Тези сайтове са обобщени по-долу:
Ala5, Phell, Leul5, Trp20, Gln21, Ala25, Phe26, Asp28, Ala29, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe53, His54, Asp56, Asp57, Phe61, Ile85, Met88, Phe94, Thr95, Phel04, Gln!33, Leul34, Vail35, Alal43, Tyrl45, Tyrl58, Asnl63, Serl69, Glul81, Asnl85, Glul86, Glyl89, llel91, Prol94, Hisl98, Gln204, Leu211, Phe212, ASn215, Glu217, Thr218, His220, Glu221, Gln222, Ser224, Asn225, Leu226,Phe228, Thr229, Gly231, Leu236, His238, His243, Asp245, Asn247, His250, Phe254, Asp257, Leu258, Val259, Phe260, His262, Leu271, Tyr285, Asp286, His290, Asp292, Tyr293, Thr298, Glu299, Trp305, Ala310, Met314, Val380, Asn383.
След отстраняване на каталитичните остатъци и на стриктно запазените остатъци / критерии II/, остават следните 62 остатъка: Ala5, Leul5, Gln21, Ala25, Phe26, Asp28, А1а29, Gly47, Tyr49, Phr52, Asp56, Phe61, Ile85, Met88, Thr95, Phel04, Hlnl22, Thrl33, Leul34, Ala 143,Tyr 145, Tyrl58, Asnl63, Serl69, Asnl85, Glyl89, Ilel91, Prol94, Hisl98, Gln204, Leu211, Phe212, Thr218, Gln222, Ser224, Asn225, Leu226, Phe228, Thr229, Gly231, Leu236, His238, His243, His250, Phe254, Gln256, Asp257, Leu258, Val259, His262, Leu271, Tyr285, Asp286, His290, Tyr293, Thr298, Glu299, Trp305, Ala310, Met314, Val380, Asn383. След това се дава приоритет на всяко едно от тези 62 възможни места за мутация, съгласно критерии III. Следващите 24 места са определени като имащи приоритет за мутагенезата: А1а25, Gly47, Tyr49, Thr52, Phe61, Ile85, Thr95, Glnl22, Thrl33, Tyrl45, Tyrl58, Glyl89, Ilel91,
Gln204, Thr218, Gln222, Leu226, Thr229, Gly231, Leu236, Gln256, Leu258, Tyr293 u Val380. Мутацията на един или няколко аминокиселинни остатъка от избраните 80 в положително заредени остатъци, води до понижаване на рКа на мястото за свързване на метален йон на глюкозоизомеразата. Това може да доведе до съответно изместване на кривата pH-активност към по-ниско pH.
Съответно, мутацията на един или няколко от 80-те избрани остатъци на аминокиселини в отрицателно заредени остатъци води до повишаване на рКа на свързването на метален йон на глюкозоизомеразата. Това може да доведе до съответно изместване на кривата за зависимостта pH-активност към повисоко pH.
Пример 3. Влияние на мутацията на Lys 294 върху кривата pH-активност
В позиция 294 на глюкозоизомеразата, един положителен заряд е разположен на около 8 А от най-често заеманото място за свързване на метален йон в комплекса глюкозоизомераза-ксилитол /395 в фиг.1/. Осъществява се мутация на това място, като се замества лизинът с аргинин. Тази мутация запазва положителния заряд в позиция 294. Всъответствие с това запазване на положителния заряд се наблюдава, че кривата на зависимостта pH-активност на мутанта е сходна с тази на дивия тип ензим.
Но когато в позиция 294 положителният заряд се отстрани чрез заместване на лизин 294 с глутамин, се наблюдава изместване на кривата pH-активност към алкалната част с приблизително 0,5 pH-единици. Кривите рНактивност на K294R и K294Q са посочени на фиг. 6.
Този пример доказва, че е възможно да се манипулира рКа на една или повече функционални групи, в активния център на глюкозоизомеразата, чрез промяна на заряда на протеина около активния център.
