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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft modifizierte Sarcosinoxidasen mit
verringerter Reaktivität
für N-Ethylglycin
verglichen mit einem unmodifizierten Enzym, modifizierte Sarcosinoxidasegene
und Verfahren zur Herstellung von modifizierten Sarcosinoxidasen.
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Fachgebiet
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Sarcosinoxidasen
sind Enzyme mit katalytischer Aktivität zur Hydrolyse von Sarcosinen,
um Glycin und Formaldehyd zu produzieren, die verwendet werden können, um
die Menge an Creatinin in menschlichem Serum oder Urin zu messen,
oder die als Diagnosemittel für
verschiedene Krankheiten wie Nierenerkrankungen eingesetzt werden
können.
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Kürzlich wurde
bekannt, dass Sarcosinoxidasen durch Bakterienstämme, wie diejenigen der Gattung Corynebacterium
(siehe J. Biochem., 89, 599 (1981)), Bacillus (siehe z.B. JP-Patentveröffentlichung
(nicht geprüfte
Anmeldung) Nr. 54-52789),
Cylindrocarpon (siehe z.B. JP-Patentveröffentlichung (nicht geprüfte Anmeldung)
Nr. 56-92790), Pseudomonas (siehe z.B. JP-Patentveröffentlichung
(nicht geprüfte
Anmeldung) Nr. 60-43379) und Arthrobacter (siehe z.B. JP-Patentveröffentlichung
(nicht geprüfte
Anmeldung) Nr. 2-265478) produziert werden.
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Darüberhinaus
haben die Erfinder Sarcosinoxidasegene von der Gattung Bacillus
(siehe z.B. JP-Patentveröffentlichung
(nicht geprüfte
Anmeldung) Nr. 5-115281 und in SEQ ID Nr:2 gezeigt) isoliert und
erfolgreich bewirkt, dass die Enzyme in großen Mengen mittels gentechnischer
Methoden exprimiert werden (siehe z.B. JP-Patentveröffentlichung (nicht geprüfte Anmeldung)
Nr. 5-115281).
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Sarcosinoxidasen
sind jedoch auch bekannt dafür,
dass sie zu N-Ethylglycin umgesetzt werden, welches ein methabolisches
Produkt eines Anesthetikums ist. Da Reagenzien, die Sarcosinoxidasen
enthalten und darin verwendet werden, durch N-Ethylglycin beeinflusst
werden, ist es nicht möglich
gewesen, Creatinin oder Creatin unter Verwendung solcher Reagenzien
präzise
zu messen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Unter
solchen Gegebenheiten war es wünschenswert,
Sarcosinoxidasen mit verringerter Reaktivität für N-Ethylglycin zu entwickeln.
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Als
Ergebnis einer gentechnischen Modifizierung von Sarcosinoxidasegenen,
die von der Gattung Bacillus stammen (gezeigt in SEQ ID NO:2 der
JP Patentveröffentlichung
(nicht geprüfte
Anmeldung) Nr. 5-115281), haben die Erfinder im Hinblick auf das
obige Ziel erfolgreich Sarcosinoxidasen mit verringerter Reaktivität für N-Ethylglycin
erhalten und somit die vorliegende Erfindung vollendet.
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Die
vorliegende Erfindung stellt das Folgende bereit:
- (1)
Eine modifizierte Sarcosinoxidase mit den folgenden physicochemischen
Eigenschaften:
(a) Aktivität:
hydrolysiert 1 Mol Sarcosin unter Erhalt von 1 Mol Glycin und 1
Mol Formaldehyd;
(b) Substratspezifität: Reaktivität für N-Ethylglycin
ist 70% oder weniger verglichen mit derjenigen eines unmodifizierten
Proteins;
(c) pH-Optimum: etwa 8,0;
(d) pH-Stabilität: zwischen
6,5 und 11,0;
(e) Temperaturoptimum: 55°C;
(f) Hitzestabilität: 55°C oder weniger;
und
(g) Molekulargewicht: annähernd 43000 (SDS-PAGE).
