DE69130200T2

DE69130200T2 - Xyloseisomerase-Gen von Thermus Aquaticus, Xyloseisomerase und Verfahren zur Herstellung von Fructose

Info

Publication number: DE69130200T2
Application number: DE69130200T
Authority: DE
Inventors: Koen Chikusa-Ku Nagoya-Shi Aichi-Ken Dekker; Kenji Setagaya-Ku Tokyo Sakaguchi; Shigezo Nagoya-Shi Aichi-Ken Udaka; Hideo Chikusa-Ku Nagoya-Shi Aichi-Ken Yamagata
Original assignee: Japan Maize Products Co Ltd; Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Current assignee: Japan Maize Products Co Ltd; Nihon Shokuhin Kako Co Ltd
Priority date: 1990-10-29
Filing date: 1991-10-25
Publication date: 1999-05-20
Anticipated expiration: 2011-10-26
Also published as: EP0483691A3; EP0483691B1; KR100192746B1; US5411886A; ATE171215T1; KR920008189A; DE69130200D1; TW199907B; EP0483691A2; JPH0556789A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Xyloseisomerase-Gene von Thermus- Bakterien, insbesondere von Thermus aquaticus (hierin im folgenden als T. aquaticus abgekürzt), unter Verwendung der Gene gentechologisch hergestellte Xyloseisomerasen, ein Verfahren zur Herstellung einer Xyloseisomerase und ein Verfahren zur Herstellung hochkonzentrierter Fructose unter Verwendung der Xyloseisomerase.
Xyloseisomerasen sind Enzyme, die die Umwandlung zwischen D- Xylose und D-Xylulose katalysieren und die auch Glucose in Fructose umwandeln können, so daß sie industriell wichtig sind.
T. aquaticus ist ein thermophiles Bakterium, das unter der Zugangsnummer ATCC 27634 hinterlegt ist. T. aquaticus wird auch als Thermus thermophilus bezeichnet. Es wurde berichtet, daß T. aquaticus eine Xyloseisomerase erzeugt (siehe Journal of General Microbiology (1990), 136, 679-686), von der durch die Erfinder bewiesen wurde, daß sie ein von dem nach dem vorliegenden Verfahren hergestellten Enzym hinsichtlich Molekulargewicht, N-terminaler Aminosäuresequenz und anderem verschiedenes Enzym ist. T. aquaticus ist ein thermophiles Bakterium, und seine Xyloseisomerase hat eine höhere optimale Temperatur und thermische Stabilität als Clostridium thermohvdrosulfuricum-Xyloseisomerase, die ebenfalls eine hervorragende Thermostabilität besitzt, und auch als andere Isomerasen, die gegenwärtig industriell verwendet werden. Das Enzym ist verschieden, und bis jetzt war in der Technik kein Verfahren zur Herstellung der Xyloseisomerase in industriell verwendbarem großen Maßstab bekannt.
So ist es möglich, wenn das Xyloseisomerase-Gen von T. aquaticus erhalten worden ist, die T. aquaticus-Xyloseisomerase durch gentechnologische Techniken in großem Maßstab herzustellen. Es wurde jedoch nicht erreicht, das T. aquaticus-Xyloseisomerase-Gen zu isolieren, zu identifizieren und zu klonen. Dann ist es erforderlich, das Xyloseisomerase-Gen von T. aquaticus bereitzustellen.
Die Temperatur, bei der ein fructosereicher Maissirup (high fructose corn syrup, HFCS) hergestellt wird, wird üblicherweise zu 60ºC ausgewählt, auf der Basis der Thermostabilität der gegenwärtig verwendeten Isomerase. Die Fructosekonzentration in dem Produkt hängt von dem chemischen Gleichgewicht ab und beträgt 42 bis 45% im Falle des Verfahrens mit immobilisiertem Enzym bei 60ºC. Bei der praktischen Verwendung aber könnte es, wenn die Fructosekonzentration auf 55% erhöht werden könnte, ohne weitere Erhöhung der Fructosekonzentration als ein Nahrungsmittelsüßungsmittel für alkoholfreie Getränke verwendet werden. Dann, wenn die Herstellungstemperatur auf 85ºC erhöht werden konnte, wird das chemische Gleichgewicht in die Richtung von mehr Fructose-Erzeugung verschoben und es ist möglich, die Fructosekonzentration auf 55% zu erhöhen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Xyloseisomerase- Gene von Thermus-Bakterien, insbesondere T. aquaticus, bereitzustellen. Die zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur effizienten Herstellung der thermophilen und thermisch stabilen Xyloseisomerase unter Verwendung des Xyloseisomerase-Gens von Thermus-Bakterien, insbesondere T. aquaticus, bereitzustellen. Die dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen zur Herstellung hochkonzentrierter Fructose durch Isomerisieren von Glucose bei relativ hoher Temperatur, bei der das chemische Gleichgewicht auf die Seite der Fructose-Herstellung verschoben ist.
