19990? 經濟部中央標準局貝工消费合作杜印製 五、發明説明（3 [産業上之利用領域] 本發明係有關水生棲熱菌（Thermus aquaticus)之木 糖異構酶遣傳子，使用此遣傳子以遣傳基因工程方式製造 木糖異構酶，此種木糖異構酶之製造方法及使用此木糖異 構酶製造高濃度果糖之方法。 I習知技術] 木糖異構酶偽催化D-木搪與D -木31糖（D-xylu丨ose) 相互轉換的酵素，惟同時亦具有將葡萄糖轉換成果糖之能 力，在工業上甚為重要。 另一方面，水生棲熱菌兔一種高熱性細菌，被賦與 A T C C 2 7 6 3 4之寄存號碼3此外，水生棲熱菌亦稱作水生瞎 熱菌（Thermus thermophilus)。 水生棲熱菌可産生木糖異構酶，偽屬習知[參考 Journal of General Microbiology ( 1 9 9 0 ) , 1 3 6. 6 7 9 - 686)。水生棲熱菌為高熱性细菌，其木糖異構酶為具有較 優越的耐熱性之熱氫硫梭菌（C 1 〇 s t r ί d i u m the「niohydrosulfu「icuni)之木糖異構_ ,有更高的耐熱性 〇然而，工業上大量製造水生棲熱菌之木糖異構_之方法 則並未為人知。 因此，若能取得水生棲熱菌之木糖異構酶，則可利用 遣傳基因工程之操作步驟大量製造水生棲熱菌之木糖異構 _。然而水生悽熱菌之木糖異構酶遣傳基因至目前為止仍 無法選取、檢定，選殖3因此水生棲熱菌之木糖異構_之 遣傳基因仍期待能被提出： (請先閲讀背而之注意事項再项"本頁) 本紙張尺度A用中a困家楳準(CNS) T4規格（210x297公龙) 3 19990? A 6 Ιϊ 6 經濟部屮央標準局员工消伢合作杜印製 五、發明説明（4) 然而，習知之高果糖玉 因為異構酶之耐熱性而設定 由化學平衡決定，於60¾時 然而，實用上，若能提高果 作清涼飲料等之食品甜味劑 85 t時，則化學平衡向果糖 糖濃度。 [發明欲解決的課題] 因此本發明之第 異構_遣傳基因， * 本發明之第2値目的為 的製造耐熱性木糖異構_之 本發明之第3痼目的為 異構酶，在化學平衡向果糖 搪異構化以製造高濃度之果 進一步，當》萄搪異構 為使異構酶逹最適當之活性 ,在超過PH7之範圍時，所 問題。因此，本發明之第4 製得的酎熱性木糖異構SS , 溝化，以製造出著色較少的 [為解決課題而採之手段] 本發明人等，首先選取 基因，在決定出其鹼基序列 米糖漿（HFCS)之生産溫度，偽 成60 C。産物中之果糖濃度偽 用固定化酵素法為4 2〜4 5 %。 糖濃度至5 5 %時，則可直接當 。因此，若能提高生産溫度至 側移動，即有可能製出5 5 %果 1個目的乃為提供水生棲熱菌之木糖 提供採用水生棲熱菌，有效率 方法。 提供採用上述方法製得的木糖 側移動的較高溫度下，使葡萄 搪的方法。 化以製造高濃度之果糖之際， ，通常調整反應液之pH。然而 得的果搪溶液則有所諝箸色的 ί固目的，為提供採用上述方法 在待定的pH範圍内使葡萄糖異 高濃度果搪之方法。 水生棲熱菌之木搪異構酶遣傳 及胺基酸序列之同時，確立出 (請先閲請背而之注意事項再艰寫本頁) 裝· 訂_ 線- t紙5lt尺度边用中B困家楳準(CNS) T4規格(210x297公;it) 4 1999〇> Λ 6 Β6 五、發明説明（5) 此遣傳基因之選殖法。 經濟部屮央櫺準局ΚΪ：工消奸合作杜印製 (請先閲讀背而之注意事項洱项窍本頁) 因方出酷， 之 可 有 菌基 α 糖傳高構異， 基之 ，構36知且内 具 熱傳酶木遣性異搪上 傳 _ 酶異 習度圍 為 棲遣構之的同糖木以 遣構構糖 }’ 在溫範 ， 生此異示性相木之 ％ 。 酶異異木90現之ΡΗ因 水與糖所同一之示80因 構糖糖的19。發上的 基 。