- (2) Eine modifizierte Sarcosinoxidase, die gemäß den folgenden
(a), (b) oder (c) definiert ist:
(a) ein Protein mit einer
Aminosäuresequenz
wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt;
(b) ein Protein mit einer
Aminosäuresequenz,
worin eine oder mehrere Aminosäure(n)
deletiert sind von, substituiert sind oder hinzugefügt sind
zu der Aminosäuresequenz
wie in SEQ ID NR: 1 dargestellt, und das Sarcosinoxidaseaktivität hat, dadurch
gekennzeichnet, dass die Reaktivität für N-Ethylglycin verringert
ist, verglichen mit derjenigen eines unmodifizierten Proteins; oder
(c)
ein Protein mit einer Aminosäuresequenz,
die 80% oder mehr Homologie zu der in SEQ ID NR: 1 dargestellten
Aminosäuresequenz
zeigt, und das Sarcosinoxidaseaktivität hat, dadurch gekennzeichnet,
dass die Reaktivität
für N-Ethylglycin
verringert ist, verglichen mit derjenigen eines unmodifizierten
Proteins.
- (3) Ein modifiziertes Sarcosinoxidasegen, das die folgenden
Proteine (a), (b) oder (c) codiert:
(a) ein Protein mit der
in SEQ ID NR: 1 dargestellten Aminosäuresequenz;
(b) ein Protein
mit einer Aminosäuresequenz,
worin eine oder mehrere Aminosäure(n)
deletiert sind von, substituiert sind oder hinzugefügt sind
zu der Aminosäuresequenz,
die in SEQ ID NR: 1 dargestellt ist, und das Sarcosinoxidaseaktivität hat, dadurch
gekennzeichnet, dass die Reaktivität für N-Ethylglycin verringert ist,
verglichen mit derjenigen eines unmodifizierten Proteins; oder
(c)
ein Protein mit einer Aminosäuresequenz,
die 80% oder mehr Homologie zu der in SEQ ID NR: 1 dargestellten
Aminosäuresequenz
zeigt, und das Sarcosinoxidaseaktivität hat, dadurch gekennzeichnet, dass die
Reaktivität
für N-Ethylglycin
verringert ist, verglichen mit derjenigen eines unmodifizierten
Proteins.
- (4) Eine rekombinante DNA, die das Sarcosinoxidase-Gen nach
(3) in einer Vektor-DNA eingefügt
hat.
- (5) Eine Transformante oder Transductante, die die rekombinante
DNA nach (4) umfasst.
- (6) Ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Sarcosinoxidase,
das das Züchten
der Transformante oder Transductante nach (5) in einem Medium und
das Gewinnen der Sarcosinoxidasen aus der Kultur umfaßt.
- (7) Ein Reagenz zur Messung von Creatinin, das die modifizierte
Sarcosinoxidase nach (1) oder (2) enthält.
- (8) Ein Reagenz zur Messung von Creatin, das die modifizierte
Sarcosinoxidase nach (1) oder (2) enthält.
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Die
modifizierte Sarcosinoxidase der vorliegenden Erfindung kann als
Reagenz zur Messung von Creatinin oder Creatin verwendet werden.
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Das
Reagenz, das darin die modifizierte Sarcosinoxidase enthält und verwendet,
wird kaum durch N-Ethylglycin beeinflusst, wodurch eine präzisere Messung
als jemals zuvor ermöglicht
wurde.
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Diese
Beschreibung schließt
Teile oder den gesamten Inhalt wie in den Beschreibungen der japanischen
Patentanmeldungen Nr. 2003-387975 und 2004-184690 offenbart ein, die die Basis
des Prioritätsanspruchs
der vorliegenden Erfindung darstellen.
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Detaillierte
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Die
vorliegende Erfindung wird nun ausführlich beschrieben.