Außerdem kann, wenn hochkonzentrierte Fructose durch Isomerisieren von Glucose hergestellt wird, der pH des Reaktionsgemisches üblicherweise eingestellt werden, um die Isomeraseaktivität zu optimieren. Im Bereich von mehr als 7 tritt jedoch ein Problem auf, die Verfärbung und die Erzeugung anderer Nebenprodukte wie Psicose in der sich ergebenden Fructoselösung.
Daher ist es die vierte Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen zur Herstellung relativ farbloser und hochkonzentrierter Fructose durch Isomerisieren von Glucose in dem spezifischen pH-Bereich unter Verwendung der nach dem vorstehenden Verfahren erhaltenen thermostabilen Xyloseisomerase.
Die Erfinder vorliegender Erfindung schufen das Verfahren zur Isolierung des Xyloseisomerase-Gens von Thermus-Bakterien wie T. aguaticus, zur Bestimmung seiner Basensequenz und Aminosäuresequenz und zum Klonen des Gens. Dann fanden die Erfinder das Verfahren zur effizienten Herstellung der thermostabilen Xyloseisomerase durch gentechnologische Techniken unter Verwendung des geklonten Xyloseisomerase-Gens.
Darüberhinaus wurde gefunden, daß die durch das gentechnologische Verfahren hergestellte Xyloseisomerase von T. aquaticus unerwarteterweise verschieden war von der nativen, von T. aquaticus erhaltenen Xyloseisomerase und hervorragendere Eigenschaften als die native hatte (siehe Jounal of General Microbiology (1990), 136, 679- 686).
Zusätzlich wurde gefunden, daß durch Verwendung der vorliegenden Xyloseisomerase Fructose bei höheren Temperaturen hergestellt werden konnte. Darüberhinaus wurde durch Durchführen der Isomerisierung unter Verwendung der vorliegenden Xyloseisomerase bei höherer Temperatur als 75ºC und bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 7 gefunden, daß konzentriertere Fructose mit extrem geringer Verfärbung hergestellt werden konnte.
Die Basensequenz und die Aminosäuresequenz des Xyloseisomerase- Gens von T. aguaticus der vorliegenden Erfindung sind in SEQ ID NO: 1 gezeigt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Schema, das ein Aufbauverfahren des Plasmids pUSTXI, das das Xyloseisomerase-Gen enthält,
veranschaulicht.
Fig. 2 veranschaulicht die pH-Abhängigkeit der Aktivität der vorliegenden Xyloseisomerase.
Fig. 3 veranschaulicht die pH-Abhängigkeit der Stabilität der vorliegenden Xyloseisomerase.
Fig. 4 veranschaulicht Auswirkungen von Metallen auf die thermische Stabilität der vorliegenden Xyloseisomerase.
Fig. 5 veranschaulicht die Temperaturabhängigkeit der Aktivität von Xyloseisomerasen.
Fig. 6 veranschaulicht Ergebnisse der Isomerisierungsreaktion von Glucose zu Fructose unter Verwendung der vorliegenden Xyloseisomerase.
Fig. 7 veranschaulicht die pH-Abhängigkeit der Verfärbung einer Fructoselösung.
Die vorliegende Erfindung wird genau beschrieben werden.
Das vorliegende Xyloseisomerase-Gen von T. aquaticus hat beispielsweise die Basensequenz und die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO 1 gezeigt sind. Die Basensequenz und die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO 1 gezeigt sind, sind jedoch ein Beispiel des Xyloseisomerase-Gens von T. aquaticus, und daher können mit den Genen, die einen gewissen Grad an Homologie oder Übereinstimmung mit dem Gen haben, Xyloseisomerasen erhalten werden.
Dementsprechend umfassen unter diesem Gesichtspunkt die Xyloseisomerase-Gene der vorliegenden Erfindung Gene, die mehr als 60% Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO 1 gezeigten Xyloseisomerase-Gens besitzen. Ein stärker übereinstimmendes Gen liefert ein der natürlichen Xyloseisomerase ähnlicheres Enzym. So umfassen die Xyloseisomerase-Gene der vorliegenden Erfindung Gene, die Aminosäuresequenzen codieren, die bevorzugt mehr als 70%, besonders bevorzugt mehr als 80% und ganz besonders bevorzugt mehr als 90% Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO 1 gezeigten Xyloseisomerase-Gens besitzen.
Außerdem umfassen die Xyloseisomerase-Gene der vorliegenden Erfindung Gene, die von anderen Thermus-Bakterien als T. aquaticus erhalten wurden. Beispiele für Thermus-Bakterien sind Thermus flavus (ATCC 33923), Thermus lacteus (ATCC 31557), Thermus rubens (ATCC 31556), Thermus so. (ATCC 27737, 27978, 31674).