為有木]5相此源所為基 '' 圖 5 異木木在 性 ，以少 傳列列具得 之用起 佳傳 搪性的存 S 持酶 P 極 遣序序用可 1 上採近 較遣 木熱造然10的構75色 酸酸採亦圖以當接卜 ，之 的耐製天10越異在著 ，，明構基基使 ，與 3 :得圖上列 得出式的Ob優糖可在明說異胺胺即因 ，60因製如以序 而造方得cr更木及 ，發的糖及及 ，基知 有基可有 ％ 酸 51製程所Ml有之 ，fc 本細木 列列洌 傳可列傳亦括70基 選的工菌 1 具明糖構成詳之序序一遣點序遣此包列胺 由率因熱ra此發果異完以菌基基之的觀薛酶如為序之 用效基棲ne較本 出行以予熱鹼鹼因性此基構僅宜酸性 採有傳生Ge現用造進 -明棲之之基同由胺異雖較基同 出程遣水 f 發採製内糖發生示示傳相 ，之糖則 ，胺相 找 工以由 σ ，於可圍果本水所所遣之 明因木 ，此之上 ,因此與al同由 ，範之就之153501上發基為時因因以 Π 圖圖 步基 , 不 ，下之度 ’明 構以本傳作因 。基 ％ 一 傳且的0U6J之度 7 濃下發 11 異定於遣可基素傳90 進遣甚料^J68加溫 ~高以本圖圖搪固 ，酶亦傳酵 遣為 以 。意纟9-高 5 出 如 木有此構因遣之II佳 7* , 法乎 L6 較 P 製 例 之因因異基的 _ 構更 本紙張尺度逍用中a B家標準（CNS)T4規格（210X297公；t) 5 1999G? 經濟部屮央標準局员工消伢合作杜印製 Λ 6 ___Π_6 五、發明説明（6) 進一步，本發明之木糖異構酶遣傳基因，包含得自水 生捿熱_以外之棲熱菌（LheJim u s )屬之微生物之遣傳基因 。棲熱菌屬之微生物之例子，可列舉出黃色棲熱菌（ T h a.r m u s f.l a v u s ),乳色棲熱菌（Th e r m u s 1 a c t e u s ),红色 棲熱菌（T ,h e r m u s r u b e n s )，棲熱菌種（T h e r m u s s p . ) 0 . 水生捿熱菌之木糖異構_遣傳基因，如實施例記載之 方法，依選殖大腸菌之方式而製得C 水生棲熱菌之木搪異構酶，傜將上述木糖異構酶遣傳 基因與適當的啓動基因同時插入質體内，使擻生物行轉形 作用3微生物雖無持別的限制，但可例示出大腸菌、短捍 菌（Bacillus brevis) > 啤酒酵母菌（Saccharornypoy； c e r-.s y i s i a e )、青黑色鏈徽菌（StrePtomyces 1 i v i d a n s )或 祜草捍菌（B..3 c i 1 i u s s u b t i 1 i s )。此外，啓動基因，採用 適於此等徹生物者即可。 至於大腸菌，可例示出tac-啓動基因（Agric, Beol, Chem.， 52(4), 983-938, 1938), T7 噬菌體啓動基因（ Phage T 7 promoter, F . V . Studier e t a 1 . Merthods in Enzymo 1 . , 18 5, 6 0-84, 1989):具體而言，將上述木 糖異構酶遣傳基因插入質體P U S 1 4内，培養以此質體行轉 形作用的大腸菌，而製造出所選取之木糖異構酶。質體 P !i S 1 2為澀井等人所開發，傺具有強力且可控制表現的 tac -啓動基因之質體 OrMc, Biol, Chera., 52(4), 983- 9 8 8, 1 9 8 8 ) 〇 至於祜草桿菌，ί系採用C W Ρ啓動基因（A d a c h i , Τ , (請先閲讀背而之注意事項#碼寫本頁) 本紙張尺度逍用中a國家揲準(CNS) Τ4規格（210x297公釐） 6 經濟部屮央標準局兵工消费合作杜印製
19990? Λ 6 ___Π_6_五、發明説明（7) Yamagata, H, e t a 1 . J. Bacteriol., 17 1, 1010-1016, 1989),例如在牛肉膏，葡萄糖，陳（peptone)培養基（PH 7.0)， 30t下培養轉形體，由生成之木糖異構酶而製造出 0 至於啤酒酵母菌，傺採用PGK (磷酸甘油酸激酶（ fhosphaglycerate Kinase.)