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Die
Sarcosinoxidasen der vorliegenden Erfindung können durch Modifizieren von
Genen, die Sarcosinoxidasen codieren, erhalten werden. Gene, die
Sarcosinoxidasen codieren und für
die Modifizierung verwendet werden, sind nicht speziell begrenzt.
Beispiele solcher Gene schließen
die von der Gattung Bacillus stammenden Sarcosinoxidasegene ein
(beschrieben in JP Patentveröffentlichung
(nicht geprüfte
Anmeldung) Nr. 5-115281).
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Jedes
bekannt Verfahren kann als Mittel zur Modifizierung der vorstehenden
Gene verwendet werden. Beispiele solcher Verfahren schließen ein:
Punktmutageneseverfahren, z.B. durch Inkontaktbringen eines Sarcosinoxidase-Expressionsplasmids
(pSOM1), das das von der Gattung Bacillus stammende vorstehende
Sarcosinoxidasegen umfasst (beschrieben in JP Patentveröffentlichung
(nicht geprüfte
Anmeldung) Nr. 5-115281), mit einem chemischen Mutagen wie Hydroxylamin
oder salpetrige Säure
oder durch PCR-Zufallsmutagenese;
ein ortsspezifisches Mutagenese-Verfahren, das eine bekannte Technologie
der ortsspezifischen Substitutions- oder Deletionsmutation unter
Verwendung von im Handel erhältlichen
Kits ist; Verfahren zur selektiven Spaltung dieser rekombinanten
Plasmid-DNA und dann Entfernen oder Hinzufügen des ausgewählten Oligonucleotids,
gefolgt von Ligierungen des Plasmids; und ein Oligonucleotid-Mutagenese-Verfahren.
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Die
Vektor DNAs, die hier verwendet werden, können beliebige DNAs sein, wie
Plasmid-DNAs oder Bacteriophagen-DNAs.
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Anschließend werden
die wie vorstehend beschrieben behandelten DNAs unter Verwendung
einer demineralisierten Säule
wie einer Qiagen (Funakoshi)-Säule
gereinigt unter Erhalt verschiedener rekombinanter DNAs.
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Unter
Verwendung der so erhaltenen verschiedenen rekombinanten DNAs können z.B.
E. coli K12, vorzugsweise E. coli DH5α, E. coli JM109 (TOYOBO), oder
XL1-Blue (STRATAGENE)
transformiert oder transduziert werden um Transformanten oder Transduktanten
zu erhalten, die die rekombinanten DNAs umfassen, die Sarcosinoxidasengene
mit verschiedenen darin eingefügten
Mutationen tragen.
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Anschließend wird
die Reaktivität
der Sarcosinoxidasen für
N-Ethylglycin getestet und dann werden Transformanten oder Transduktanten
mit verringerter Reaktivität
für N-Ethylglycin
verglichen mit derjenigen der nicht modifizierten Sarcosinoxidasen
erhalten.
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Die
so erhaltenen Transformanten oder Transduktanten werden in Nährmedium
gezüchtet,
so dass sie in der Lage sind, große Mengen der modifizierten
Sarcosinoxidasen herzustellen. Als Kulturmedium wird hierin z.B.
ein Medium verwendet, das eine oder mehrere Stickstoffquellen aus
Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnen,
Weizen-Koji-Exudate oder ähnlichem
enthält,
das angemessen ergänzt
wurde mit einem oder mehreren anorganischen Salzen von Kaliumdihydrogenphosphat,
Dikaliumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenchlorid, Eisensulfat,
Mangansulfat oder ähnliches
und, falls nötig,
weiterhin mit Zucker, Vitaminen oder anderen Stoffen.
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Zusätzlich ist
es zweckmäßig, den
Anfangs-pH-Wert des Mediums auf z.B. 7 bis 9 einzustellen. Es wird
ebenfalls bevorzugt, das Züchten
bei einer Temperatur von z.B. 30°C
bis 42°C
und vorzugsweise etwa 37°C
für 6 bis
24 Stunden durchzuführen,
z.B. durch Submerskultur mit Belüftung
unter Rühren,
Schüttelkultur oder
stationäre
Kultur. Nach dem Züchten
können
herkömmliche
Mittel zum Gewinnen der Enzyme verwendet werden, um die Sarcosinoxidasen
aus den Kulturen zu gewinnen.