Xyloseisomerase-Gene von T. aquaticus können beispielsweise hergestellt werden, indem man sie mittels des in den Beispielen beschriebenen Verfahrens in E. coli kloniert.
T. aquaticus-Xyloseisomerase kann erhalten werden durch Insertieren oder Einbauen des obigen Xyloseisomerase-Gens in ein Plasmid mit einem geeigneten Promotor und Transformieren von Mikroorganismen mit dem sich ergebenden Plasmid. Beispiele für diese Mikroorganismen sind E. coli, Bacillus brevis, Saccharomyces cerevisiae, Streutomyces lividans und Bacillus subtilis. Es werden Promotoren verwendet, die für diese Mikroorganismen geeignet sind.
In E. coli kann beispielsweise der tac-Promotor (Agric. Biol. Chem., 52(4), 983-988, 1988) und der T7 Phage-Promotor (F. W. Studier et al. Methods in Enzymol, 185, 60-84, 1989) verwendet werden. Beispielsweise kann die Xyloseisomerase hergestellt werden durch Insertieren des vorstehend angegebenen Xyloseisomerase-Gens in das Plasmid pUS 12, Transformieren von E. coli mit diesem Plasmid, Züchten der Transformanten und Ernten der erzeugten Xyloseisomerase. Das Plasmid pUS12, entwickelt von Shibui et al., enthält einen starken und Expressions-steuerfähigen tac-Promotor (Agric. Biol. Chem., 52(4), 983-988, 1988).
In Bacillus brevis kann die Xyloseisomerase unter Verwendung des CWP-Promotors (Adachi, T., Yamagata, H. et al., J. Bacteriol., 171, 1010-1016, 1989) zum Transformieren von Bacillus brevis, Züchten der Transformanten bei 30ºC in, beispielsweise, einem Medium aus Rinderextrakt, Glucose und Pepton (pH 7,0) und Ernten der erzeugten Xyloseisomerase hergestellt werden.
In Saccharomyces cerevisiae kann die Xyloseisomerase hergestellt werden durch Verwendung von PGK (der Promotor des Phosphoglyceratkinase-Gens), von ADC (der Promotor von Alkoholdehydrogenase) oder von GAP (der Promotor von Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase) (L. Guareente, M. Ptashne, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2199-2203, 1988) zum Transformieren von Saccharomyces cerevisiae, Züchten der Transformanten bei 30ºC in, beispielsweise, einem aus 0,3% Hefeextrakt, 2% Sucrose, 0,5% Pepton, 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4; · 7H&sub2;O (pH 5,5) zusammengesetzten Medium, und Ernten der erzeugten Xyloseisomerase.
In Streptomyces lividans 66 kann die Xyloseisomerase hergestellt werden durch Verwendung des gylP1 (Glycerinkinase P1-Gen)-Promotors (E. T. Seno et al., Mol. Gen. Genet., 193, 119-125, 1984), des ermEPl (Erythromycin-Resistenz-Gen EP1)-Promotors (C. J. Thompson et al., J. Bacteriol, 151, 678-687, 1983) zum Transformieren von Streptomcyces lividans 66, Züchten der Transformanten nach dem Verfahren von C. J. Thompson et al., und Sammeln der erzeugten Xyloseisomerase.
Die nach den vorstehend angeführten gentechnologischen Techniken erhaltenen Xyloseisomerasen sind unerwarteterweise verschieden von der bekannten nativen Xyloseisomerase (Journal of General Microbiology (1990), 136, 679-686), und sie erwiesen sich als neue Xyloseisomerasen.
Die vorliegenden Xyloseisomerasen haben charakteristischerweise den optimalen pH von etwa 7, den stabilen pH-Bereich von etwa 6 bis 8,5, die optimale Temperatur von etwa 95ºC und das Molekulargewicht von etwa 44.000, und sie werden thermisch stabilisiert mit Mangan oder Magnesium, und destabilisiert mit Kobalt.
Andererseits hat die natürliche Xyloseisomerase den bereiten optimalen pH-Bereich von 5,5 bis 8,5 und den stabilen pH-Bereich von 6 bis 9. Was Metalle betrifft, wird die natürliche mit Mangan oder Kobalt thermisch stabilisiert. Anders als die vorliegenden Xyloseisomerasen wird sie jedoch mit Magnesium nicht stabilisiert, sondern destabilisiert. Die optimale Temperatur beträgt etwa 85ºC, was etwa 10ºC niedriger ist als diejenige der vorliegenden Xyloseisomerasen. Das Molekulargewicht beträgt 50.000 und ist deutlich größer als das der vorliegenden Xyloseisomerasen. Darüberhinaus ist ihre N-terminale Aminosäuresequenz (H. Bisswanger, persönliche Mitteilung) Ser-Tyr-Phe-Pro-Asp-Ileu-Gly-Lyo-Ileu-Ala-Tyr-Glu,-Gly-Pro-Glu-Ser- Arg-Asn-Pro-Lys-, was völlig verschieden ist von der N-terminalen Sequenz dieser Erfindung.