遣傳基因之啓動基因），ADC ( 乙醇去氫酶之啓動基因），G A P (甘油醛脱氫酶之啓動基因 )(L. Guarente. M. Ptashue， Proc, Natl, Acad, Sci, U S A , 7 8 , 2 1 9 9 - 2 2 0 3， 1 9 8 3 )例如於 3 0 . 3 % 酵母提取 物，2 %蔗糖，0 . 5 %陳，0 . 1 %無機塩類〇 2 P 0 4 , 0 . 0 5 % MgS〇4， 7ff2〇之培養基（pH5.5)培養轉形體，由選取生成之 木糖異構酶而製造出， 呈於青黑色鍊徵窗（Streptomvces 1 i v i d a n s) 66 , 係 採用gyl PI (甘油激_?1遣傳基因）啓動基因（E. T. Seno e t . a 1 . Mol. Gen. Genet. , 193. 119-125, 1 9 8 4 ), ermEPl (紅徽菌耐性遣傳基因EP1)啓動基因（C. J. Thompson et. a I . , J. B i o t e r i o 1 , 1 5 1. 6 7 8 - 6 8 7, 1983)，利用C. J_ Thompson等氏之方法培養轉形體，由 選取生成之木糖異構酶而製造出。 利用遣傳基因工程方法製得之本發明之木糖異構酶， 出乎意料之外與習知的天然木糖異構酶[J 〇 u r n a 1 〇 f General Microbiology (1990), 1 3 6. 6 7 9 - 6 8 6 ]不同，經 判明係新穎的木搪異構闺； 本發明之木糖異搆®之持徵，最適pH约為7,安定pH (請先閱讀背而之注意事項#堝寫本頁) 裝- 訂· 線· 本紙張尺度遑用中國S家標準(CNS)T4規格(210X297公A) 7 19990? A 6 _ Π 6_ 五、發明説明（8)範圍約為6〜8.5,在錳或鎂中呈熱安定性，在鈷中呈熱不 約 量 子 分 V 5 9 為 約 度 溫 適 最 定 安 為 Η Ρ 適 最 其 酶 構 異 糖 木 然 天 之 述 上 面 方 一 6 在 亦 圍 範 Η Ρ 定 安 圍 範 泛 廣 之 屬 金 對 外 此 安 熱 呈 不 中 i 在 而 然 〇 性 定 安 熱 現 呈 中 鈷 或 錳 在 言 而 予酶 鎂構 為異 可糖 般木 酶之 構明 異發 糖本 木較 之 ， 明 '% 發85 本為 若約 不度 , 溫 定適 安最 不 〇 為化 反定 , 安 性熱 定·以 為 量 子 分 ο OC ο 'I 低 約 酶 fe»r 構 異 糖 木 之 明 發 本 較 然 顯 (請先閲讀背而之注意事項#项窵本頁) 大 為 為 列 序 酸 基 胺 端 末 警 之 _ 構 異 糖 木 之 然 天 步 I 進 裝- Γ e ο Γ ο Γ 異 糖 木 之 明 發 本 與 訂- 同 相 全 完 列 序 酸 基 胺 端 末 - N 之 酶 構 源 ， 於論 限推 不予 , 可 酶由 構理 異此 糖 。 木素 之酵 然的 天 同 與不 _ 偽 構 ， 異菌 搪熱 木棲 之生 明水 發之 本同 相 於 經濟部中央榀準局貝工消赀合作社印蚁 0 2 菌的有 熱得菌 棲取熱 生菌棲 水熱生 自棲水 選生 ， 接水此 直將因 可係 ο , , 得 構構法 異 異方 搪搪程 木木工 之之因 然 明基 天發傳 。 本遣 示 ，以 所的因 下對基 如相傳 取 選 匕匕 厶月 ο 可因 有基 則傳 明遣 發的 本 _ 於構 至異 , 糖 因木 基之 傳同 遣不 0 0 構構 異異 糖搪 木木 之之 上然 以天 el 74» 種 與 構 U 異42 T 搪 1 蔗ο 與將 糖 ， 果即 化亦 催 ： 偽定 . 測 II以 構予 異法 糖方 木述 穎下 新以 之可 明性 發活 本其 化 下 V 5 8 在 m 構 異 糖 木 之 搪 0< 3 ο 養 10培 之中 ml液 L 容 Η Ρ 0 化 氣 糖 萄0 用 利 本紙张尺度边用中S國家樣準(CNS)T4規格（210x297公釐） 8 19990? Λ 6 Π 6 五、發明説明（9) 分析法（Glucose B-Test,日本和光公司製造）分析2〇wl 之試樣而求得葡萄糖之生成量。1單位（unit),其定義為 上述條件下1分鐘内生成1 萄糖的酵素量。
