JPH0556789A - テルムス アクアテイカスのキシロースイソメラーゼ遺伝子、キシロースイソメラーゼ及びそれを用いたフラクトースの製造方法 - Google Patents
テルムス アクアテイカスのキシロースイソメラーゼ遺伝子、キシロースイソメラーゼ及びそれを用いたフラクトースの製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 テルムス アクアティカスのキシロースイソ
メラーゼ遺伝子、テルムス アクアティカスのキシロー
スイソメラーゼ、及びこのキシロースイソメラーゼの製
造方法を提供する。さらに、得られたキシロースイソメ
ラーゼを用いて、高濃度のフルクトース溶液を、着色さ
せることなく製造する方法を提供する。 【構成】 高熱性細菌の一種であるテルムス アクアテ
ィカスのキシロースイソメラーゼ遺伝子の分離、同定、
クローニングする。クローニングして得たキシロースイ
ソメラーゼ遺伝子及びプロモーターを有するプラスミド
で形質転換した微生物を培養して得たキシロースイソメ
ラーゼを遺伝子工学的に製造する。得られたキシロース
イソメラーゼは、至適温度が約９５℃であり、マグネシ
ウムにより熱安定化され、天然のテルムス アクアティ
カスのキシロースイソメラーゼとは異なるものである。
さらに、このキシロースイソメラーゼの存在下、７５℃
以上の温度でかつ５〜７のｐＨでグルコースを異性化し
てフルクトース濃度の高い溶液を製造する。
メラーゼ遺伝子、テルムス アクアティカスのキシロー
スイソメラーゼ、及びこのキシロースイソメラーゼの製
造方法を提供する。さらに、得られたキシロースイソメ
ラーゼを用いて、高濃度のフルクトース溶液を、着色さ
せることなく製造する方法を提供する。 【構成】 高熱性細菌の一種であるテルムス アクアテ
ィカスのキシロースイソメラーゼ遺伝子の分離、同定、
クローニングする。クローニングして得たキシロースイ
ソメラーゼ遺伝子及びプロモーターを有するプラスミド
で形質転換した微生物を培養して得たキシロースイソメ
ラーゼを遺伝子工学的に製造する。得られたキシロース
イソメラーゼは、至適温度が約９５℃であり、マグネシ
ウムにより熱安定化され、天然のテルムス アクアティ
カスのキシロースイソメラーゼとは異なるものである。
さらに、このキシロースイソメラーゼの存在下、７５℃
以上の温度でかつ５〜７のｐＨでグルコースを異性化し
てフルクトース濃度の高い溶液を製造する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、テルムス アクアティ
カス(Thermus aquaticus) （以下、T.アクアティカスと
略記する）のキシロースイソメラーゼ遺伝子、この遺伝
子を用いて遺伝子工学的に製造したキシロースイソメラ
ーゼ、このキシロースイソメラーゼの製造方法、及びこ
のキシロースイソメラーゼを用いた高濃度のフルクトー
スの製造方法に関する。
カス(Thermus aquaticus) （以下、T.アクアティカスと
略記する）のキシロースイソメラーゼ遺伝子、この遺伝
子を用いて遺伝子工学的に製造したキシロースイソメラ
ーゼ、このキシロースイソメラーゼの製造方法、及びこ
のキシロースイソメラーゼを用いた高濃度のフルクトー
スの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】キシロースイソメラーゼは、Ｄ−キシロ
ースとＤ−キシルロースの相互変換を触媒する酵素であ
るが、同時にグルコースをフラクトースに変換する能力
も有し、工業的に重要である。
ースとＤ−キシルロースの相互変換を触媒する酵素であ
るが、同時にグルコースをフラクトースに変換する能力
も有し、工業的に重要である。
【０００３】一方、T.アクアティカスは、高熱性細菌の
一種であり、ＡＴＣＣ２７６３４の寄託番号が付されて
いる。また、T.アクアティカスは、テルムス テルモフ
ィルス(Thermus thermophilus)とも呼ばれる。
一種であり、ＡＴＣＣ２７６３４の寄託番号が付されて
いる。また、T.アクアティカスは、テルムス テルモフ
ィルス(Thermus thermophilus)とも呼ばれる。
【０００４】T.アクアティカスがキシロースイソメラー
ゼを産生することは、従来から知られていた〔Journal
of General Microbiology (1990), 136, 679-686参
照〕。T.アクアティカスは高熱性細菌であり、そのキシ
ロースイソメラーゼは、優れた耐熱性を有するクロスト
リジウム サーモハイドロスルフリカム（Clostridium
thermohydrosulfuricum)のキシロースイソメラーゼより
さらに高い耐熱性を有する。しかし、T.アクアティカス
のキシロースイソメラーゼを工業的に利用できる程大量
に製造する方法は知られていない。
ゼを産生することは、従来から知られていた〔Journal
of General Microbiology (1990), 136, 679-686参
照〕。T.アクアティカスは高熱性細菌であり、そのキシ
ロースイソメラーゼは、優れた耐熱性を有するクロスト
リジウム サーモハイドロスルフリカム（Clostridium
thermohydrosulfuricum)のキシロースイソメラーゼより
さらに高い耐熱性を有する。しかし、T.アクアティカス
のキシロースイソメラーゼを工業的に利用できる程大量
に製造する方法は知られていない。
【０００５】そこで、T.アクアティカスのキシロースイ
ソメラーゼ遺伝子を入手できれば、遺伝子工学の手法に
よりT.アクアティカスのキシロースイソメラーゼを多量
に製造することが可能となる。しかし、T.アクアティカ
スのキシロースイソメラーゼ遺伝子は、これまで採取、
同定、クローニングはされていなかった。そこで、T.ア
クアティカスのキシロースイソメラーゼの遺伝子の提供
が望まれていた。
ソメラーゼ遺伝子を入手できれば、遺伝子工学の手法に
よりT.アクアティカスのキシロースイソメラーゼを多量
に製造することが可能となる。しかし、T.アクアティカ
スのキシロースイソメラーゼ遺伝子は、これまで採取、
同定、クローニングはされていなかった。そこで、T.ア
クアティカスのキシロースイソメラーゼの遺伝子の提供
が望まれていた。
【０００６】ところで、従来の高フルクトースコーンシ
ロップ（ＨＦＣＳ）の生産温度は、イソメラーゼの耐熱
性から、６０℃に設定されている。生産物中のフラクト
ース濃度は化学平衡により決まり、６０℃において固定
化酵素法では４２〜４５％である。しかし、実用的に
は、フルクトース濃度を５５％まで上げられれば、清涼
飲料等の食品甘味料としてそのまま使用することができ
る。そこで、生産温度を８５℃にできれば、化学平衡が
フルクトース側に移動し、フルクトース濃度を５５％に
することが可能となる。
ロップ（ＨＦＣＳ）の生産温度は、イソメラーゼの耐熱
性から、６０℃に設定されている。生産物中のフラクト
ース濃度は化学平衡により決まり、６０℃において固定
化酵素法では４２〜４５％である。しかし、実用的に
は、フルクトース濃度を５５％まで上げられれば、清涼
飲料等の食品甘味料としてそのまま使用することができ
る。そこで、生産温度を８５℃にできれば、化学平衡が
フルクトース側に移動し、フルクトース濃度を５５％に
することが可能となる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明の第１の
目的は、T.アクアティカスのキシロースイソメラーゼ遺
伝子を提供することにある。
目的は、T.アクアティカスのキシロースイソメラーゼ遺
伝子を提供することにある。
【０００８】本発明の第２の目的は、T.アクアティカス
のキシロースイソメラーゼ遺伝子を用いた、耐熱性キシ
ロースイソメラーゼの効率的な製造方法を提供すること
にある。
のキシロースイソメラーゼ遺伝子を用いた、耐熱性キシ
ロースイソメラーゼの効率的な製造方法を提供すること
にある。
【０００９】本発明の第３の目的は、上記方法で得られ
た耐熱性キシロースイソメラーゼを用いて、化学平衡が
フルクトース側に移動する比較的高い温度で、グルコー
スを異性化して高濃度のフルクトースを製造する方法を
提供することにある。
た耐熱性キシロースイソメラーゼを用いて、化学平衡が
フルクトース側に移動する比較的高い温度で、グルコー
スを異性化して高濃度のフルクトースを製造する方法を
提供することにある。
【００１０】さらに、グルコースを異性化して高濃度の
フルクトースを製造する際に、イソメラーゼの活性を最
適化する目的で、通常、反応液のｐＨを調節する。しか
し、７を超えるｐＨ域では、得られるフルクトース溶液
が着色するという問題があった。そこで、本発明の第４
の目的は、上記方法で得られた耐熱性キシロースイソメ
ラーゼを用い、特定のｐＨ域でグルコースを異性化し
て、着色が比較的少ない高濃度のフルクトースを製造す
る方法を提供することにある。
フルクトースを製造する際に、イソメラーゼの活性を最
適化する目的で、通常、反応液のｐＨを調節する。しか
し、７を超えるｐＨ域では、得られるフルクトース溶液
が着色するという問題があった。そこで、本発明の第４
の目的は、上記方法で得られた耐熱性キシロースイソメ
ラーゼを用い、特定のｐＨ域でグルコースを異性化し
て、着色が比較的少ない高濃度のフルクトースを製造す
る方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者ら、まずT.アク
アティカスのキシロースイソメラーゼ遺伝子を採取し、
その塩基配列及びアミノ酸配列を決定するとともに、こ
の遺伝子のクローニング法を確立した。
アティカスのキシロースイソメラーゼ遺伝子を採取し、
その塩基配列及びアミノ酸配列を決定するとともに、こ
の遺伝子のクローニング法を確立した。
【００１２】さらに、クローニングにより得られたキシ
ロースイソメラーゼ遺伝子を用いて耐熱性キシロースイ
ソメラーゼを遺伝子工学的手法により効率的に製造する
方法を見出した。さらに、この遺伝子工学的に製造した