Пример 4. Влияние мутацията на Glu 186 и на заместването на магнезиевите йони с манганови йони върху зависимостта pH-активност
В мутанта E186Q един отрицателен заряд е заместен от неутрален заряд, който дава начало на явно повишаване на положителния заряд в радиус от 15 А около металните лиганди. Кривата pH-активност на мутант E186Q в присъствие на магнезий е показана на фиг. 7. Участъкът от кривата в алкалното pH се измества значително към по-ниско pH. При наличност на манган вместо магнезий кривата pH-активност на E186Q се измества към по-ниско pH и в неговия pH-оптимум неговата активност е по-висока от тази за дивия тип /фиг.8/.
За приложения, при които могат да се използват метални йони различни от магнезий, комбинацията E186Q с манган при ниско pH е интересен вариант.
Осъществена е и мутация E186D, която е консервативна по отношение на заряда. Кривата pH-активност на този мутант е посочена на фиг. 7 и 8. pH-зависимостта на активността на E186D мутанта не е значимо различна от тази на дивия тип ензим. Отстраняването на отрицателния заряд в позиция 186 измества кривата pH-активност към по-кисело pH. Този пример подчертава рационалността, която носи мутацията E186Q.
Пример 5. Влияние от заместване на Asp255 върху кривата рН-активност
Заместването на отрицателно заредената аспарагинова киселина в позиция 255, която е фактически свързващ метал лиганд в глюкозоизомеразата, с неутрален аспарагин, дава начало на изместването на кривата рНактивност към по-ниско pH в присъствие на манган. pH-оптимумът се измества с около 2 pH единици към по-киселото pH.
Кривата pH-активност е посочена на фиг.9.
Пример 6. Глюкозоизомерази с променен вид на кривата рН-активност
Мутанти на глюкозоизомераза, получени съгласно методите, посочени в описанието на изобретението, се изследват за отношението pH-активност при условията, посочени на фиг. от 10 до 20. Кривата на зависимостта pH-активност на един мутант е резултат от ефекта на мутацията върху рКа от една страна и влиянието върху Кая от друга страна.
Резултатите за следващите мутанти са посочени във фигурите: F254K /фиг. 10/, F94R /фиг.11/, F16K /фиг.12/, А25К /фиг.13/, D57N /фиг.14/, L258K /фиг.15/, Q204K / фиг.16/, R23Q /фиг.17/, H54N /фиг.18/,
H290N /фиг.19/, T95D /фиг.20/.
При мутантите, в които е въведен положителен заряд /F254K, F94R, F61K, А25К, L258K, Q204K/ или е неутрализиран отрицателен заряд /D57N/, може да се види, че киселият участък от кривата pH-активност е изместен към по-ниско pH.
При мутантите, в които е въведен отрицателен заряд (Т95О)или е неутрализиран положителен заряд (R23Q, H54N, H290N), може да се види, че кривата pH-активност е изместена към по-високо pH.
Тези две наблюдения са в съответствие с модела представен в подробното описание на изобретението.
Трябва обаче да се отбележи, че мутанти, при които се замести една запазена аминокиселина (F94R, D57N, H54N), се дават драстично понижаване на специфичната активност върху ксилоза. В позиция 254 в линейна последователност /фиг.2/, се установяват само хидрофобни аминокиселини. Въвеждането на заредена аминокиселина /F254K/ в тази позиция, също води до драстично понижаване на специфичната активност. Така, може да се заключи, че въпреки че могат да се използват / полу/консервативни аминокиселинни позиции за променяне на заряда с цел модифициране кривата pH-активност, те не са предпочитани места.
Пример 7. Стабилизиране на мутанти с променен pH-оптимум за получаване на подобра производителност при условията на прилагане
Мутантите H290N u F61K дават очакваното изместване на кривата рН-активност, както е описано в пример 6. От тези мутанти H290N се имобилизира, както е описано в ЕРА-351029 /пример 7/. Извършва се пробно прилагане на дивия тип и на този мутант на глюкозоизомераза, както е посочено в същото описание /пример 8/. Стабилността се определя чрез константа на понижаване от първи порядък /Kd, колкото е по-голяма константата на понижаване, толкова е по-стабилен ензимът/. Таблица 2 посочва Κ,-стойностите за див тип и за мутантна глюкозоизомераза.