本發明之木糖異構酶之精製，如實施例之記載，如下 所示予以施行。將包含本發明之木糖異構酶遣傳基因之質 體，經轉形作用之轉形體，經培養而得的菌體，以離心分 離方式予以收集，並溶於含有2ml之10mMMnCl2及400πιΜ果 糖之1 0 0 m Μ三乙醇胺缓衝液（ρ H 7 )内，利用超音波予以震 碎，以離心分離方式去除殘渣。菌萃取物在85t加熱10分 鐘，蛋白質用離心分離方式予以去除。上澄液，置於5 0 0 容量之50mM Hepes, pH7, EDTA缓衝液中，及不含EDTA 之缓衝液中，各作二次超過濾予以精製。 本發明之木糖異構其分子量約為44, 000,其遣傳 基因為387個胺基酸組成之聚肽。此木糖異構酶，錳或鎂 可影響此酵素之熱安定性，較不添加金屬的情形為高，相 對的若添加鈷，其酵素之熱安定性則較不添加金屬的情形 惡化：=本發明之木糖異構最適溫度約為9 5 t。 經濟部屮央櫺準局员工消费合作杜印製 (請先閲讀背而之注意事項孙靖寫本頁) 於本發明，採用上述木糖異構酶，在7 5 t以上，宜為 80t：以上之溫度，令葡萄搪異構化，以製造高濃度之果糖 3反應溫度，自化學平衡之觀點觀之，若予提高則可提高 果糖濃度，故以儘可能的提高為佳。採用上述遣傳基因工 程之操作步驟製得之水生棲熱菌之木糖異構酶，異構酶活 性之最適溫度約為95 t,因此，由酵素活性之觀點，在 9 5 左右反應為佳，惟在實用上，以1 0 0 €以下之溫度， 本紙Λ尺度边用中國國家標準（CNS)肀4規格(210X297公釐) 9 19990? A 6 Π 6 經濟部中央標準局员工消"合作社印製 五、發明説明（^ 宜為80t〜95°C之範圍較適當。 另一方面，反應液之pH為5〜7,惟自抑制果糖溶液之 著色的觀點而言，宜為pH 5〜6.5較具效果。 利用木糖異構酶引起的葡萄糖異構化反應，可以分批 式或利用固定化酵素法之連續式進行。反應時間，以分批 式之情形而言，係依反應規模而定，舉例而言可為約1〜 24小時。此外，利用固定化酵素法之連續式的情形，其滞 留時間，例如可約為1分鐘〜2 4小時，以約5分鐘〜3小 時為佳。 審旃例1 筒抶 水生棲熱菌（liLer 1 a.s l.gu,at.,,i,cus ) 08: ATCC 27634 大腸 @ JM 109: recAlsupEddendAllisdRlYgyrAg 6relAlthiA (lac-proAB)F' [traD36proAB + lacI9lacZAM 15] 牛#悠件 水生捿熱菌，偽依長張氏等人之方法（Nagahari et a 1 · C； e n e， ΙΑ, 1 3 7 - 1 4 5 , 1 9 8 0 )予以培養.： 大腸菌細胞，傜依Vieira氏等人之方法（Vieira et al· Meth. Enz. 1987， 153(3-11)),在 37t： 2 倍濃度之 酵母胥·胰化蛋陳培養基（D i f c 〇 )中予以培養。 蓰铕及席列橾作 基因組D N A ,傜利甩齊藤之方法[S a i t ο , Η .及M i u r a , K. Preparatior of transforming D N A by phenol 10 本紙張尺度边用中a S家標準(CNS)肀4規格(210X297公;《:) (請先閱讀背而之注意事項洱蜞寫本頁) 19990? Λ 6 Π 6 經濟部中央標準局κχ工消t合作杜印製 五、發明説明（Υ treatment. B i o c h i m . Biophys. Acta 1 9 6 3, 7 2 ( 6 1 9 - 629)],由水生棲熱_中抽出。將凍結錠片（〇.45g)溶解於 2 0 0ioM Ha C 1 , lOOmM EDTA, 50m M tris-HCl(pH8.0)4.5ml 内。加人10%SDS 0.5mU 使混合物在60t缓慢旋轉15分 鐘，其次在60t：以RNAseA(0.05mg/nil)處理30分鐘。其次 在6 0 C以蛋白酶K ( 0 . 