Obwohl sowohl die vorliegenden Xyloseisomerasen als auch die natürliche Xyloseisomerase von T. aquaticus stammen, sind sie verschiedene Enzyme. Es wird auf folgende Gründe geschlossen. Die natürliche Xyloseisomerase wird direkt von T. aquaticus geerntet. Im Gegensatz dazu werden die vorliegenden Xyloseisomerasen durch Verwendung eines klonierten Gens von T. aquaticus erhalten. Auf diese Weise ist es möglich, daß T. aquaticus zwei oder mehrere Arten von Xyloseisomerase-Genen besitzt, und daß bei der vorliegenden Erfindung ein Xyloseisomerase-Gen erhalten werden kann, das von dem der natürlichen Xyloseisomerase verschieden ist.
Die neue Xyloseisomerase der vorliegenden Erfindung katalysiert die Isomerisierung zwischen Fructose und Glucose. Die Aktivität der Isomerase wird beispielsweise nach dem folgenden Verfahren bestimmt. 0,1 bis 0,4 E Xyloseisomerase werden bei 85ºC in 1 ml einer wäßrigen Lösung von 100 mM Hepes (pH 7), 400 mM Fructose und 10 mM MnCl&sub2; inkubiert. Die Ausbeute an Glucose wird bestimmt durch Analysieren von 20 ul einer Probe mittels des Glucoseoxidase-Analyseverfahrens (Glucose-B-Test, Wako Junyaku in Japan). Eine Einheit ist definiert als die Menge an Enzym, die unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen in einer Minute 1 uMol Glucose bildet.
Wie in den Beispielen beschrieben, wird die Reinigung der vorliegenden Xyloseisomerase wie folgt durchgeführt. Transformanten, die mit dem vorliegenden Xyloseisomerase-Gen transformiert wurden, werden gezüchtet, und die sich ergebenden Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet oder gesammelt. Der Niederschlag wird in 2 ml von 100 mM Triethanolamin-Puffer (pH7), der 10 mM MnCl&sub2; und 400 mM Fructose enthält, erneut suspendiert und durch Beschallung lysiert. Die sich ergebenden Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren entfernt. Der Zellextrakt wird 10 Minuten lang bei 85ºC erhitzt, und dann wird das denaturierte Protein durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wird gereinigt durch jeweils zweimalige Ultrafiltration gegen 500 Volumina 50 mM Hepes (pH 7), 5 mM EDTA-Puffer und denselben Puffer ohne EDTA.
Das Molekulargewicht der vorliegenden Xyloseisomerase beträgt etwa 44.000, und deren Gen codiert ein Polypeptid von 387 Aminosäuren. Die Thermostabilität dieser Xyloseisomerase wird durch Zugabe von Mangan oder Magnesium im Vergleich zu der ohne derartige Metalle erhöht. Außerdem zeigt die Xyloseisomerase durch Zugabe von Kobalt eine geringere Thermostabilität als diejenige ohne Kobalt. Die vorliegende Xyloseisomerase hat die optimale Temperatur von etwa 95ºC.
Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird hochkonzentrierte Fructose durch Isomerisieren von Glucose bei höherer Temperatur, d. h. mehr als 75ºC, bevorzugt mehr als 80ºC, in Anwesenheit der vorstehend beschriebenen Xyloseisomerase hergestellt. Da im Hinblick auf das chemische Gleichgewicht eine höhere Reaktionstemperatur zu einer höher konzentrierten Fructose führt, ist es bevorzugt, daß die Reaktionstemperatur auf eine so hohe Temperatur wie möglich eingestellt wird. Nach dem vorstehend beschriebenen gentechnologischen Verfahren erhaltene T. aquaticus-Xyloseisomerase besitzt eine optimale Temperatur der Isomeraseaktivität bei etwa 95ºC. Daher ist es unter dem Gesichtspunkt der enzymatischen Aktivität bevorzugt, daß die Reaktionstemperatur um 95ºC eingestellt wird. In der Praxis wird die Reaktion geeigneterweise bei 100ºC oder weniger, bevorzugt 80 bis 95ºC, durchgeführt.
Andererseits ist unter dem Gesichtspunkt, ein Verfärben der sich ergebenden Fructose-Lösung zu vermeiden, der pH-Wert des Reaktionsgemisches nützlicherweise 5 bis 7, bevorzugt 5 bis 6,5.
Die Isomerisierung von Glucose mit der Xyloseisomerase kann entweder mittels eines chargenweisen Verfahrens oder eines kontinuierlichen Verfahrens mit irnmobilisiertem Enzym durchgeführt werden. Bei dem chargenweisen Verfahren kann die Reaktionszeit in Abhängigkeit vom Umfang der Reaktion verändert werden und kann beispielsweise von etwa 1 bis 24 Stunden dauern. Bei dem kontinuierlichen Verfahren unter Verwendung des immobilisierten Enzyms kann die Reaktionszeit beispielsweise näherungsweise eine Minute bis 24 Stunden, bevorzugt näherungsweise 5 Minuten bis 3 Stunden, sein.