Таблица 2
Константи на понижаване за див тип и за мутантна глюкозоизомераза, имобилизирани върху Lewatit
Kd (х 106 sec1) Див тип2,5
H290N3,1
K253R0,7
H290NK253R1,6
F61KK253R1,4
Както се вижда от таблица 2, H290N е дестабилизиран в сравнение с дивия тип глюкозоизомераза. Установено е, че K253R стабилизира дивия тип глюкозоизомераза с фактор по-голям от 3. Зависимостта на кривата pH-активност на K253R мутанта е идентична с тази на дивия тип ензим. Комбинацията от мутант H290N по отношение на pH с мутант K253R по отношение на стабилността доказва, че мутантите по отношение на pH могат да бъдат стабилизирани чрез въвеждане на мутации, за които е посочено, че стабилизират дивия тип ензим.
Освен това таблица 2 показва, че мутант F61K по отношение на pH е стабилизиран спрямо дивия тип ензим след въвеждане на H253R.
Изместването на кривата на зависимостта pH-активност в киселата част на F61K се запазва в двойния мутант /фиг.21/. Това показва, че мутации, които подобряват различни свойства на ензима могат да бъдат комбинирани в един нов мутант, който поема подобрените свойства на отделните мутации /подобрен рНоптимум и подобрена стабилност, в този случай/.
Избраните по-горе примери са избрани да демонстрират същността на изобретението, без да ограничават обхвата. С оглед на това, трябва да е ясно, че комбинирането на споменатите по-горе мутации с други мутации, водещи до променени характеристики, напри5 мер термостабилност, свързване на метални йони се включват в предмета на изобретението.
Claims (4)
- Патентни претенции10 1. Метод за изменение зависимостта на активността на глюкозоизомераза от pH, характеризиращ се с това, че най-малко една аминокиселина се замества с аминокиселина, притежаваща странична верига с различен 15 заряд.
- 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се замества една аминокиселина в радиус от 15 А около остатъка мишена с по-положително заредена аминокиселина.
- 3. Метод за получаване на мутантна глюкозоизомеразна молекула съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че се получава ДНК последователност, кодираща глюкозоизомераза, че се осъществява мутация на тази последователност в избрани нуклеотидни позиции, че мутантната последователност се клонира в експресионен вектор по такъв начин, че ДНК последователността да може да се експресира, и с него да се трансформира микроорганизъм или клеткагостоприемник, от които след култивиране се изолира глюкозоизомеразата.
- 4. Използване на мутантната глюкозоизомераза съгласно която и да е от горните претенции за преобразуване на захарни молекули.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90200037 | 1990-01-04 | ||
| EP90200030 | 1990-01-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG93586A BG93586A (bg) | 1993-12-24 |
| BG60869B1 true BG60869B1 (bg) | 1996-05-31 |
Family
ID=26125703
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG93586A BG60869B1 (bg) | 1990-01-04 | 1991-01-04 | Метод за получаване на глюкозоизомераза с променен рн-оптимум |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5340738A (bg) |
| EP (1) | EP0436502B1 (bg) |
| JP (1) | JPH06319543A (bg) |
| KR (1) | KR910014503A (bg) |
| AT (1) | ATE310080T1 (bg) |
| AU (1) | AU642688B2 (bg) |
| BG (1) | BG60869B1 (bg) |
| BR (1) | BR9100025A (bg) |
| CA (1) | CA2033658C (bg) |
| DE (1) | DE69133491T2 (bg) |
| ES (1) | ES2253733T3 (bg) |
| FI (1) | FI102542B1 (bg) |
| HU (1) | HUT61328A (bg) |
| IE (1) | IE910011A1 (bg) |
| PT (1) | PT96416A (bg) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0440273T3 (da) * | 1990-01-04 | 2003-08-04 | Genencor Int | Fremgangsmåde til opnåelse af glucoseisomeraser med ændret substratspecifitet |
| JPH0556789A (ja) * | 1990-10-29 | 1993-03-09 | Juzo Udaka | テルムス アクアテイカスのキシロースイソメラーゼ遺伝子、キシロースイソメラーゼ及びそれを用いたフラクトースの製造方法 |