5 m g / π 1 )處理6 0分鐘3在本溶菌液中 加入等量之酚液（經三缓衝液飽和者），以去除變性蛋白質 。進行此種處理三次，以_心分離方式去除殘渣（10分鐘， 1 5 0 0 0 r p m )。添加0 . 8容量之異丙醇後，抽取D N A ,溶於含 有 lmM EDTA之 10mH tris-HCl(pH8.0)1.5ral内。最後，利 用DEAE纖維素層柱（洗淨缓衝液：50niM tris-HCl, pH8.0, 1 m Μ E D T A , 0 . 1 5 Μ N a C 1 ;溶出缓衝液：5 0 m M t r i s - H C 1， PH8.0, lmM EDTA, 1M MaCl)之陰離子交換體精製DNA。 基因組D N A ,採用S a c 1予以分解：以0 . 4 %瓊脂糖凝謬 (a g a r· o s e g e 1 )電泳方式分副各片段：利用將凝膠浸入 1 . 5 m H a C 1 , 0 · 5 Μ N a 0 Η中2 5分鐘，使D N A變性。凝膠，則 以3 Μ醋酸納（p Η 5 , 5 )予以中和：利用電泳轉印（ electroblotting)方式（3 小時，2 mA/cm2)将 DNA移向耐 编膜（Biodyne),在80t處理1小時：採用取自暗灰色鏈 激菌（51；「6?1；〇1117〇63〖1'丨50〇!'115(；115)$-41木糖異構酶遣傳 基因之3 2 P標記的2 8 7核¥ B g 1 I片段（1 0 6 c p in / m 1 )在5 4 t： 與此轉印雜交。此一片段，若與枯草桿菌（Bacillus Subtills),大腸 @ ,紫黒色鏈徽菌（Streptomyces violaceoniger)及钣孢囊菌葛（Anipullariella)所得之木 11 本紙張尺度逡用中a面家《準(CNS)甲4規格(210X297公Λ) (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂- 線- 19990? Λ 6 Β6 五、發明説明（1ί 糖異構酶胺基酸序列相比，可知含有二個同種性較高之領 後 7-18 交sa乳 雜以璃 〇 玻 域用 分 利的 傜解 ，分 段 I 〇 片 C 帶之sa 條kb經 的δ與 1±0, 單 現 〇〇 單 出 1 以 近之予 附0取 b D k *、萃 8") 1.棲lk 在的ml , 解 s s 腸^ 0 b棲 的 pe要 om所 (C有 任含 勝對 接 。 連用 以作 〇 移 接轉 連行 相進 8 A 1 N *—- C 之 PU胞 體細 載09 菌1 腸JM 大菌· η e 之 間 落 菌 之 體 形 轉 與 針 探 _ 徽 鐽 色 灰 暗 用 利 落 菌 之 出 檢 以 A ， N 予 D 式體 方質 交出 雜取 萃 法 解 溶 鹼 用 利 落 菌 之 息 訊 正 予 給 由 以 予 式 方 交 雜 方 南 及 解 分 之 素 酵 制 限 用 利 探 的 得 · 而 因 基 傳 遣 酶 搆 。 異段 糖片 木 I 菌 C 微sa _〇 . k 色 8 灰1 暗的 由交 得雜 可力 〇 強 析與 分針 此 將 素 酵11 制 C 限PU 用 用 使使 傺 段 及
7 - Π c 之 A I { 7 述 i t 酶及 r合}^ ^ Μ cA.酒 09DNW 1 q本 M a J T B (請先閲讀背而之注意事項#蜞窍本頁) 片 等 此 ο 段 片 小 成 解 分 段 片 0 腸 大 成 殖 繁 性 無 代 繼 以 予 鐽 單 得 Z 3 製組列 法盒序 方列¥ 之序核 氏TH定 a q fcv Γ a Γ 以 e 用 使 經濟部屮央標準局貝工消#合作社印製 棲圖 生如 水列 序 酸 菌 熱 圖 基 胺 及 列 序 基 鹼 之 因 基 傳 遣 0 構 異 。 糖示 木所 -3 之 發 ， 本性 與同 _ 相 構之 異列 糖序 木酸 的基 得胺 所之 菌間 之 _ 外構 以異 菌糖 熱木 棲之 生菌 水熱 = 述棲示 前生所 由水 1 之表 明如 本紙张尺度逍W中β «家樣準(CNS) T4規格(210x297公;¢) 19930?