Beispiel 1

Stamm:

Thermus aguaticus HB8: ATCC 27634

E. coli JM109: recA1supE44endA1hsdR17gyrA96relA1thiΔ(lacproAB)F'[traD36proAB&spplus;lacI&sup9; lacZΔM15]

Bedingungen für die Kultur

T. aguaticus wird nach dem Verfahren von Nagahari et al. (Nagahari et al., Gene, 10, 127-145, 1980) gezüchtet. E. coli-Zellen werden bei 37ºC in zweifach konzentrierter Hefeextrakt-Trypton-Kulturlösung (erhältlich von Difco in U. S. A.), beschrieben in dem Verfahren von Vieira et al. (Vieira et al., Meth. Enz. 1987, 153(3-11)) gezüchtet.

Klonierungs- und Sequenzierungsverfahren

Genom-DNA wurde nach dem Verfahren von Saito (Saito H. und Miura K., Preparation of transforming DNA by phenol treatment. Biochim. Biophys. Acta 1963, 72(619-629)) aus T. aguaticus-Zellen extrahiert. Gefrorene Pellets (0,45 g) wurden wieder in 4,5 ml 200 mM NaCl, 100 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) suspendiert. Nach Zugabe von 0,5 ml 10%igen SDS wurde das Gemisch bei 60ºC 15 Minuten lang sanft gedreht und danach bei 60ºC 30 Minuten lang mit RNase A (0,05 mg/ml) behandelt. Zusätzlich wurde es bei 60ºC 60 Minuten lang mit Proteinase K (0,5 mg/ml) behandelt. Diese Lysat-Lösung wurde mit dem gleichen Volumen Phenol-Lösung (gesättigt mit Tris-Puffer) versetzt, um das denaturierte Protein zu entfernen. Diese Vorgänge wurden dreimal wiederholt. Der Rückstand wurde durch Zentrifugieren (10 Minuten, 15000 UpM) entfernt.
Nach Zugabe von 0, 8 Volumina Isopropanol wurde DNA herausgezogen und in 1,5 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), das 1 mM EDTA enthielt, erneut suspendiert. Schließlich wurde die DNA mittels Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer DEAE-Zellulosesäule (Waschpuffer: 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl; Eluierungspuffer: 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 M NaCl) gereinigt.
Die Genom-DNA wurde mit SacI verdaut. Die Fragmente wurden mit 0,4% Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert. Die DNA wurde denaturiert durch 25 Minuten langes Eintauchen des Gels in 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH. Das Gel wurde neutralisiert mit 3 M Natriumacetat (pH 5,5). Die DNA wurde durch Elektro-Blotting (3 h, 2 mA/cm²) auf eine Nylonmembran (erhältlich von Biodyne in Glen Cove, N. J. U. S. A.) übertragen und eine Stunde lang bei 80ºC behandelt. Dieser Blot wurde mit dem 287 Nucleotide langen, ³²P-markierten BgII-Fragment des Streptomyces griseofuscus S-41-Xyloseisomerase-Gens (10&sup6; um/ml) bei 54ºC hybridisiert. Wie durch Vergleich mit Aminosäuresequenzen von Xyloseisomerasen, die von Bacillus subtilis E. coli, Streptomyces violaceoniger und Ampullariella erhalten wurden, gezeigt wurde, enthält dieses Fragement zwei relativ hochgradig homologe Bereiche. Nach Hybridisierung erschien eine einzige Bande um den 1,8 kb-Bereich.
Das 1,8 kb ± 0,5 kb-Fragment von mit SacI verdauter Thermus-DNA wurde durch Extraktion mit Glasmilch (glassmilk) isoliert und mit dem mit SacI verdauten E. coli-Vektor pUC118 verknüpft. Kompetente E. coli JM 109-Zellen wurden mit der verknüpften DNA transformiert.
Kolonien mit der gewünschten Thermus-DNA wurden nachgewiesen durch Hybridisieren der Transformanten-Kolonien mit S. Griseofuscus-Sonden. Plasmid-DNA wurde aus den Kolonien, die ein positives Signal zeigten, durch das alkalische Lyse-Verfahren extrahiert und durch Verdau oder Spaltung mit Restriktionsenzymen und Southern-Hybridisierung analysiert.
Ein 1,8 kb SacI-Fragment, das fest an die von dem S. Griseofuscus-Xyloseisomerase-Gen erhaltene Sonde hybridisiert war, wurde erhalten. Dieses 1,8 kb-Fragment wurde mit Restriktionsenzymen in kleinere Fragmente geschnitten. Diese Fragmente wurden unter Verwendung von pUC118 und pUC119 in E. coli JM109 subkloniert.
Eine einsträngige DNA wurde nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren von Vieira hergestellt und mit TaqDNA-Polymerase (AmpliTaqTM Sequenzierungs-Kit: erhältlich von Takara Shuzo Co., Ltd. in Japan) und 7-Deaza dGTP sequenziert.
Die Basensequenz und die Aminosäuresequenz des T. aguaticus-Xyloseisomerase-Gens sind in SEQ ID NO 1 gezeigt. Alternativ ist in Tabelle 1 jede Aminosäuresequenz-Homologie zwischen der vorliegenden T. aquaticus-Xyloseisomerase und den aus anderen Mikroorganismen als T. aquaticus erhaltenen, obigen Xyloseisomerasen gezeigt. Tabelle 1