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Die
gezüchteten
Bakterienzellen werden z.B. durch Filtration oder Zentrifugation
von den Kulturen abgetrennt und dann gewaschen. Sarcosinoxidasen
werden vorzugsweise aus diesen Bakterienzellen gewonnen. In diesem
Fall können
die Bakterienzellen wie sie sind verwendet werden. Sarcosinoxidasen
werden vorzugsweise aus den Bakterienzellen gewonnen durch Aufbrechen
der Bakterienzellen mit Hilfe verschiedener Methoden zum Aufbrechen,
wie Schallhomogenisator, Frenchpresse oder Dyna-Mühle, Verfahren
zum Lysieren der Bakterienzellwand unter Verwendung von Enzymen,
die die Zellwand abbauen wie Lysozym, Verfahren zum Extrahieren
von Enzymen aus den Bakterienzellen unter Verwendung von oberflächenaktiven
Mitteln wie Triton X-100 oder ähnliches.
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Um
Sarcosinoxidasen aus der so erhaltenen rohen Enzymlösung zu
isolieren, können übliche Aufreinigungsmethoden
für Enzyme
verwendet werden. Zum Beispiel wird vorzugsweise eine geeignete
Kombination aus Ammoniumsulfatfällung,
Fällung
mit organischen Lösungsmitteln,
Ionaustauschchromatographie, Adsorptionschromatographie, Elektrophorese
und ähnliches
verwendet.
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Enzymaktivität
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Die
Aktivität
der Enzyme wurde unter den folgenden Bedingungen gemessen. Eine
Enzymaktivität,
die 1 Mikromol Harnstoff pro Minute erzeugen kann, ist definiert
als eine Einheit (U).
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Herstellung
der Reagenzien
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Die
folgenden Lösungen
wurden als Reagenzien für
die Reaktion hergestellt.
- 1) 0,2 M Sarcosin,
100 mM Tris-HCl, 2 mM KCl, 0,05% Triton-X100 (pH 7,7) oder 10 mM
N-Ethylglycin, 100 mM Tris-HCl, 2 mM KCl, 0,05% Triton-X100 (pH
7,7)
- 2) 80 U/ml POD-Lösung
- 3) 0,2% Phenol-Lösung
- 4) 0,2% 4-Aminoantipyrin-Lösung
- 5) 0,3% SDS-Lösung
- 6) 20 mM Tris-HCl, 1 mM KCl, 0,2% BSA (pH 7,7) (Enzymverdünnungsmittel)
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Anschließend wurde
jede der obigen Lösungen
in folgenden Mengen gemischt um eine Lösung zur Aktivitätsmessung
herzustellen.
- 1) 5 ml
- 2) 1 ml
- 3) 2 ml
- 4) 1 ml
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Messungen
wurden wie folgt durchgeführt:
- 1) 0,95 ml der Lösung zur Aktivitätsmessung
wurde bei 37°C
für 5 Minuten
vorinkubiert.
- 2) 0,05 ml einer Enzymlösung
(eingestellt auf zwischen 0,04 Einheiten/ml und 0,16 Einheiten/ml
mit dem Enzymverdünnungsmittel)
wurde hinzugefügt
und gemischt.
- 3) Die Reaktion wurde bei 37°C
für 10
Minuten durchgeführt.
- 4) Nach 10 Minuten Reaktion, wurde die vorstehende 0,3%ige SDS-Lösung hineingemischt.
- 5) Nachdem die Lösung
bei 25°C
10 Minuten gestanden hatte, wurde die optische Dichte bei 495 nm
gemessen (OD-Probe).
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Blindproben
wurden gemessen, indem die 0,3%ige SDS-Lösung vor dem Hinzufügen der
Enzymlösung
hineingemischt wurde (OD-Blindprobe).