五、發明説明（1多 ^_L 擻牛物 灰色鏈徽菌 紫黑色鏈徽菌 瓶孢囊菌種 遊動放線菌（Actinoplanes missouriensis) 熱氫硫梭菌（Clostridium thermohydrosulfuricum) 産熱硫梭菌（Clostridiu® thermosulfurogenes) 祜草捍菌 大腸菌 相固袢 5 9 % 5 8 % 5 4%. 5 5 2Ί % 29 % 27 % 2 6 % (請先閲讀背而之注意事項#蜞寫本頁) 訂- 經濟部屮央標準局员工消铧合作社印蚁 將水生棲熱菌之木糖異構酶遣傳基因如下所示插入大 腸菌發現載體 pUS 12LAgric. Biol. Chem., 52(4), 983- 9 8 8 , 1 9 33]内 〇 (a )首先，將木搪異構酶之C末端側编碼之6 9 0 b ρ S m a I 片段（圖1〜圖5,自第847號至第1536號為止之鹼基）插入 P U S 1 2之S m a 1部位。以此作為p (J S 1 2 C 3 (b)將木糖異構酶之N末端側编碼之1150bp BbelH段 (圖1〜圖5，自第236號至第1385號為止之鹸基）之末端， 利用T 4 D N A聚合酶予以平整化，插入p U C 1 1 8之S m a 1部位 上3以此作為PUC 118N, 本紙張尺度逍用中S國家樣準(CHS)TM規格（210x297公Λ) 13 經濟部中央榣準局员工消费合作社印製 19930!> A 6 ___Ιϊ_6 五、發明説明（1 f (c)含有自pUC 118N之插人部位上游的BamHI部位至插 入片段之BaraHI切斷部分（圖1〜圖5,第1250號之鹼基）為 止之1024bp之BaraHI片段以（a)予以搆築的pUS 12C之插入 部位上游之BamHI部分與插人片段中之BamHI切斷.部位（圖 1〜圖5,第1250號之鹼基）間之片段予以取代。 . 如此所構築的質體p U S T X I ,為於p U S 1 2之B a m Η I部位 與S m a I切斷部位之間，插入含有轉譯開始部位之木糖異構 _遣傳基因整體。 利用所得的質體P U S Τ X I ,對大腸菌J Μ 1 0 9進行轉形作 用而得到之轉形體，依V i e i r a氏等人之方法（V ί e i r a e t 31.1^1^.£112.1987,153(3-11)在31111之2倍濃度酵母 膏，胰化蛋白陳培養基（D i f c o )中，於3 7 t：令其培養至對 數增殖期中期（A 6 6 0 C a . 1 · 0 ) 3其次，利用添加1 m Μ異丙 基硫代半乳糖¥ ( 1 P T G ),使t a c -啓動基因活化，再令其培 養2 . 5小時。菌則利用離心分離方式收集，溶解於含有 2ml之10mM之MnCl2及400mM之果糖的lOOmM三乙醇胺缓衝液 (P Η 7 )内，利用超音波予以裒碎，並用離心分離方式去除 殘渣：菌萃取物係在8 5 t加熱1 0分篷，受性的蛋白質則用 離心分離方式去除。 熱處理菌萃取物200/i 1中之木搪異構酶活性之分析， 則由含有1 0 m Μ之Μ n C 1 2及4 0 0 πι Μ果糖之1 0 0 m Μ三乙醇胺缓衝 液（pH7)lml中在85ΐ〇所生成之果塘量（ώ〇1ιι<:〇5θ-/9-T e s t ,日本和光公司製測定）予以決定。木糖異構_之活 性及培養液中之産率如表2所示。 (請先閲讀背而之注意事項再構寫本頁) 裝- 訂_ 線. 本紙張尺度遑用中a B家樣準(CNS)T4規格(210X297公*)