| US5863783A (en) * | 1991-03-27 | 1999-01-26 | Gist-Brocades, N.V. | Cloning and expression of DNA molecules encoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin |
| US5266475A (en) * | 1991-09-19 | 1993-11-30 | Michigan Biotechnology Institute | Glucose isomerases with improved affinity for D-glucose |
| US5989887A (en) * | 1992-11-25 | 1999-11-23 | Dsm N.V. | Cloning and expression of DNA molecules incoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin |
| FR2854972B1 (fr) | 2003-05-12 | 2005-07-15 | Bourgogne Grasset | Poste de lecture et/ou d'ecriture pour jetons de jeu electroniques |
| CN1702172B (zh) * | 2004-05-26 | 2011-12-07 | 百瑞全球有限公司 | 葡萄糖异构酶突变体 |
| JP4945096B2 (ja) * | 2004-10-29 | 2012-06-06 | 松谷化学工業株式会社 | 異性化糖を含む難消化性デキストリンの製造方法 |
| PT1766589E (pt) | 2005-04-07 | 2013-08-23 | Gaming Partners Int | Processo de gestão de uma pluralidade de leitores de fichas incorporando um microprocessador electrónico e equipamento de implementação do dito processo |
| FR2888372B1 (fr) | 2005-07-08 | 2007-10-12 | Caming Partners Internationale | Jeton a puce electronique et son procede de fabrication |
| CA2553949C (fr) | 2005-11-09 | 2016-02-16 | Pierre Chapet | Jeton a insert a puce electronique |
| EP2118299A1 (en) * | 2007-01-11 | 2009-11-18 | Danisco US, INC., Genencor Division | Enzyme production in culture medium comprising raw glycerol |
| EP2165293B1 (en) | 2007-05-25 | 2012-11-07 | Gaming Partners International | Token with electronic device. |
| EP3619306A1 (en) | 2017-05-05 | 2020-03-11 | c-LEcta GmbH | Glucose isomerase |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE81141B1 (en) * | 1983-06-24 | 2000-04-05 | Genencor Int | Procaryotic carbonyl hydrolases |
| US4609625A (en) * | 1983-11-14 | 1986-09-02 | Owens-Illinois, Inc. | Process for the production of modified proteins and product thereof |
| US4894331A (en) * | 1985-09-27 | 1990-01-16 | Amgen Inc. | Partial marker cassette mutagenesis of xylose isomerase |
| EP0916732B1 (en) * | 1987-04-06 | 2007-08-22 | Novozymes A/S | The engineering of electronic interactions at metal ion binding sites for the stabilization of proteins |
| WO1989001520A1 (en) * | 1987-08-11 | 1989-02-23 | Cetus Corporation | Procaryotic xylose isomerase muteins and method to increase protein stability |
| US5041378A (en) * | 1987-08-11 | 1991-08-20 | Cetus Corporation | Procaryotic xylose isomerase muteins |
| GB8815902D0 (en) * | 1988-07-04 | 1988-08-10 | Imperial College | Xylose isomerase mutants |
| EP0351029B1 (en) * | 1988-07-15 | 2002-03-06 | Genencor International, Inc. | Novel glucose isomerase enzymes and their use |
| DE68929376T2 (de) * | 1988-07-15 | 2002-10-17 | Genencor Int | Glucose-Isomerase-Enzyme und deren Verwendung |
-
1991
- 1991-01-02 EP EP91200002A patent/EP0436502B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-02 DE DE69133491T patent/DE69133491T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-02 AT AT91200002T patent/ATE310080T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-01-02 FI FI910024A patent/FI102542B1/fi active
- 1991-01-02 ES ES91200002T patent/ES2253733T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-03 IE IE001191A patent/IE910011A1/en unknown
- 1991-01-03 HU HU9116A patent/HUT61328A/hu unknown
- 1991-01-03 PT PT96416A patent/PT96416A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-01-03 AU AU68652/91A patent/AU642688B2/en not_active Ceased
- 1991-01-04 CA CA002033658A patent/CA2033658C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-04 KR KR1019910000042A patent/KR910014503A/ko active IP Right Grant
- 1991-01-04 BG BG93586A patent/BG60869B1/bg unknown
- 1991-01-04 JP JP3187106A patent/JPH06319543A/ja active Pending