キシロースイソメラーゼが、予想外にも、T.アクアティ
カスから得られた天然に存在するキシロースイソメラー
ゼ〔Journal of General Microbiology (1990), 136, 6
79-686参照〕とは異なる、これよりさらに優れた特性を
有するものであることを見出した。
ロースイソメラーゼ遺伝子を用いて耐熱性キシロースイ
ソメラーゼを遺伝子工学的手法により効率的に製造する
方法を見出した。さらに、この遺伝子工学的に製造した
キシロースイソメラーゼが、予想外にも、T.アクアティ
カスから得られた天然に存在するキシロースイソメラー
ゼ〔Journal of General Microbiology (1990), 136, 6
79-686参照〕とは異なる、これよりさらに優れた特性を
有するものであることを見出した。
【００１３】加えて、本発明のキシロースイソメラーゼ
を用いることにより、従来知られている以上の高い温度
で、フルクトースを製造できること、及び７５℃以上の
温度でかつ５〜７のｐＨで異性化を行うことにより、着
色が極めて少ないｐＨ領域で高濃度のフルクトースを製
造できることを見出し本発明を完成した。
を用いることにより、従来知られている以上の高い温度
で、フルクトースを製造できること、及び７５℃以上の
温度でかつ５〜７のｐＨで異性化を行うことにより、着
色が極めて少ないｐＨ領域で高濃度のフルクトースを製
造できることを見出し本発明を完成した。
【００１４】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明のT.アクアティカスのキシロースイソメラーゼ遺伝
子は、例えば図１〜図５に示す塩基配列及びアミノ酸配
列を有する。
発明のT.アクアティカスのキシロースイソメラーゼ遺伝
子は、例えば図１〜図５に示す塩基配列及びアミノ酸配
列を有する。
【００１５】図１〜図５に示す塩基配列及びアミノ酸配
列は、T.アクアティカスのキシロースイソメラーゼ遺伝
子の１例であって、この遺伝子と一定以上の相同性を有
する遺伝子を用いてもキシロースイソメラーゼを得るこ
とができる。従って、本発明においては、このような観
点から、図１〜図５に示すキシロースイソメラーゼ遺伝
子のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有する遺伝子
をも、キシロースイソメラーゼ遺伝子として包含する。
この相同性が高い遺伝子を用いれば、それだけオリジナ
ルのキシロースイソメラーゼに近い酵素を得ることがで
きる。よって、好ましくは、図１〜図５に示すキシロー
スイソメラーゼ遺伝子のアミノ酸配列と７０％以上、よ
り好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上
の相同性を有するアミノ酸配列の遺伝子も包含する。
列は、T.アクアティカスのキシロースイソメラーゼ遺伝
子の１例であって、この遺伝子と一定以上の相同性を有
する遺伝子を用いてもキシロースイソメラーゼを得るこ
とができる。従って、本発明においては、このような観
点から、図１〜図５に示すキシロースイソメラーゼ遺伝
子のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有する遺伝子
をも、キシロースイソメラーゼ遺伝子として包含する。
この相同性が高い遺伝子を用いれば、それだけオリジナ
ルのキシロースイソメラーゼに近い酵素を得ることがで
きる。よって、好ましくは、図１〜図５に示すキシロー
スイソメラーゼ遺伝子のアミノ酸配列と７０％以上、よ
り好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上
の相同性を有するアミノ酸配列の遺伝子も包含する。
【００１６】T.アクアティカスのキシロースイソメラー
ゼ遺伝子は、例えば実施例に記載の方法で大腸菌へクロ
ーニングすることにより調製することができる。
ゼ遺伝子は、例えば実施例に記載の方法で大腸菌へクロ
ーニングすることにより調製することができる。
【００１７】T.アクアティカスのキシロースイソメラー
ゼは、上記キシロースイソメラーゼ遺伝子を、適当なプ
ロモーターとともにプラスミドに挿入し、微生物を形質
転換する。微生物に特に限定はないが、大腸菌、バチル
ス ブレビス（Bacillus brevis)、サッカロミセス セ
レビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、ストレプミセ
ス リビダンス(Streptomyces lividans) 又はバチルス
スブチリス（Bacillus subtilis)を例示することがで
きる。また、プロモーターは、これら微生物に適したも
のを用いればよい。
ゼは、上記キシロースイソメラーゼ遺伝子を、適当なプ
ロモーターとともにプラスミドに挿入し、微生物を形質
転換する。微生物に特に限定はないが、大腸菌、バチル
ス ブレビス（Bacillus brevis)、サッカロミセス セ
レビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、ストレプミセ
ス リビダンス(Streptomyces lividans) 又はバチルス
スブチリス（Bacillus subtilis)を例示することがで
きる。また、プロモーターは、これら微生物に適したも
のを用いればよい。
【００１８】大腸菌では、例えばｔａｃ−プロモーター
（Agric. Biol. Chem., 52(4), 983-988, 1988) 、ファ
ージＴ７プロモーター（F.W.Studier et al. Methods i
n Enzymol., 185, 60-84, 1989)を例示できる。具体的
には、上記キシロースイソメラーゼ遺伝子をプラスミド
ｐＵＳ１２に挿入し、このプラスミドで形質転換した大
腸菌を培養し、生成するキシロースイソメラーゼを採取
することにより製造することができる。プラスミドｐＵ
Ｓ１２は、渋井らにより開発されたプラスミドであっ
て、強力で、かつ発現制御が可能なｔａｃ−プロモータ
ーを有するプラスミドである（Agric. Biol. Chem., 52
(4), 983-988, 1988）。
（Agric. Biol. Chem., 52(4), 983-988, 1988) 、ファ
ージＴ７プロモーター（F.W.Studier et al. Methods i
n Enzymol., 185, 60-84, 1989)を例示できる。具体的
には、上記キシロースイソメラーゼ遺伝子をプラスミド
ｐＵＳ１２に挿入し、このプラスミドで形質転換した大
腸菌を培養し、生成するキシロースイソメラーゼを採取
することにより製造することができる。プラスミドｐＵ
Ｓ１２は、渋井らにより開発されたプラスミドであっ
て、強力で、かつ発現制御が可能なｔａｃ−プロモータ
ーを有するプラスミドである（Agric. Biol. Chem., 52
(4), 983-988, 1988）。
【００１９】バチルス ブレビスでは、ＨＷＰプロモー
ター（Adachi, T, Yamagata, H. etal. J. Bacteriol.,
171, 1010-1016, 1989) を用い、形質転換体を、例え
ばビーフエキストラクト、グルコース、ペプトン培地
（ｐＨ７．０）で３０℃で培養し、生成するキシロース
イソメラーゼを採取することにより製造することができ
る。
ター（Adachi, T, Yamagata, H. etal. J. Bacteriol.,
171, 1010-1016, 1989) を用い、形質転換体を、例え
ばビーフエキストラクト、グルコース、ペプトン培地
（ｐＨ７．０）で３０℃で培養し、生成するキシロース
イソメラーゼを採取することにより製造することができ
る。
【００２０】サッカロミセス セレビシアエでは、ＰＧ
Ｋ（ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のプロモータ
ー) 、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼのプロモー
ター)、ＧＡＰ（グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲ
ナーゼのプロモーター）（L. Guarente, M. Ptashue, P
roc, Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2199-2203, 1988) を
用い、形質転換体を、例えば０．３％酵母エキストラク
ト、２％シュークロース、０．５％ペプトン、０．１％
無機塩類KH2PO4、０．０５％MgSO4 ・7H2Oの培地（ｐＨ
５．５）で３０℃で培養し、生成するキシロースイソメ
ラーゼを採取することにより製造することができる。
Ｋ（ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のプロモータ
ー) 、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼのプロモー
ター)、ＧＡＰ（グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲ
ナーゼのプロモーター）（L. Guarente, M. Ptashue, P
roc, Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2199-2203, 1988) を
用い、形質転換体を、例えば０．３％酵母エキストラク
ト、２％シュークロース、０．５％ペプトン、０．１％
無機塩類KH2PO4、０．０５％MgSO4 ・7H2Oの培地（ｐＨ
５．５）で３０℃で培養し、生成するキシロースイソメ
ラーゼを採取することにより製造することができる。
【００２１】ストレプミセス リビダンス(Streptomyce
s lividans) ６６では、ｇｙｌＰ１（グリセロールキナ
ーゼＰ１遺伝子）プロモーター（E.T.Seno et al. Mol.