Beispiel 2

Das Xyloseisomerase-Gen von T. aquaticus wurde in den E. coli-Expressionsvektor pUS12 (Agric. Biol. Chem., 52(4), 983-988, 1988) wie folgt insertiert:
(a) Zuerst wurde das den C-terminalen Bereich von Xyloseisomerase (in SEQ ID NO 1 von der 847sten Base zu der 1536sten Base) codierende 690 bp SmaI-Fragment in die SmaI-Stelle von pUS 12 insertiert, was zu pUS12C führte.
(b) Das den N-terminalen Bereich von Xyloseisomerase codierende 1150 bp BbeI-Fragment (in SEQ ID NO 1 von der 236sten Base zur 1385sten Base) wurde glattendig gemacht und in die SmaI-Stelle von pUC118 insertiert, was zu pUC118 N führte.
(c) Das den Bereich von der BamHI-Stelle stromauf der Insertionsstelle von pUS12C bis zur BamHI-Schnittstelle des insertierten Fragments (in SEQ ID NO 1 die 1250ste Base) enthaltende 1024 bp BamHI-Fragment wurde gegen das Fragment zwischen der BamHI-Stelle stromauf von der Insertionsstelle des in (a) aufgebauten pUS12C und der BamHI-Schnittstelle in dem insertierten Fragment (SEQ ID NO 1, die 1250ste Base) ersetzt.
Das sich ergebende Plasmid pUSTXI besaß ein insertiertes vollständiges Xyloseisomerase-Gen, das ein Translations-Startcodon zwischen der BamHI-Stelle und der SmaI-Stelle von pUS12 enthielt.
Transformanten, die durch Transformation von E. coli JM109 mit dem sich ergebenden Plasmid pUSTXI erhalten wurden, wurden nach dem Verfahren von Vieira et al. (Vieira et al., Meth. Enz. 1987, 153 (3-11)) bei 37ºC in 3 ml zweifach konzentrierter Hefeextrakt-Trypton-Kulturlösung (erhältlich von Difco in U. S. A.) bis zur mittellangen (mid-10 g) Phase (A660 ca. 1,0) gezüchtet. Dann wurde der tac-Promotor durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-thiogalactosid (IPTG) aktiviert, und danach wurden die Transformanten weitere 2,5 Stunden lang wachsenlassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und in 2 ml 100 mM Triethanolamin-Puffer (pH 7), der 10 mM MnCl, und 400 mM Fructose enthielt, erneut suspendiert und durch Ultraschall lysiert. Die sich ergebenden Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren entfernt. Die Zellextrakte wurden 10 Minuten lang bei 85ºC erhitzt, und das denaturierte Protein wurde durch Zentrifugieren entfernt.
Die Bestimmungen der Xyloseisomerase-Aktivität in 200 ul wärmebehandeltem Zellextrakt wurden durchgeführt durch Bestimmen der Menge an Glucose, die bei 85ºC in 1 ml 100 mM Triethanolamin-Puffer (pH 7), der 10 mM MnC12 und 400 mM Fructose enthielt, gebildet wurde (Glucose-B-Test, erhältlich von Wako in Japan).
Die Aktivität von Xyloseisomerase und ihre Ausbeute im Kulturmedium sind in Tabelle 2 gezeigt.
Zum Vergleich sind in Tabelle 2 die Aktivität von Xyloseisomerase in 200 ul wärmebehandeltem Zellextrakt, die mit dem E. coli-Erntevektor pUC119, der kein Isomerase-Gen besitzt, erhalten wurde, und die Ausbeute im Kulturmedium gezeigt. Tabelle 2
Der Überstand an Zellextrakt, der durch Entfernen von Protein, das durch 10 Minuten langes Erwärmen bei 85ºC denaturiert wurde, unter Zentrifugieren erhalten wurde, wurde mit Ultrafiltration gegen S00 Volumina 50 mM Hepes, pH 7, 5 mM EDTA-Puffer und denselben Puffer ohne EDTA gereinigt, jeweils zwei Mal, wodurch die vorliegende Xyloseisomerase erhalten wurde.