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Die
vorliegende Erfindung wird nun insbesondere mit Hilfe von Beispielen
weiter beschrieben.
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Die
vorliegende Erfindung ist nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt.
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Beispiel 1
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E.
coli JM 109 (pSOM1), die eine rekombinante Plasmid-DNA enthalten
(pSOM1) (FERM BP-3604), wurden in einem LB-Medium (DIFCO) gezüchtet. Nach
dem Sammeln der Bakterienzellen, wurden die rekombinanten pSOM1-Plasmid-DNAs
aus diesen Zellen unter Verwendung von QIAGEN (QIAGEN) extrahiert
und gereinigt. Annähernd
100 μg des
rekombinanten Plasmids wurden erhalten.
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Unter
Verwendung des so erhaltenen Plasmids wurde eine „Error-Prone"-PCR mit N-terminalen
und C-terminalen Primern (SEQ ID Nr: 3 und 4) durchgeführt. Insbesondere
wurde Ex-taq (TAKARA SHUZO) mit diesem Primern bei einer Mangankonzentration
von 0,075 mM verwendet, und anschließend die PCR-Amplifikationreaktion
für pSOM1
durchgeführt.
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Nach
Abschluss der Reaktion, wurden die amplifizierten Fragmente der
Sarcosinoxidasegene mit verschiedenen, darin eingefügten Mutationen
mit Restriktionsenzymen BamHI und Spel behandelt, bevor sie in BamHI
und Spel Verdauungsprodukte der nicht mutierten rekombinanten pSOM1-Plasmid-DNA
unter Verwendung von T4-Ligase (Boehringer) ligiert wurden. Nach
Abschluss der Ligierung wurde die Reaktionslösung einer Transformation mit
kompetenten Hi E. coli JM 109 (TOYOBO) unterworfen und anschließend wurden
transformierte Kolonien erhalten.
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Anschließend wurden
die so erhaltenen Kolonien in 2 ml TY-Medium (das 25 μg/ml Kanamycin
und 1 mM IPTG enthielt) gezüchtet.
Nach 18 bis 24 Stunden Züchten
bei 37°C
wurden die Bakterienzellen mittels Zentrifugation gesammelt. Substitution
mit 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM KCl (pH 7,7), Beschallung und anschließend Zentrifugation
(12.000 Umdrehungen pro Minute (Upm) für 3 Minuten) wurden ausgeführt.
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Die
Aktivität
der so erhaltenen Überstände wurde
unter Verwendung von Sarcosin und N-Ethylglycin als Substrate gemessen.
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Es
wurde auf Enzyme getestet, die eine equivalente Sarcosinaktivität wie die
Enyzme vor der Mutation haben, die jedoch verglichen damit, eine
verringerte Aktivität
gegenüber
N-Ethylglycin aufweisen.
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Plasmide
wurden isoliert aus den Stämmen,
die die obigen Enzyme produzieren, und mit „pSOM5" bezeichnet (pSOM5 wurde bei der „International
Patent Organisms Depositary",
dem „National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology" (Tsukuba Central
6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan), unter FERM BP-10025
(umgewandelt von FERM P-19587) hinterlegt). Die Grundsequenz der
Sarcosinoxidasen, die durch dieses Plasmid codiert werden, wurde
unter Verwendung des CEQ 2000 DNA-Sequenziersystems (Beckman Coulter)
bestimmt, wodurch gezeigt wurde, dass bei der Sarcosinoxidase der
vorliegenden Erfindung Tyrosin an Aminosäureposition 269 durch Histidin
ersetzt worden ist (SEQ ID Nr:1).
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Beispiel 2
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Die
wie vorstehend beschrieben erhaltenen E. coli JM109 (pSOM5) mit
den modifizierten Sarcosinoxidasegenen wurden unter Schütteln in
100 ml eines TY-Mediums
(1 % Bacto-Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt und 0,5% NaCl (pH 7,5)),
das 25 μg/ml
Kanamycin enthält,
bei 37°C
für 16
Stunden gezüchtet.