Gen. Genet., 193, 119-125, 1984) 、ｅｒｍＥＰ１
（エリスロマイシン耐性遺伝子ＥＰ１）プロモーター
（C.J.Thompson et al., J. Bioteriol, 151,678-687,
1983)を用い、形質転換体をC.J.トンプソン（Thompso
n）らの方法により培養し、生成するキシロースイソメ
ラーゼを採取することにより製造することができる。
s lividans) ６６では、ｇｙｌＰ１（グリセロールキナ
ーゼＰ１遺伝子）プロモーター（E.T.Seno et al. Mol.
Gen. Genet., 193, 119-125, 1984) 、ｅｒｍＥＰ１
（エリスロマイシン耐性遺伝子ＥＰ１）プロモーター
（C.J.Thompson et al., J. Bioteriol, 151,678-687,
1983)を用い、形質転換体をC.J.トンプソン（Thompso
n）らの方法により培養し、生成するキシロースイソメ
ラーゼを採取することにより製造することができる。
【００２２】このようにして遺伝子工学的手法により得
られた本発明のキシロースイソメラーゼは、予想外にも
従来知られていた天然のキシロースイソメラーゼ〔Jour
nalof General Microbiology (1990), 136, 679-686〕
とは、異なるものであり、新規なキシロースイソメラー
ゼであることが判明した。
られた本発明のキシロースイソメラーゼは、予想外にも
従来知られていた天然のキシロースイソメラーゼ〔Jour
nalof General Microbiology (1990), 136, 679-686〕
とは、異なるものであり、新規なキシロースイソメラー
ゼであることが判明した。
【００２３】本発明のキシロースイソメラーゼの特徴
は、至適ｐＨが約７であり、安定ｐＨ範囲が約６〜８．
５であり、マンガン又はマグネシウムで熱安定化され、
コバルトで熱不安定化され、約９５℃に至適温度があ
り、分子量が約４４０００であることである。
は、至適ｐＨが約７であり、安定ｐＨ範囲が約６〜８．
５であり、マンガン又はマグネシウムで熱安定化され、
コバルトで熱不安定化され、約９５℃に至適温度があ
り、分子量が約４４０００であることである。
【００２４】一方、上記の天然のキシロースイソメラー
ゼは、至適ｐＨが５．５〜８．５と広い範囲にあり、安
定ｐＨ範囲も６〜９である。又、金属に対しては、マン
ガン又はコバルトで熱安定化される。しかし、マグネシ
ウムでは熱安定化されず、むしろ不安定になり、本発明
のキシロースイソメラーゼのようにマグネシウムによっ
て、熱安定化されることはない。至適温度は約８５℃で
あって、本発明のキシロースイソメラーゼより約１０℃
低い。分子量は５００００であって、本発明のキシロー
スイソメラーゼより明らかに大きい。
ゼは、至適ｐＨが５．５〜８．５と広い範囲にあり、安
定ｐＨ範囲も６〜９である。又、金属に対しては、マン
ガン又はコバルトで熱安定化される。しかし、マグネシ
ウムでは熱安定化されず、むしろ不安定になり、本発明
のキシロースイソメラーゼのようにマグネシウムによっ
て、熱安定化されることはない。至適温度は約８５℃で
あって、本発明のキシロースイソメラーゼより約１０℃
低い。分子量は５００００であって、本発明のキシロー
スイソメラーゼより明らかに大きい。
【００２５】本発明のキシロースイソメラーゼと天然の
キシロースイソメラーゼとは、同じT.アクアティカスを
起源とするにも関わらず、異なる酵素である。この理由
は、あくまでも推論であるが、以下のように考えられ
る。天然のキシロースイソメラーゼは、T.アクアティカ
スから直接採取されたものである。それに対し、本発明
のキシロースイソメラーゼは、T.アクアティカスから採
取した遺伝子から遺伝子工学的に得たものである。その
ため、T.アクアティカスが２種以上のキシロースイソメ
ラーゼ遺伝子を保持し、本発明では、天然のキシロース
イソメラーゼとは異なるキシロースイソメラーゼの遺伝
子を採取した可能性がある。
キシロースイソメラーゼとは、同じT.アクアティカスを
起源とするにも関わらず、異なる酵素である。この理由
は、あくまでも推論であるが、以下のように考えられ
る。天然のキシロースイソメラーゼは、T.アクアティカ
スから直接採取されたものである。それに対し、本発明
のキシロースイソメラーゼは、T.アクアティカスから採
取した遺伝子から遺伝子工学的に得たものである。その
ため、T.アクアティカスが２種以上のキシロースイソメ
ラーゼ遺伝子を保持し、本発明では、天然のキシロース
イソメラーゼとは異なるキシロースイソメラーゼの遺伝
子を採取した可能性がある。
【００２６】本発明の新規なキシロースイソメラーゼ
は、フルクトースとグルコースの異性化を触媒し、活性
は、例えば以下の方法により測定される。即ち、０．１
〜０．４Ｕのキシロースイソメラーゼを８５℃で１ｍｌ
の１００ｍＭヘペス、ｐＨ７、４００ｍＭフルクトー
ス、１０ｍＭＭｎＣｌ2 水溶液中でインキュベートす
る。グルコースの生成量は、グルコースオキシダーゼ分
析法（グルコースＢ−テスト、和光社製）により２０μ
ｌのサンプルを分析して求める。１ユニットは、上記条
件下で１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素
量と定義する。
は、フルクトースとグルコースの異性化を触媒し、活性
は、例えば以下の方法により測定される。即ち、０．１
〜０．４Ｕのキシロースイソメラーゼを８５℃で１ｍｌ
の１００ｍＭヘペス、ｐＨ７、４００ｍＭフルクトー
ス、１０ｍＭＭｎＣｌ2 水溶液中でインキュベートす
る。グルコースの生成量は、グルコースオキシダーゼ分
析法（グルコースＢ−テスト、和光社製）により２０μ
ｌのサンプルを分析して求める。１ユニットは、上記条
件下で１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素
量と定義する。
【００２７】本発明のキシロースイソメラーゼの精製
は、実施例にも記載されているように、以下のように行
われる。本発明のキシロースイソメラーゼ遺伝子を含む
プラスミドで形質転換した形質転換体を培養して得られ
た菌体を、遠心分離により集め、２mlの１０ｍＭのＭｎ
Ｃｌ2 及び４００ｍＭのフルクトースを含有する１００
ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、
超音波により分解し、残渣を遠心分離で除去する。菌抽
出物は、８５℃で１０分間加熱し、変性したタンパク質
は遠心分離により除去する。上澄み液は、５００容量の
５０ｍＭヘペス、ｐＨ７、５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液に２
回及びＥＤＴＡを含まない緩衝液に２回それぞれ限外濾
過することにより精製する。
は、実施例にも記載されているように、以下のように行
われる。本発明のキシロースイソメラーゼ遺伝子を含む
プラスミドで形質転換した形質転換体を培養して得られ
た菌体を、遠心分離により集め、２mlの１０ｍＭのＭｎ
Ｃｌ2 及び４００ｍＭのフルクトースを含有する１００
ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、
超音波により分解し、残渣を遠心分離で除去する。菌抽
出物は、８５℃で１０分間加熱し、変性したタンパク質
は遠心分離により除去する。上澄み液は、５００容量の
５０ｍＭヘペス、ｐＨ７、５ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液に２
回及びＥＤＴＡを含まない緩衝液に２回それぞれ限外濾
過することにより精製する。
【００２８】本発明のキシロースイソメラーゼは、分子
量が約４４０００であり、その遺伝子は３８７個のアミ
ノ酸からなるポリペプチドである。このキシロースイソ
メラーゼは、マンガン又はマグネシウムにより、酵素の
熱安定性が、金属を添加しない場合に比べて向上し、そ
れに対してコバルトを添加すると、金属を添加しない場
合に比べて酵素の熱安定性は悪化する。本発明のキシロ
ースイソメラーゼは、約９５℃に最適温度を有する。
量が約４４０００であり、その遺伝子は３８７個のアミ
ノ酸からなるポリペプチドである。このキシロースイソ
メラーゼは、マンガン又はマグネシウムにより、酵素の
熱安定性が、金属を添加しない場合に比べて向上し、そ
れに対してコバルトを添加すると、金属を添加しない場
合に比べて酵素の熱安定性は悪化する。本発明のキシロ
ースイソメラーゼは、約９５℃に最適温度を有する。
【００２９】本発明では、上記キシロースイソメラーゼ
を用いて、７５℃以上、好ましくは８０℃以上の温度
で、グルコースを異性化させて高濃度のフルクトースを
製造する。反応温度は、化学平衡の観点から、高ければ
それだけフルクトース濃度も高まることから、可能な限
り高くすることが好ましい。上記遺伝子工学の手法を用
いて作製したT.アクアティカスのキシロースイソメラー
ゼは、約９５℃にイソメラーゼ活性の最適温度を有す
る。従って、酵素の活性の点からは、９５℃付近で反応
させることが好ましいが、実用的には、１００℃以下の
温度、好ましくは８０℃〜９５℃の範囲とすることが適
当である。
を用いて、７５℃以上、好ましくは８０℃以上の温度
で、グルコースを異性化させて高濃度のフルクトースを
製造する。反応温度は、化学平衡の観点から、高ければ