Beispiel 3

Bei der vorliegenden Xyloseisomerase wurden der optimale pH, der stabilisierende pH-Bereich, die Thermostabilisierung mit Metallen, die optimale Temperatur und das optimale Molekulargewicht bestimmt.

Optimaler pH

Der optimale pH der vorliegenden Xyloseisomerase im Falle von 85ºC wurde dadurch bestimmt, daß man sie in einer Pufferlösung, die 50 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, 50 mM Glycin, 400 mM Fructose und 10 mM MgCl&sub2; enthielt, bei 85ºC 0, 8 oder 16 Minuten lang inkubierte. Der pH-Wert jeder Probe wurde bestimmt, indem man ihn bei 80ºC mit NaOH einstellte. Die Ausbeuten an Glucose wurden bestimmt mit dem Glucose-B-Test (erhältlich von Wako Junyaku in Japan). Der Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.

pH-Stabilität

Die pH-Stabilität der vorliegenden Xyloseisomerase bei 90ºC wurde bestimmt, indem man sie bei 90ºC in einem Puffer, der 25 mM Essigsäure, 25 mM Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure), 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, 25 mM Glycin und 5 mNI MgCl., enthielt, inkubierte. Der pH-Wert jeder Probe wurde bestimmt, indem man ihn bei 80ºC mit NaOH einstellte. Nach dem Inkubieren wurde eine 40 ul Probe bei 85ºC 0, 8 und 16 Minuten lang mit einem 760 ul Reaktionsgemisch, das 100 mM Triethanolamin, pH 7, 400 mM Fructose und 10 mM MgCl&sub2; enthielt, inkubiert und die Restaktivität bestimmt. Die Ausbeute an Glucose wurde mittels des Glucose-B-Tests (erhältlich von Waku Junyaku in Japan) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.

Stabilisierung mit Metallen

Zur Bestimmung der Auswirkungen von Metallen auf die Thermostabilität der vorliegenden Xyloseisomerase wurde sie in einem Puffer, der 100 mM Hepes, pH 7, 400 mM Fructose und 5 mM eines jeden Metallsalzes (MnCl&sub2;, MgCl&sub2;, CoCl) enthielt, bei 90ºC 30 Minuten, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h oder 6 h inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde eine 40 ul Probe bei 85ºC 8 oder 16 Minuten lang mit 1 ml Reaktionsgemisch, das 100 mM Triethanolamin, pH 7, 400 mM Fructose und 10 mM MgCl&sub2; enthielt, inkubiert, und die Restaktivität wurde bestimmt. Die Ausbeute an Glucose wurde mittels des Glucose-B-Tests (erhältlich von Wako Junyaku in Japan) unter Verwendung von Glucoseoxidase bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.

Optimale Temperatur (Temperaturabhängigkeit der Isomerase-Aktivität)

Nach Inkubieren des Reaktionsgemisches, das 400 mM Fructose, 100 mM Triethanolamin-Puffer (pH 7), 50 mM Mg²&spplus; und Co²&spplus; enthielt, mit der vorliegenden Xyloseisomerase bei 65, 70, 75, 80, 85, 90 oder 95ºC, wurde die Umwandlungsrate von Fructose in Glucose mittels des Glucose-B-Tests (erhältlich von Wako Junyaku in Japan) bestimmt. Die Ergebnisse sowie die Ergebnisse der Temperaturabhängigkeit der Isomerase-Aktivität von Bacillus- und Clostridium-Xyloseisomerase sind in Fig. 5 gezeigt. Die Temperaturabhängigkeit der Isomerase-Aktivität von Bacillus- oder Clostridium-Xyloseisomerase wurde in gleicher Weise wie vorstehend unter Verwendung eines Gemisches, das 400 mM Fructose, 100 mM Triethanolamin-Puffer (pH 7), 50 mM Mg²&spplus; und Xyloseisomerase enthielt, bestimmt.

Molekulargewicht

Es wurde gezeigt, daß das Molekulargewicht der vorliegenden Xyloseisomerase, bestimmt mittels SDS-PAGE, 44200 beträgt. Es ist näherungsweise im Einklang mit dem theoretischen Molekulargewicht, 43900, das mit der Aminosäuresequenz des Xyloseisomerase-Gens errechnet wurde.