- 1991-01-04 BR BR919100025A patent/BR9100025A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-01-04 US US07/637,399 patent/US5340738A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-08-26 US US08/112,703 patent/US5384257A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IE910011A1 (en) | 1991-07-17 |
| FI910024A (fi) | 1991-07-05 |
| US5384257A (en) | 1995-01-24 |
| HUT61328A (en) | 1992-12-28 |
| DE69133491D1 (de) | 2005-12-22 |
| FI910024A0 (fi) | 1991-01-02 |
| EP0436502A3 (en) | 1992-03-18 |
| AU6865291A (en) | 1991-07-11 |
| JPH06319543A (ja) | 1994-11-22 |
| ATE310080T1 (de) | 2005-12-15 |
| BR9100025A (pt) | 1991-10-22 |
| CA2033658A1 (en) | 1991-07-05 |
| FI102542B (fi) | 1998-12-31 |
| PT96416A (pt) | 1991-10-15 |
| EP0436502B1 (en) | 2005-11-16 |
| CA2033658C (en) | 2001-07-31 |
| KR910014503A (ko) | 1991-08-31 |
| BG93586A (bg) | 1993-12-24 |
| HU910016D0 (en) | 1991-08-28 |
| US5340738A (en) | 1994-08-23 |
| FI102542B1 (fi) | 1998-12-31 |
| ES2253733T3 (es) | 2006-06-01 |
| EP0436502A2 (en) | 1991-07-10 |
| AU642688B2 (en) | 1993-10-28 |
| DE69133491T2 (de) | 2006-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG60869B1 (bg) | Метод за получаване на глюкозоизомераза с променен рн-оптимум | |
| US11041160B2 (en) | Industrial keratinase via genetic engineering and use thereof | |
| Vieille et al. | xylA cloning and sequencing and biochemical characterization of xylose isomerase from Thermotoga neapolitana | |
| Echt et al. | A comparison of two sucrose synthetase isozymes from normal and shrunken-1 maize | |
| Aebi et al. | Activity and stability of catalase in blood and tissues of normal and acatalasemic mice | |
| CA2033657C (en) | Glucose isomerases having altered substrate specificity | |
| EP0970193A1 (en) | PROTEIN ENGINEERING OF GLUCOAMYLASE TO INCREASE pH OPTIMUM, SUBSTRATE SPECIFICITY AND THERMOSTABILITY | |
| Jin et al. | Enhanced catalytic efficiency and thermostability of glucose isomerase from Thermoanaerobacter ethanolicus via site-directed mutagenesis | |
| US5656463A (en) | Thermostable DNA topoisomerase V from Methanopyrus kandleri | |
| US6537792B1 (en) | Protein engineering of glucoamylase to increase pH optimum, substrate specificity and thermostability | |
| US7198933B2 (en) | Thermotoga neapolitana xylose isomerase polypeptides and nucleic acids encoding same | |
| Collins et al. | A subunit interface mutant of yeast pyruvate kinase requires the allosteric activator fructose 1, 6-bisphosphate for activity | |
| CN114032224B (zh) | 5-氨基乙酰丙酸合成酶突变体及其宿主细胞和应用 | |
| Cha et al. | Lowering the pH optimum of D-xylose isomerase: the effect of mutations of the negatively charged residues | |
| US6194190B1 (en) | Amino-terminal deblocking enzyme | |
| Varsani et al. | Arthrobacter D-xylose isomerase: protein-engineered subunit interfaces | |
| Yun et al. | Directed evolution to enhance secretion efficiency and thermostability of chitosanase from Mitsuaria chitosanitabida 3001 | |
| Meng et al. | Mutational analysis of the conserved cationic residues of Bacillus stearothermophilus 6‐phosphoglucose isomerase | |
| Sriprapundh | Genetic engineering of xylose isomerase thermozymes for enhanced activity, stability, and utility | |
| JPS63287484A (ja) | クレアチンアミジノヒドラーゼ、新規プラスミド及び微生物、酵素の製法及びクレアチニン含量の測定法 | |
| WO2023110822A1 (en) | Glucose isomerases | |
| Nelson | A paper published in FEBS Letters Scott W. Nelson, Richard B. Honzatko, and Herbert J. Ffomm | |
| MENG | Improvement of Germoplasms of Enzyme‐Producing Microbial Strains by Genetic Engineering | |
| Bastawde et al. | Catalytic properties and partial amino acid sequence of an actinomycete endo-(1→ 4)-β-d-xylanase from chainia species | |
| Zimmermann et al. | Mutagenesis studies of conserved residues in mammalian dihydroorotase |