それだけフルクトース濃度も高まることから、可能な限
り高くすることが好ましい。上記遺伝子工学の手法を用
いて作製したT.アクアティカスのキシロースイソメラー
ゼは、約９５℃にイソメラーゼ活性の最適温度を有す
る。従って、酵素の活性の点からは、９５℃付近で反応
させることが好ましいが、実用的には、１００℃以下の
温度、好ましくは８０℃〜９５℃の範囲とすることが適
当である。
【００３０】一方、反応液のｐＨは、５〜７、好ましく
は５〜６．５とすることが、フルクトース溶液の着色を
抑制するという観点から効果的である。
は５〜６．５とすることが、フルクトース溶液の着色を
抑制するという観点から効果的である。
【００３１】尚、キシロースイソメラーゼによるグルコ
ースの異性化反応は、バッチ式あるいは固定化酵素法に
よる連続式で行うことができる。反応時間は、バッチ式
の場合、反応の規模にもよるが、例えば約１〜２４時間
とすることができる。また、固定化酵素法による連続式
の場合には、滞留時間を例えば約１分〜２４時間、好ま
しくは約５分〜３時間とすることができる。
ースの異性化反応は、バッチ式あるいは固定化酵素法に
よる連続式で行うことができる。反応時間は、バッチ式
の場合、反応の規模にもよるが、例えば約１〜２４時間
とすることができる。また、固定化酵素法による連続式
の場合には、滞留時間を例えば約１分〜２４時間、好ま
しくは約５分〜３時間とすることができる。
【００３２】
実施例１菌株 ： テルムス アクアティカスＨＢ８：ＡＴＣＣ２７６３４ 大腸菌ＪＭ１０９：ｒｅｃＡ１ｓｕｐＥ４４ｅｎｄＡ１
ｈｓｄＲ１７ｇｙｒＡ９６ｒｅ１Ａ１ｔｈｉ△（ｌａｃ
−ｐｒｏＡＢ）Ｆ’〔ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ+ ｌａｃ
Ｉq ｌａｃＺ△Ｍ１５〕
ｈｓｄＲ１７ｇｙｒＡ９６ｒｅ１Ａ１ｔｈｉ△（ｌａｃ
−ｐｒｏＡＢ）Ｆ’〔ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ+ ｌａｃ
Ｉq ｌａｃＺ△Ｍ１５〕
【００３３】生育条件 Ｔ．アクアティカス菌は、長張らの方法（Nagahari et
al. Gene, 10, 137-145, 1980)によって生育させた。大
腸菌細胞は、ビエイラらの方法（Vieira et al. Meth.
Enz. 1987, 153 (3-11))により２倍濃度のイーストエキ
ス・トリプトン培地(Difco) 中で３７℃で生育させた。
al. Gene, 10, 137-145, 1980)によって生育させた。大
腸菌細胞は、ビエイラらの方法（Vieira et al. Meth.
Enz. 1987, 153 (3-11))により２倍濃度のイーストエキ
ス・トリプトン培地(Difco) 中で３７℃で生育させた。
【００３４】クローニング及びシークエンシング操作 ゲノムＤＮＡは、斉藤の方法〔Saito, H. 及び Miura,
K. Preparation of transforming DNA by phenol treat
ment. Biochim. Biophys. Acta 1963, 72(619-629) 〕
により、T.アクアティカス細胞から抽出した。凍結ペレ
ット（0.４５ｇ）を２００mMNaCl、１００mMEDTA、５０
mMトリス−ＨＣｌ（pH8.０）4.５mlに溶解した。１０％
ＳＤＳ0.５mlを加え、混合物を６０℃１５分間ゆっくり
と回転させ、次いで６０℃３０分間 RNAse A （0.０５
mg／ml）で処理した。次に６０℃で６０分間プロテイナ
ーゼＫ（0.５mg／ml）で処理した。本溶菌液に等量のフ
ェノール液（トリス緩衝液で飽和したもの）を加え、変
性タンパク質を除去した。この処理を３回行った。残渣
を遠心分離（１０分間、１５０００rpm ）で除去した。
0.８容量のイソプロパノールを添加した後、ＤＮＡを巻
き取り、１mMEDTAを含む10mMトリス−ＨＣｌ（pH8.０）
1.５mlに溶解した。最後に、ＤＮＡをＤＥＡＥセルロー
スカラム（洗浄バッファー：５０mMトリス−ＨＣｌ、pH
8.０、１mMEDTA、0.１５ＭNaCl；溶出バッファー：５０
mMトリス−ＨＣｌ、pH8.０、１mMEDTA、１ＭNaCl）を用
いたアニオン交換体により精製した。
K. Preparation of transforming DNA by phenol treat
ment. Biochim. Biophys. Acta 1963, 72(619-629) 〕
により、T.アクアティカス細胞から抽出した。凍結ペレ
ット（0.４５ｇ）を２００mMNaCl、１００mMEDTA、５０
mMトリス−ＨＣｌ（pH8.０）4.５mlに溶解した。１０％
ＳＤＳ0.５mlを加え、混合物を６０℃１５分間ゆっくり
と回転させ、次いで６０℃３０分間 RNAse A （0.０５
mg／ml）で処理した。次に６０℃で６０分間プロテイナ
ーゼＫ（0.５mg／ml）で処理した。本溶菌液に等量のフ
ェノール液（トリス緩衝液で飽和したもの）を加え、変
性タンパク質を除去した。この処理を３回行った。残渣
を遠心分離（１０分間、１５０００rpm ）で除去した。
0.８容量のイソプロパノールを添加した後、ＤＮＡを巻
き取り、１mMEDTAを含む10mMトリス−ＨＣｌ（pH8.０）
1.５mlに溶解した。最後に、ＤＮＡをＤＥＡＥセルロー
スカラム（洗浄バッファー：５０mMトリス−ＨＣｌ、pH
8.０、１mMEDTA、0.１５ＭNaCl；溶出バッファー：５０
mMトリス−ＨＣｌ、pH8.０、１mMEDTA、１ＭNaCl）を用
いたアニオン交換体により精製した。
【００３５】ゲノムＤＮＡは、SacIを用いて消化した。
フラグメントは、0.４％アガロースゲル電気泳動で分画
した。ＤＮＡは、２５分間1.５ＭNaCl、0.５ＭNaOH中に
ゲルを浸すことにより変性した。ゲルは、３Ｍ酢酸ナト
リウム（pH5.５）で中和した。ＤＮＡは、エレクトロブ
ロッティング（３時間、２mA／cm2 ）によりナイロン膜
（Biodyne)に移し、８０℃で１時間処理した。このブロ
ットを、ストレプトミセス グリセオフスカス（Strept
omyces griseofuscus)Ｓ−４１キシロースイソメラーゼ
遺伝子から由来した32Ｐラベルされた２８７ヌクレオチ
ドBglIフラグメント（１０6 cpm/ml）を用いて５４℃で
ハイブリダイズさせた。このフラグメントは、バチルス
スブチリス（Bacillus subtilis ）、大腸菌、ストレ
プトミセス ビオラセオニガー(Streptomyces violaceo
niger)及びアンプラリエラ(Ampullariella) から得たキ
シロースイソメラーゼアミノ酸配列と比べると分かるよ
うに、２つの比較的高いホモロジー領域を含む。ハイブ
リダイゼーションの後、1.８Kb付近に単一のバンドが現
れた。
フラグメントは、0.４％アガロースゲル電気泳動で分画
した。ＤＮＡは、２５分間1.５ＭNaCl、0.５ＭNaOH中に
ゲルを浸すことにより変性した。ゲルは、３Ｍ酢酸ナト
リウム（pH5.５）で中和した。ＤＮＡは、エレクトロブ
ロッティング（３時間、２mA／cm2 ）によりナイロン膜
（Biodyne)に移し、８０℃で１時間処理した。このブロ
ットを、ストレプトミセス グリセオフスカス（Strept
omyces griseofuscus)Ｓ−４１キシロースイソメラーゼ
遺伝子から由来した32Ｐラベルされた２８７ヌクレオチ
ドBglIフラグメント（１０6 cpm/ml）を用いて５４℃で
ハイブリダイズさせた。このフラグメントは、バチルス
スブチリス（Bacillus subtilis ）、大腸菌、ストレ
プトミセス ビオラセオニガー(Streptomyces violaceo
niger)及びアンプラリエラ(Ampullariella) から得たキ
シロースイソメラーゼアミノ酸配列と比べると分かるよ
うに、２つの比較的高いホモロジー領域を含む。ハイブ
リダイゼーションの後、1.８Kb付近に単一のバンドが現
れた。
【００３６】SacIで消化したテルムスＤＮＡの1.８Kb±
0.５Kbのフラグメントは、ガラスミルク（glassmilk)を
用いた抽出により単離され、SacI消化された大腸菌ベク
ターpUC118と連結させた。コンピテント大腸菌ＪＭ１０
９細胞を連結したＤＮＡで形質転換した。所望のテルム
スＤＮＡを有するコロニーをＳ．グリセオフスカスプロ
ーブと形質転換体のコロニーとのハイブリダイゼーショ
ンにより検出した。ポジティブなシグナルを与えるコロ
ニーからアルカリ溶解法によりプラスミドＤＮＡを抽出
し、制限酵素による消化及びサザンハイブリダイゼーシ
ョンにより分析した。Ｓ．グリセオフスカスキシロース
イソメラーゼ遺伝子から得たプローブと強力にハイブリ
ダイズする1.８KbSacIフラグメントを得た。
0.５Kbのフラグメントは、ガラスミルク（glassmilk)を
用いた抽出により単離され、SacI消化された大腸菌ベク
ターpUC118と連結させた。コンピテント大腸菌ＪＭ１０
９細胞を連結したＤＮＡで形質転換した。所望のテルム
スＤＮＡを有するコロニーをＳ．グリセオフスカスプロ
ーブと形質転換体のコロニーとのハイブリダイゼーショ
ンにより検出した。ポジティブなシグナルを与えるコロ
ニーからアルカリ溶解法によりプラスミドＤＮＡを抽出
し、制限酵素による消化及びサザンハイブリダイゼーシ
ョンにより分析した。Ｓ．グリセオフスカスキシロース