Beispiel 4

Unter Verwendung der Xyloseisomerase der vorliegenden Erfindung wurde eine Isomerisierung von Glucose zu Fructose durchgeführt. Das Reaktionsgemisch, das 25% (Gew/V) Fructose, 25% (Gew/V) Glucose, 5 mM MnCl&sub2; und 100 mM MOPS (3-(N-Morpholino)propansulfonsäure) -Puffer enthielt (pH 6,5 bei 25ºC), wurde hergestellt. Diese Lösung wurde als eine Kontrolle verwendet, und für den Test wurde zu der Lösung 1 mg/ml einer thermostabilen Xyloseisomerase zugegeben. Diese Lösungen wurden bei 80ºC inkubiert, und jede Teilmenge wurde 0, 20, 60 bzw. 180 Minuten nach dem Beginn der Inkubation entfernt. Jede Teilmenge wurde analysiert mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (Säule: ULTRON PS80 N (erhältlich von Shinwa Kako in Japan), Temperatur: 50ºC, Strömungsgeschwindigkeit: 0,9 ml/min. Eluierungsmittel: H&sub2;O. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt.

Beispiel 5 (pH-Abhängigkeit der Färbung der Fructose-Lösung)

Nach 3 h langem Inkubieren bei 80ºC des Reaktionsgemisches, das 25% (Gew/V) Fructose, 25% (Gew/ V) Glucose und 100 mM Triethanolamin-Puffer (pH 5, 6, 7 bwz. 8) enthielt, wurde die Färbung jedes Reaktionsgemisches unter Verwendung eines Spektralphotometers durch Messen der UV-Extinktion bei 200 nm (A200) untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt. Wie in Fig. 7 gezeigt ist, wird gefunden, daß die Färbung innerhalb des pH-Bereichs zwischen 5 und 7 gering ist.
Es ist möglich, durch die Verwendung des Xyloseisomerase-Gens von T. aguaticus der vorliegenden Erfindung eine große Menge neuer, thermophiler und thermostabiler Xyloseisomerase herzustellen.
Außerdem kann diese Xyloseisomerase, anders als die bekannte native T. aguaticus-Xyloseisomerase, mit Magnesium, das ein als Nahrungsmittelzusatz genehmigtes Metall ist, thermostabilisiert werden, und dann ist es praktisch verwendbar bei der Herstellung von Fructose, die als ein Nahrungsmittel-Süßungsmittel verwendet wird. Außerdem liegt die optimale Temperatur der vorliegenden Xyloseisomerase näherungsweise bei 95ºC, welche höher ist als diejenige der bekannten nativen T. aquaticus-Xyloseisomerase, und sie ist günstig für die Herstellung von Fructose.
Nach dem vorliegenden Verfahren unter Verwendung der vorliegenden thermostabilen Xyloseisomerase ist es auch möglich, eine hochkonzentrierte Fructose-Lösung mit sehr wenig Färbung herzustellen. Sequenzprotokoll

Claims

1. Xyloseisomerase-Gen von Thermus-Bakterien mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz oder mit 60% oder mehr Homologie mit der Aminosäure-Sequenz des Xyloseisomerase-Gens, wobei jene Xyloseisomerase-Gene ausgeschlossen sind, die Xyloseisomerase liefern mit dem optimalen pH von etwa 5,5 bis 8,5, der optimalen Temperatur von etwa 85ºC und dem Molekulargewicht von etwa 50000, und die durch Mn²&spplus;- und Co²&spplus;-Ionen stabilisiert werden.

2. Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen ein Xyloseisomerase-Gen von Thermus aquaticus ist.

3. Gen nach Anspruch 2, wobei Thermus aquaticus die Zugangsnummer ATCC27634 hat.

4. Xyloseisomerase von Thermus aguaticus, dadurch gekennzeichnet, daß die Xyloseisomerase den optimalen pH von etwa 7, den stabilen pH-Bereich von etwa 6 bis 8, 5, die optimale Temperatur von etwa 95ºC und das Molekulargewicht von etwa 44000 hat und durch Mangan oder Magnesium stabilisiert wird.

5. Verfahren zur Herstellung einer Xyloseisomerase, aufweisend ein Transformieren eines Mikroorganismus mit einem Plasmid, das das Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und einen Promotor enthält, Kultivieren des transformierten Mikroorganismus und Sammeln der erzeugten Xyloseisomerase.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Escherichia coli, Bacillus brevis Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces lividans und Bacillus subtilis.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Mikroorganismus Escherichia coli ist und der Promotor der tac-Promotor oder der T7-Phagenpromotor ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Mikroorganismus Bacillus brevis ist und der Promotor der CWP-Promotor ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae ist und der Promotor der Promotor des Phosphoglyceratkinase-Gens, der Promotor der Alkoholdehydrogenase oder der Promotor der Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase ist.

10. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Mikroorganismus Streptomyces lividans ist und der Promotor der Promotor des P1- Glycerinkinase-Gens ist.

11. Verfahren zur Herstellung von Fructose, aufweisend die Isomerisierung von Glucose zu Fructose in Anwesenheit der Xyloseisomerase nach Anspruch 4.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Isomerisierung von Glucose bei einer Temperatur von 80 bis 95ºC und bei einem pH- Wert im Bereich von 5 bis 7 durchgeführt wird.