I9990V Λ (5 η 6 五、發明説明（1弓 ^_2 大腸菌 質體 活 性 u m 〇 1 /m i n mg 産 率 ϋ/ ϋ 培養液 p US ΤΧ I 3 . 9 450 P UC 119 0 . 1 10 (請先閲讀背而之注意事項再堺寫本頁) 經濟部中央橾準局β工消费合作社印製 此外，在85t加熱10分鐘，變性蛋白質經離心分離 方式予以去除後之菌萃取物之上澄液，係値別利用5 0 0容 量之50mM Hepes, pH7, 5mM EDTA缓衝液2次及不含EDTA 之缓衝液2次以超過濾方式予以精製，而得本發明之木糖 異構酶。 窨旃例3 測定本發明之木糖異構_之最適P Η ,安定p Η範圍，及 受金靥影響之熱安定性，最適溫度，及分子量。 滴恶度 本發明之木糖異構_ 8 5 f的最適ρ Η ,偽於5 0 :η Μ醋酸， 50πιΜ啦畊- Ν,Ν’-雙（2 -乙烷磺酸），50mM Ν-2 -羥乙基吡畊-N'-2-乙院礙酸，50mM甘胺酸，400mM果搪，lOraM MgCl2之 缓衝液中，於8 5 t培養0 . 8及1 6分鐘後予以求出。葡萄糖 生成量，傜用s 1 u c 〇 s e B - T e s t;(日本和光公司製測定儀決 定。其結果如圖7所7F。 本紙張尺度遑用中an家楳準（CNS)f 4規格(210x297公龙） 1 5 19990? A 6 B 6 經濟部屮央櫺準局员工消伢合作杜印製 五、發明説明（1备 DH^宙袢 本發明之木糖異構酶於90t的最適pH安定性，係於 25ιπΜ 醋酸，25mMatt 讲-Ν,Ν' -雙（2 -乙烷磺酸），25mM2 -羥 乙基吡畊- -乙烷磺酸，25mM甘胺酸，5mM MgCl2之缓 衝液中，於90°C培養30分鐘後予以求出。各試樣之pH,僳 以NaOH諝整，並在80 t：予以決定。上述培養之後，將試樣 40以1與760/zl之lOOmM三乙醇胺，pH7, 400mM果糖， lOOtnM MgCl2之反應混合液同時，在85t培養0.8及16分鐘 後測定殘存活性。果糖生成量，偽用glucose-/3-Test (日 本和光公司）製測定儀）予以決定：其結果如圖8所示。 夸余瞄聚塑 >安亩袢 為測定金屬（錳，鎂，鈷，各5 m Μ )對本發明之木糖異 構酶之熱安定性的影響，將本發明之木糖異構酶在添加有 10 0 m Μ -H e ρ ft s. pH7, 400mM杲糖，5mM之各金屬塩（MgCl2, Μ n C 1 2 , C o C 1 2 )之缓衝液中，於9 0 t培養3 0分鐘，1小時， 2小時，3小時，4小時及6小時。在上述培養之後，使 試樣4 0 w 1 ,與1 m 1之1 0 0 m Μ三乙醇胺，p Η 7 , 4 0 0 m Μ果糖， 1 0 m Μ M s C 1 2之反應混合液同時在8 5 ΰ培養8及1 6分鐘後， 測定殘存活性。Λ萄搪生成量，傺使用葡萄糖氧化酶之 glucose-/^ -Test (日本和光公司製測定儀）卞以決定。其 結果如圖9所示； 悬滴溫庠(異構酶活性之溫度相依性） 將含果糖4 0 0 πι Μ , 1 0 0 m Μ三乙醇胺缓衝液（p Η 7 ) , M s 2 ♦ 5 0 m Μ , C ο 2 + 0 . 5 m Μ之混合液内添加本發明之木糖異構_之 (請先閲讀背而之注意亊項洱填窝本頁) 裝· 訂· 線. 本紙浪尺度遑用中國Β家樣準（CNS)T4規格(210x297公；t) 19990? Λ 6 ΙΪ6 經濟部中央櫺準局Α工消伢合作杜印製 五、發明説明（1ϊ 反 應 混 合 液 » 在 65 釁 70 , 75 ， 80 t 85 1 90及 95 培 養 後 9 採 用 g 1 u C 0 S e 一 β -Τ e s t ( 曰 本 和 光 公 司 製 測 定 儀 )決定轉化 成 m 萄 糖 之 轉 化 率 0 其 結 果 » 與 桿 菌 及 梭 菌 之 木 糖 異 構 酶 之 異 構 酶 活 性 的 溫 度 相 依 性 之 結 果 均 表 示 於 圖 10 0 捍 菌 及 梭 菌 之 木 糖 異 構 酶 之 異 構 酶 活 性 的 溫 度 相 依 性 之 結 果 ， 係 η 果 糖 40 0 m Μ， 1 00 m ^ 乙 醇 胺 缓 衝 液 (P H7 ), Η g 2 + 50 m Μ之 混 合 液 内 添 加 木 糖 異 構 _ f 與 上 述 同 法 測 定 之 0 分 子 翬 本 發 明 之 木 糖 異 構 m 之 分 子 量 t 傷 利 用 S Ρ s - PAGE 測 定 0 其 結 果 ， 顯 示 出 分 子 量 為 44 ,2 0 0 0 結 果 與 由 木 糖 異 構 酶 遣 傳 基 因 之 胺 基 酸 序 列 算 得 的 理 論 分 子 量 43 ,9 00 大 致 付 合 0 菁 ψ 例 4 採 用 本 發 明 之 木 搪 異 構 進 行 由 m 萄 糖 變 成 果 糖 之 異 構 化 0 調 配 果 糖 25 % (w / V )， 葡萄糖2 5 .