イソメラーゼ遺伝子から得たプローブと強力にハイブリ
ダイズする1.８KbSacIフラグメントを得た。
【００３７】この1.８Kbフラグメントを、制限酵素を用
いて小さいフラグメントに分解した。これらのフラグメ
ントは、pUC118及びpUC119を用いて大腸菌ＪＭ１０９に
サブクローン化した。１本鎖ＤＮＡを前述のビエイラ(V
ieira)の方法に従って調製し、ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ（AmpliTaqTMシークエンシングキット：宝酒造）及び
７−デアザｄＧＴＰを用いてヌクレオチド配列を決定し
た。
いて小さいフラグメントに分解した。これらのフラグメ
ントは、pUC118及びpUC119を用いて大腸菌ＪＭ１０９に
サブクローン化した。１本鎖ＤＮＡを前述のビエイラ(V
ieira)の方法に従って調製し、ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ（AmpliTaqTMシークエンシングキット：宝酒造）及び
７−デアザｄＧＴＰを用いてヌクレオチド配列を決定し
た。
【００３８】T.アクアティカスのキシロースイソメラー
ゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を図１〜図５に示
す。尚、前記T.アクアティカス以外の菌から得られたキ
シロースイソメラーゼと本発明のT.アクアティカスのキ
シロースイソメラーゼとのアミノ酸配列の相同性は、表
１に示す通りである。
ゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を図１〜図５に示
す。尚、前記T.アクアティカス以外の菌から得られたキ
シロースイソメラーゼと本発明のT.アクアティカスのキ
シロースイソメラーゼとのアミノ酸配列の相同性は、表
１に示す通りである。
【００３９】
【表１】
【００４０】実施例２T.アクアティカス のキシロースイソメラーゼ遺伝子を以
下のようにして大腸菌発現ベクターｐＵＳ１２〔Agric.
Biol. Chem.,52(4), 983-988, 1988〕に挿入した。
下のようにして大腸菌発現ベクターｐＵＳ１２〔Agric.
Biol. Chem.,52(4), 983-988, 1988〕に挿入した。
【００４１】(a) まず、キシロースイソメラーゼのＣ末
端側をコードする６９０ｂｐSmaI断片（図１〜図５、８
４７番目から１５３６番目までの塩基）をｐＵＳ１２の
SmaI部位に挿入した。これをｐＵＳ１２Ｃとする。 (b) キシロースイソメラーゼのＮ末端側をコードする１
１５０ｂｐBbeI断片（図１〜図５、２３６番目から１３
８５番目までの塩基）の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
により平滑化し、ｐＵＣ１１８のSmaI部位に挿入した。
これをｐＵＣ１１８Ｎとする。 (c) ｐＵＣ１１８Ｎの挿入部位上流のBamHI 部位から挿
入断片のBamHI 切断部位（図１〜図５、１２５０番目の
塩基）までを含む１０２４ｂｐのBamHI 断片を(a) で構
築したｐＵＳ１２Ｃの挿入部位上流のBamHI 部位と挿入
断片中のBamHI 切断部位（図１〜図５、１２５０番目の
塩基）との間の断片と置き換えた。
端側をコードする６９０ｂｐSmaI断片（図１〜図５、８
４７番目から１５３６番目までの塩基）をｐＵＳ１２の
SmaI部位に挿入した。これをｐＵＳ１２Ｃとする。 (b) キシロースイソメラーゼのＮ末端側をコードする１
１５０ｂｐBbeI断片（図１〜図５、２３６番目から１３
８５番目までの塩基）の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
により平滑化し、ｐＵＣ１１８のSmaI部位に挿入した。
これをｐＵＣ１１８Ｎとする。 (c) ｐＵＣ１１８Ｎの挿入部位上流のBamHI 部位から挿
入断片のBamHI 切断部位（図１〜図５、１２５０番目の
塩基）までを含む１０２４ｂｐのBamHI 断片を(a) で構
築したｐＵＳ１２Ｃの挿入部位上流のBamHI 部位と挿入
断片中のBamHI 切断部位（図１〜図５、１２５０番目の
塩基）との間の断片と置き換えた。
【００４２】このようにして構築されたプラスミドｐＵ
ＳＴＸＩは、ｐＵＳ１２のBamHI 部位とSmaI断部位との
間に翻訳開始部位を含むキシロースイソメラーゼ遺伝子
全体が挿入されている。
ＳＴＸＩは、ｐＵＳ１２のBamHI 部位とSmaI断部位との
間に翻訳開始部位を含むキシロースイソメラーゼ遺伝子
全体が挿入されている。
【００４３】得られたプラスミドｐＵＳＴＸＩにより大
腸菌ＪＭ１０９を形質転換した形質転換体を、ビエイラ
らの方法（Vieira et al. Meth. Enz. 1987, 153 (3-1
1))により３mlの２倍濃度のイーストエキス・トリプト
ン培地(Difco) 中で３７℃で対数増殖期中期（Ａ６６０
ｃａ．1.０）まで生育させた。次いで、ｔａｃ−プロ
モーターを１ｍＭイソプロピル−チオガラクトサイド
（ＩＰＴＧ）の添加により活性化し、さらに2.５時間生
育させた。菌は、遠心分離により集め、２mlの１０ｍＭ
のＭｎＣｌ2 及び４００ｍＭのフルクトースを含有する
１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７）に溶
解し、超音波により分解し、残渣を遠心分離で除去し
た。菌抽出物は、８５℃で１０分間加熱し、変性したタ
ンパク質は遠心分離により除去した。
腸菌ＪＭ１０９を形質転換した形質転換体を、ビエイラ
らの方法（Vieira et al. Meth. Enz. 1987, 153 (3-1
1))により３mlの２倍濃度のイーストエキス・トリプト
ン培地(Difco) 中で３７℃で対数増殖期中期（Ａ６６０
ｃａ．1.０）まで生育させた。次いで、ｔａｃ−プロ
モーターを１ｍＭイソプロピル−チオガラクトサイド
（ＩＰＴＧ）の添加により活性化し、さらに2.５時間生
育させた。菌は、遠心分離により集め、２mlの１０ｍＭ
のＭｎＣｌ2 及び４００ｍＭのフルクトースを含有する
１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７）に溶
解し、超音波により分解し、残渣を遠心分離で除去し
た。菌抽出物は、８５℃で１０分間加熱し、変性したタ
ンパク質は遠心分離により除去した。
【００４４】熱処理菌抽出物２００μｌ中のキシロース
イソメラーゼ活性の分析は、１０ｍＭのＭｎＣｌ2 及び
４００ｍＭのフルクトースを含有する１００ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７）１ml中８５℃での生成
グルコース（グルコースＢ−テスト、ワコー）を決定す
ることにより行った。キシロースイソメラーゼの活性及
び培養液中の収率を表２に示す。
イソメラーゼ活性の分析は、１０ｍＭのＭｎＣｌ2 及び
４００ｍＭのフルクトースを含有する１００ｍＭトリエ
タノールアミン緩衝液（ｐＨ７）１ml中８５℃での生成
グルコース（グルコースＢ−テスト、ワコー）を決定す
ることにより行った。キシロースイソメラーゼの活性及
び培養液中の収率を表２に示す。
【００４５】比較のため、イソメラーゼ遺伝子を有さな
いベクターｐＵＣ１１９を運ぶ大腸菌を用いて得た熱処
理菌抽出物２００μｌ中のキシロースイソメラーゼ活性
培養液中の収率を表２に示す。
いベクターｐＵＣ１１９を運ぶ大腸菌を用いて得た熱処
理菌抽出物２００μｌ中のキシロースイソメラーゼ活性
培養液中の収率を表２に示す。
【００４６】
【表２】
【００４７】また、８５℃で１０分間加熱し、変性した
タンパク質は遠心分離により除去した菌抽出物の上澄み
液は、５００容量の５０ｍＭヘペス、ｐＨ７、５ｍＭ
ＥＤＴＡ緩衝液に２回及びＥＤＴＡを含まない緩衝液に
２回それぞれ限外濾過することにより精製して、本発明
のキシロースイソメラーゼを得た。
タンパク質は遠心分離により除去した菌抽出物の上澄み
液は、５００容量の５０ｍＭヘペス、ｐＨ７、５ｍＭ
ＥＤＴＡ緩衝液に２回及びＥＤＴＡを含まない緩衝液に
２回それぞれ限外濾過することにより精製して、本発明
のキシロースイソメラーゼを得た。
【００４８】実施例３ 本発明のキシロースイソメラーゼの至適ｐＨ、安定ｐＨ
範囲、金属による熱安定化、至適温度、及び分子量を測
定した。
範囲、金属による熱安定化、至適温度、及び分子量を測
定した。
【００４９】至適ｐＨ 本発明のキシロースイソメラーゼの８５℃における至適
ｐＨを、５０ｍＭ酢酸、５０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ’
−ビス（２−エタンスルホン酸）、５０ｍＭＮ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン
酸、５０ｍＭグリシン、４００ｍＭフルクトース、１０
ｍＭＭｇＣｌ2 の緩衝液中８５℃で０、８及び１６分間
インキュベートして求めた。各サンプルのｐＨは、Ｎａ
ＯＨで調節し、８０℃で決定した。グルコース生成量
は、グルコースＢ−テスト（和光社製）を用いて決定し
た。結果を図７に示す。
ｐＨを、５０ｍＭ酢酸、５０ｍＭピペラジン−Ｎ，Ｎ’
−ビス（２−エタンスルホン酸）、５０ｍＭＮ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン
酸、５０ｍＭグリシン、４００ｍＭフルクトース、１０
ｍＭＭｇＣｌ2 の緩衝液中８５℃で０、８及び１６分間
インキュベートして求めた。各サンプルのｐＨは、Ｎａ
ＯＨで調節し、８０℃で決定した。グルコース生成量
は、グルコースＢ−テスト（和光社製）を用いて決定し
た。結果を図７に示す。
【００５０】ｐＨ安定性 本発明のキシロースイソメラーゼの９０℃におけるｐＨ
安定性を、２５ｍＭ酢酸、２５ｍＭピペラジン−Ｎ，
Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、２５ｍＭＮ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスル
ホン酸、２５ｍＭグリシン、５ｍＭＭｇＣｌ2 の緩衝液
中９０℃で３０分間インキュベートして求めた。各サン
プルのｐＨは、ＮａＯＨで調節し、８０℃で決定した。
上記インキュベションの後、サンプル４０μｌを、７６
０μｌの１００ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７、４
００ｍＭフルクトース、１０ｍＭＭｇＣｌ2 の反応混合
液とともに、８５℃で０、８及び１６分間インキュベー
トして残存活性を測定した。グルコース生成量は、グル
コースＢ−テスト（和光社製）を用いて決定した。結果
を図８に示す。
安定性を、２５ｍＭ酢酸、２５ｍＭピペラジン−Ｎ，
Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）、２５ｍＭＮ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスル
ホン酸、２５ｍＭグリシン、５ｍＭＭｇＣｌ2 の緩衝液
中９０℃で３０分間インキュベートして求めた。各サン
プルのｐＨは、ＮａＯＨで調節し、８０℃で決定した。
上記インキュベションの後、サンプル４０μｌを、７６
０μｌの１００ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７、４
００ｍＭフルクトース、１０ｍＭＭｇＣｌ2 の反応混合
液とともに、８５℃で０、８及び１６分間インキュベー
トして残存活性を測定した。グルコース生成量は、グル
コースＢ−テスト（和光社製）を用いて決定した。結果
を図８に示す。
【００５１】金属による安定化 本発明のキシロースイソメラーゼの熱安定性に対する金
属（マンガン、マグネシウム、コバルト、各５ｍＭ）の
効果を測定するため、本発明のキシロースイソメラーゼ
を１００ｍＭヘペス、ｐＨ７、４００ｍＭフルクトー
ス、５ｍＭの各金属塩（ＭｎＣｌ2 、ＭｇＣｌ2 、Ｃｏ
Ｃｌ2 ）を加えた緩衝液中９０℃で３０分間、１時間、
２時間、３時間、４時間及び６時間インキュベートし
た。上記インキュベションの後、サンプル４０μｌを、
１ｍｌの１００ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７、４
００ｍＭフルクトース、１０ｍＭＭｇＣｌ2 の反応混合
液とともに、８５℃で８及び１６分間インキュベートし
て残存活性を測定した。グルコース生成量は、グルコー
スオキシダーゼを用いるグルコースＢ−テスト（和光社
製）を用いて決定した。結果を図９に示す。
属（マンガン、マグネシウム、コバルト、各５ｍＭ）の
効果を測定するため、本発明のキシロースイソメラーゼ
を１００ｍＭヘペス、ｐＨ７、４００ｍＭフルクトー
ス、５ｍＭの各金属塩（ＭｎＣｌ2 、ＭｇＣｌ2 、Ｃｏ
Ｃｌ2 ）を加えた緩衝液中９０℃で３０分間、１時間、
２時間、３時間、４時間及び６時間インキュベートし
た。上記インキュベションの後、サンプル４０μｌを、
１ｍｌの１００ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７、４
００ｍＭフルクトース、１０ｍＭＭｇＣｌ2 の反応混合
液とともに、８５℃で８及び１６分間インキュベートし
て残存活性を測定した。グルコース生成量は、グルコー
スオキシダーゼを用いるグルコースＢ−テスト（和光社
製）を用いて決定した。結果を図９に示す。
【００５２】至適温度（イソメラーゼ活性の温度依存
性） フルクトース４００ｍＭ、１００ｍＭトリエタノールア
ミン緩衝液（ｐＨ７）、Ｍｇ2+５０ｍＭ、Ｃｏ2+０．５
ｍＭの混合液に本発明のキシロースイソメラーゼを添加
した反応混合液を、６５、７０、７５、８０、８５、９
０及び９５℃でインキュベートした後、グルコースへの
転化率をグルコース−Ｂ−テスト（和光社製）を用いて
決定した。結果を、バチルス及びクロストリジウムのキ
シロースイソメラーゼのイソメラーゼ活性の温度依存性
の結果とともに図１０に示す。尚、バチルス及びクロス
トリジウムのキシロースイソメラーゼのイソメラーゼ活
性の温度依存性は、フルクトース４００ｍＭ、１００ｍ
Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７）、Ｍｇ2+５０
ｍＭの混合液にキシロースイソメラーゼを添加し、上記
と同様にして行った。
性） フルクトース４００ｍＭ、１００ｍＭトリエタノールア
ミン緩衝液（ｐＨ７）、Ｍｇ2+５０ｍＭ、Ｃｏ2+０．５
ｍＭの混合液に本発明のキシロースイソメラーゼを添加
した反応混合液を、６５、７０、７５、８０、８５、９
０及び９５℃でインキュベートした後、グルコースへの
転化率をグルコース−Ｂ−テスト（和光社製）を用いて
決定した。結果を、バチルス及びクロストリジウムのキ
シロースイソメラーゼのイソメラーゼ活性の温度依存性
の結果とともに図１０に示す。尚、バチルス及びクロス
トリジウムのキシロースイソメラーゼのイソメラーゼ活
性の温度依存性は、フルクトース４００ｍＭ、１００ｍ
Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７）、Ｍｇ2+５０
ｍＭの混合液にキシロースイソメラーゼを添加し、上記
と同様にして行った。
【００５３】分子量 本発明のキシロースイソメラーゼの分子量をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより測定した。その結果、分子量は４４２００
であること示した。この結果は、キシロースイソメラー
ゼ遺伝子のアミノ酸配列から算出される理論分子量４３
９００にほぼ合致する。
ＡＧＥにより測定した。その結果、分子量は４４２００
であること示した。この結果は、キシロースイソメラー
ゼ遺伝子のアミノ酸配列から算出される理論分子量４３
９００にほぼ合致する。
【００５４】実施例４ 本発明のキシロースイソメラーゼを用いて、グルコース
のフルクトースへの異性化を行った。フルクトース２５
％（ｗ／ｖ）、グルコース２５％（ｗ／ｖ）、ＭｎＣｌ
2 ５ｍＭ、１００ｍＭＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルフォリ
ノ）プロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ６．５、２５℃
で）の反応混合液を調製した。コントロールにはこの反
応混合液を用い、実施例にはこの反応混合液に１ｍｇ／
ｍｌのクローン耐熱性キシロースイソメラーゼを添加し
た。これらの溶液を、８０℃でインキュベートして、
０、２０、６０、１８０分にサンプリングした。サンプ
ルは、高速液体クロマトグラフィー（カラムULTRON PS8
0N（Shiwa Kako製）、温度５０℃、流速０．９ｍｌ／
分、移動相H2O ）で分析した。結果を、図１１に示す。
のフルクトースへの異性化を行った。フルクトース２５
％（ｗ／ｖ）、グルコース２５％（ｗ／ｖ）、ＭｎＣｌ
2 ５ｍＭ、１００ｍＭＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルフォリ
ノ）プロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ６．５、２５℃
で）の反応混合液を調製した。コントロールにはこの反
応混合液を用い、実施例にはこの反応混合液に１ｍｇ／
ｍｌのクローン耐熱性キシロースイソメラーゼを添加し
た。これらの溶液を、８０℃でインキュベートして、
０、２０、６０、１８０分にサンプリングした。サンプ
ルは、高速液体クロマトグラフィー（カラムULTRON PS8
0N（Shiwa Kako製）、温度５０℃、流速０．９ｍｌ／
分、移動相H2O ）で分析した。結果を、図１１に示す。
【００５５】実施例５ （フルクトース溶液の着色のｐ
Ｈ依存性） フルクトース２５％（ｗ／ｖ）、グルコース２５％（ｗ
／ｖ）、１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
５、６、７及び８）の混合液を、それぞれ８０℃で３時
間インキュベートした後、２００ｎｍにおける紫外線吸
収（Ａ２００）を分光光度計を用いて測定し、着色を調
べた。結果を、図１２に示す。図１２から、ｐＨ５〜７
の範囲で着色が少ないことが分かる。
Ｈ依存性） フルクトース２５％（ｗ／ｖ）、グルコース２５％（ｗ
／ｖ）、１００ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ
５、６、７及び８）の混合液を、それぞれ８０℃で３時
間インキュベートした後、２００ｎｍにおける紫外線吸
収（Ａ２００）を分光光度計を用いて測定し、着色を調