¾ ( W / V ) 1 Μη C 1 2 5 m Μ , 10 0 m Μ M0 PS (3 -( Ν - 啉 基 )丙烷磺酸） 缓 衝 液 (在Ρ H6 .5 » 2 5 f )之反«混合液。 至於對照紐 1 , 貝| J用此反應混合液， 而 實 施 例 f 則 於 此 混 合 液 中 添 加 1 πι g / ml 之 純 種 % 耐 熱 性 木 糖 異 構 m 0 在 8 0 °C 培 養 此 等 溶 液 P 並 在 〇, 20 , 6 0 , 1 80分 鐘 取 樣 0 試 樣 則 在 古 问 速 液 體 層 析 儀 (層柱UL TR ON PS80N ( S h i v a Ka k 〇 製 造 ), 溫度5 ου , 流速0 .9 ml /分， 移動村 H2 0) 予 以 分 析 0 其 結 果 如 圔 11 所 示 實 例 5 (果糖溶液之着色$ ]Ρ an 1 e ) (請先閲讀背而之注意事項再褀寫本頁) 裝· 訂· 線. 本紙張尺度逡用中国國家樣準 17 1999G1? Λ 6 η 6 經濟部屮央標準局只工消伢合作社印製 五、發明説明（1f 對果糖25¾ (w/v),葡萄糖25% (w/v), lOOmM三乙醇 胺缓衝液（pH5, 6, 7及8)之混合液，各於80t：培養3小時 後，使用分光光度計測定於2 0 0 m Μ之紫外線吸收（A 2 0 0 ), 檢査着色情況d其結果如圖12所示。由圖12可知，在pH5 〜7之範圍内較少着色3 發明夕效果 由於利用本發明之水生棲熱菌，可大量生産新穎的耐 熱性木糖異構酶。 甚且，此木糖異構與眾知的天然水生樓熱菌之木 糖異構酶不同，尤其受到被許可作為食品添加劑之鎂的影 響可提高熱安定性，在當作食品甜味劑之果搪的製造方面 ,在實用上極其有用。加之，本發明之木糖異構酶，其最 適溫度較眾知的天然水生樓熱菌之木糖異構酶高，約在 95P,對果糖之生産有利： 此外，若使用本發明之耐熱性木搪異構_之本發明方 法，則可生産幾乎不箸色之高濃度果糖溶液。 圖式說明 第1圖-表示本發明之水生捿熱菌之木糖異構酶遣傳 基因之部分鹼基序列及胺基酸序列。 第2圖-表示本發明之水生棲熱菌之木糖異構酶遣傳 基因之部分鹼基序列及胺基酸序列： 第3圖-表示本發明之水生棲熱菌之木糖異構酶遣傳 基因之鹼基序列及胺基豉序列之一部分： 第4圖-表示含有木瑭異構酶遣傳基因之質體pUSTXI 18 本紙张尺度遑用中国國家樣準(CNS)肀4規格（2】0x2町公:it) (請先閲讀背而之注意事項#蜞窍本頁) 1999G? A 6 η 6 五、發明説明（1? 之構築法的模式圖。 性 依 相 Η Ρ 與 性 活 之 酶 構 異 糖 木 之 明 發 本 示 表- 圖 5 第 依 相 Η Ρ 與 性 定 安 之 酶 構 異 糖 木 之 明 發 本 示 表- 圖 6 第 性 定 安 熱 的 酶 構 異 糖 木 之 明 發 本 對 靥 金 示 表 I 圔 7 〇 第饗 影 • 之 轉 糖 萄 οΜ 性由 依 ， 相酶 度構 溫異 之糖 性木 活之 酶明 構發 異本 糖用 木採 示 示 表表- - 圖 圖 8 9 第第 果 結 應 反 化 構 異 之圔 唐 ο 赛 1 果第 成 化 性 依 相 Η Ρ 與 色 着 之 液 溶 糖 果 示 表 (請先閲讀背而之注意事項#码寫本頁) 經濟部屮央櫺準局C3：工消#合作杜印製 本紙張尺度遑用中a 家標準(CNS) Τ4規格(210X297公*)