べた。結果を、図１２に示す。図１２から、ｐＨ５〜７
の範囲で着色が少ないことが分かる。
【００５６】
【発明の効果】本発明のT.アクアテカスのキシロスイソ
メラーゼ遺伝子を用いることにより、新規な耐熱性キシ
ロースイソメラーゼを大量に生産することができる。
メラーゼ遺伝子を用いることにより、新規な耐熱性キシ
ロースイソメラーゼを大量に生産することができる。
【００５７】さらに、このキシロースイソメラーゼは、
公知の天然のT.アクアテカスのキシロスイソメラーゼと
は異なり、特に食品添加物として許可されているマグネ
シウムにより熱安定性を向上させることができ、食品甘
味料として使用するフルクトースの製造に使用する上で
実用上極めて有用である。加えて、本発明のキシロース
イソメラーゼは、最適温度が公知の天然のT.アクアテカ
スのキシロスイソメラーゼより高い約９５℃にあり、フ
ルクトースの生産により有利である。
公知の天然のT.アクアテカスのキシロスイソメラーゼと
は異なり、特に食品添加物として許可されているマグネ
シウムにより熱安定性を向上させることができ、食品甘
味料として使用するフルクトースの製造に使用する上で
実用上極めて有用である。加えて、本発明のキシロース
イソメラーゼは、最適温度が公知の天然のT.アクアテカ
スのキシロスイソメラーゼより高い約９５℃にあり、フ
ルクトースの生産により有利である。
【００５８】また、本発明の耐熱性のキシロースイソメ
ラーゼを用いる本発明の方法によれば、高濃度のフルク
トース溶液をほとんど着色させることなく生産すること
ができる。
ラーゼを用いる本発明の方法によれば、高濃度のフルク
トース溶液をほとんど着色させることなく生産すること
ができる。
【図１】本発明のT.アクアティカスのキシロースイソメ
ラーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の一部を示
す。
ラーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の一部を示
す。
【図２】本発明のT.アクアティカスのキシロースイソメ
ラーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の一部を示
す。
ラーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の一部を示
す。
【図３】本発明のT.アクアティカスのキシロースイソメ
ラーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の一部を示
す。
ラーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の一部を示
す。
【図４】本発明のT.アクアティカスのキシロースイソメ
ラーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の一部を示
す。
ラーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の一部を示
す。
【図５】本発明のT.アクアティカスのキシロースイソメ
ラーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の一部を示
す。
ラーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の一部を示
す。
【図６】キシロースイソメラーゼ遺伝子を含むプラスミ
ドｐＵＳＴＸＩの構築法の模式図を示す。
ドｐＵＳＴＸＩの構築法の模式図を示す。
【図７】本発明のキシロースイソメラーゼの活性のｐＨ
依存性を示す。
依存性を示す。
【図８】本発明のキシロースイソメラーゼの安定性のｐ
Ｈ依存性を示す。
Ｈ依存性を示す。
【図９】本発明のキシロースイソメラーゼの熱安定性に
対する金属の影響を示す。
対する金属の影響を示す。
【図１０】キシロースイソメラーゼ活性の温度依存性を
示す。
示す。
【図１１】本発明のキシロースイソメラーゼを用いた、
グルコースのフルクトースへの異性化反応結果を示す。
グルコースのフルクトースへの異性化反応結果を示す。
【図１２】フルクトース溶液の着色のｐＨ依存性を示
す。
す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年１１月１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】
【表１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４６】
【表２】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】バチルス ブレビスでは、ＣＷＰプロモー
ター（Ａｄａｃｈｉ，Ｔ，Ｙａｍａｇａｔａ，Ｈ．ｅｔ
ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１，１０１０−
１０１６，１９８９）を用い、形質転換体を、例えばビ
ーフエキストラクト、グルコース、ペプトン培地（ｐＨ
７．０）で３０℃で培養し、生成するキシロースイソメ
ラーゼを採取することにより製造することができる。
ター（Ａｄａｃｈｉ，Ｔ，Ｙａｍａｇａｔａ，Ｈ．ｅｔ
ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１，１０１０−
１０１６，１９８９）を用い、形質転換体を、例えばビ
ーフエキストラクト、グルコース、ペプトン培地（ｐＨ
７．０）で３０℃で培養し、生成するキシロースイソメ
ラーゼを採取することにより製造することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 山形 秀夫 愛知県名古屋市千種区園山町２−22 園山 住宅１−305 (72)発明者 クン デツカー 愛知県名古屋市千種区新池町４−25 東山 レジデンス301号
Claims (8)
- 【請求項１】 テルムス アクアティカスのキシロース
イソメラーゼ遺伝子又はこの遺伝子とアミノ酸ベースで
６０％以上の相同性を有する遺伝子。 - 【請求項２】 テルムス アクアティカスがＡＴＣＣ２
７６３４の寄託番号を有する請求項１記載の遺伝子。 - 【請求項３】 至適ｐＨが約７であり、安定ｐＨ範囲が
約６〜８．５であり、マンガン又はマグネシウムで熱安
定化され、コバルトで熱不安定化され、約９５℃に至適
温度があり、分子量が約４４０００であるテルムス ア
クアティカスのキシロースイソメラーゼ。 - 【請求項４】 請求項１記載の遺伝子及びプロモーター
を有するプラスミドで形質転換した微生物を培養し、生
成するキシロースイソメラーゼを採取することを含むキ
シロースイソメラーゼの製造方法。 - 【請求項５】 微生物が大腸菌、バチルス ブレビス、
サッカロミセス セレビシアエ、ストレプミセス リビ
ダンス又はバチルス スブチリスである請求項４記載の
製造方法。 - 【請求項６】 請求項１記載の遺伝子及びｔａｃ−プロ
モーターを有するプラスミドで形質転換した大腸菌を培
養し、生成するキシロースイソメラーゼを採取すること
を含むキシロースイソメラーゼの製造方法。 - 【請求項７】 請求項３記載のキシロースイソメラーゼ
の存在下、グルコースを異性化してフルクトース生成さ
せることを含む、フルクトースの製造方法。 - 【請求項８】 グルコースの異性化を７５℃以上の温度
でかつ５〜７のｐＨで行う、請求項７記載の製造方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3178698A JPH0556789A (ja) | 1990-10-29 | 1991-06-24 | テルムス アクアテイカスのキシロースイソメラーゼ遺伝子、キシロースイソメラーゼ及びそれを用いたフラクトースの製造方法 |
| DE69130200T DE69130200T2 (de) | 1990-10-29 | 1991-10-25 | Xyloseisomerase-Gen von Thermus Aquaticus, Xyloseisomerase und Verfahren zur Herstellung von Fructose |
| AT91118264T ATE171215T1 (de) | 1990-10-29 | 1991-10-25 | Xyloseisomerase-gen von thermus aquaticus, xyloseisomerase und verfahren zur herstellung von fructose |
| EP91118264A EP0483691B1 (en) | 1990-10-29 | 1991-10-25 | Xyloseisomerase gene of thermus aquaticus, xyloseisomerase and process for preparation of fructose |
| KR1019910019269A KR100192746B1 (ko) | 1990-10-29 | 1991-10-29 | 테르무스 아쿠아티쿠스의 크실로스 이소머라제 유전자, 크실로스 이소머라제 및 그것을 사용한 플락토스의 제조방법 |
| TW080108516A TW199907B (ja) | 1990-10-29 | 1991-10-30 | |
| US08/112,630 US5411886A (en) | 1990-10-29 | 1993-08-27 | Xylose isomerase gene of Thermus aquaticus |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29106790 | 1990-10-29 | ||
| JP2-291067 | 1991-03-07 | ||
| JP3-67967 | 1991-03-07 | ||
| JP6796791 | 1991-03-07 | ||
| JP3178698A JPH0556789A (ja) | 1990-10-29 | 1991-06-24 | テルムス アクアテイカスのキシロースイソメラーゼ遺伝子、キシロースイソメラーゼ及びそれを用いたフラクトースの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0556789A true JPH0556789A (ja) | 1993-03-09 |
Family
ID=27299604
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3178698A Withdrawn JPH0556789A (ja) | 1990-10-29 | 1991-06-24 | テルムス アクアテイカスのキシロースイソメラーゼ遺伝子、キシロースイソメラーゼ及びそれを用いたフラクトースの製造方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5411886A (ja) |
| EP (1) | EP0483691B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0556789A (ja) |
| KR (1) | KR100192746B1 (ja) |
| AT (1) | ATE171215T1 (ja) |
| DE (1) | DE69130200T2 (ja) |
| TW (1) | TW199907B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1008567A4 (en) * | 1997-07-23 | 2000-06-14 | Hamamatsu Photonics Kk | PROCESS FOR GLUING GLASS ELEMENTS |
Families Citing this family (6)
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|---|---|---|---|---|
| GB9502413D0 (en) * | 1995-02-08 | 1995-03-29 | Primalco Ltd | Xylose isomerase |
| SE9901298D0 (sv) | 1999-04-09 | 1999-04-09 | Forskarpatent I Syd Ab | Xylose isomerase with improved kinetic properties |
| EP1922408A1 (en) * | 2005-09-06 | 2008-05-21 | Cargill, Incorporated | Thermostable xylose isomerase enzyme |
| US20100234581A1 (en) * | 2005-09-06 | 2010-09-16 | Luigi Concilio | Thermostable xylose isomerase enzymes |
| EP1857552A1 (en) * | 2006-05-20 | 2007-11-21 | Cargill Incorporated | Thermostable xylose isomerase enzyme |
| CN107849514A (zh) | 2015-07-13 | 2018-03-27 | 玛拉可再生能源公司 | 增强木糖的微藻代谢 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5934119B2 (ja) * | 1978-12-12 | 1984-08-20 | 三菱油化株式会社 | クレアチンキナ−ゼ測定用組成物 |
| US4593001A (en) * | 1984-01-09 | 1986-06-03 | Nabisco Brands, Inc. | High temperature isomerization process |
| US4889818A (en) * | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| AU2421588A (en) * | 1987-08-11 | 1989-03-09 | Cetus Corporation | Procaryotic xylose isomerase muteins and method to increase protein stability |
| US5041378A (en) * | 1987-08-11 | 1991-08-20 | Cetus Corporation | Procaryotic xylose isomerase muteins |
| EP0351029B1 (en) * | 1988-07-15 | 2002-03-06 | Genencor International, Inc. | Novel glucose isomerase enzymes and their use |
| EP0352474A3 (en) * | 1988-07-19 | 1992-04-29 | Stabra Ag | Thermostable glucose isomerase |
| EP0436502B1 (en) * | 1990-01-04 | 2005-11-16 | Genencor International, Inc. | Novel glucose isomerases with an altered pH optimum |
| DK1264883T3 (da) * | 1990-01-04 | 2010-07-19 | Danisco Us Inc | Glucoseisomeraser med ændret substratspecificitet |
-
1991
- 1991-06-24 JP JP3178698A patent/JPH0556789A/ja not_active Withdrawn
- 1991-10-25 DE DE69130200T patent/DE69130200T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-10-25 AT AT91118264T patent/ATE171215T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-25 EP EP91118264A patent/EP0483691B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-29 KR KR1019910019269A patent/KR100192746B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-10-30 TW TW080108516A patent/TW199907B/zh active
-
1993
- 1993-08-27 US US08/112,630 patent/US5411886A/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1008567A4 (en) * | 1997-07-23 | 2000-06-14 | Hamamatsu Photonics Kk | PROCESS FOR GLUING GLASS ELEMENTS |
| US6314759B1 (en) | 1997-07-23 | 2001-11-13 | Hamamatsu Photonics K.K. | Method of bonding glass members |
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|---|---|
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| DE69130200T2 (de) | 1999-05-20 |
| TW199907B (ja) | 1993-02-11 |
| EP0483691A3 (en) | 1993-04-07 |
| KR100192746B1 (ko) | 1999-06-15 |
| US5411886A (en) | 1995-05-02 |
| EP0483691B1 (en) | 1998-09-16 |
| DE69130200D1 (de) | 1998-10-22 |
| KR920008189A (ko) | 1992-05-27 |
| ATE171215T1 (de) | 1998-10-15 |
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