Anschließend wurde mit 10 ml der Kultur 1 Liter TY-Medium,
das ähnlich
hergestellt worden war, angeimpft (mit der Ausnahme, dass es 1 mM
IPTG enthielt). Nach dem Animpfen wurde es bei 120 UpM bei 37°C für annähernd 20
Stunden gezüchtet.
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Schritt 1 (Herstellung
der rohen Enzymlösung)
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Nach
dem Abschluss des Züchtens
wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation von 1 Liter der Kulturlösung gesammelt
und die Bakterienzellen wurden in 50 ml einer Lösung (20 mM Tris-HCl und 50
mM EDTA (pH 8,0)) suspendiert.
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Die
so erhaltene Zellsuspension wurde einer Beschallung unterworfen,
so dass die Bakterienzellen aufgebrochen wurden und die rohe Enzymlösung erhalten
wurde.
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Schritt 2 (Ammoniumsulfatfällung)
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Die
Ammoniumsulfatfällung
wurde durchgeführt
durch Hinzufügen
von 20% Ammoniumsulfat zu 50 ml der rohen Enzymlösung, die wie oben beschrieben
erhalten wurde.
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Nach
der Ammoniumsulfatfällung
wurde das Präzipitat
in einem Puffer, der 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, und 2 mM EDTA umfasst,
gelöst.
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Schritt 3 (DEAE-TOYOPEARL-Ionenaustausch-Chromatographie)
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Die
vorstehende rohe Enzymlösung
wurde an eine Säule
adsorbiert, die mit 300 ml DEAE-TOYOPEARL (TOSOH), gepackt war,
mit 600 ml einer Lösung
(100 mM KCl, 20 mM Tris-HCl und 2 mM EDTA (pH 8,0)) gewaschen und
dann mit einer Lösung
(150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl und 2 mM EDTA (pH 8,0)) eluiert. Nach
der vollständigen
Elution wurden Fraktionen mit hoher Reinheit gesammelt, konzentriert
und gegen 50 mM Phosphatpuffer, der 50 mM KCl und 2 mM EDTA enthielt,
dialysiert.
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Schritt 4 (Sephadex G-75
Gelfiltration)
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Eine
mit 200 ml Sephadex G-75 (Pharmacia) gepackte und mit 50 mM Phosphatpuffer,
der 150 mM KCl und 2 mM EDTA enthielt, gepufferte Säule wurde
mit 15 ml der Enzymlösung,
die in Schritt 3 erhalten worden war beladen, um die Gelfiltration
durchzuführen.
Die Aktivität
des erhaltenen gereinigten Enzyms bei etwa OD 280 nm war annähernd 27
U.
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Beispiel 3
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Die
Reaktivität
für N-Ethylglycin
der modifizierten Sarcosinoxidase, die durch die oben beschriebene Methode
gereinigt wurde, wurde mit derjenigen einer nichtmodifizierten Sarcosinoxidase
verglichen, indem eine einheitliche Sarcosinoxidaseaktivität von 1,0
U/ml verwendet wurde.
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Wenn
die Aktivität
einer nicht modifizierten Sarcosinoxidase für N-Ethylglycin auf 100% festgelegt
wurde, war die Aktivität
für N-Ethylglycin
der modifizierten Sarcoxinoxidase (Y269H) 66,6%.
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Wie
vorstehend beschrieben, wurde eine verringerte Reaktivität für N-Ethylglycin
der erhaltenen modifizierten Sarcosinoxidase gezeigt.
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Desweiteren
waren die physicochemischen Eigenschaften der modifizierten Sarcosinoxidase
wie nachfolgend gezeigt.
pH-Optimum: etwa 8,0
pH-Stabilität: zwischen
6,5 und 11,0
Temperaturoptimum: 55°C
Hitzestabilität: 55°C oder weniger
(pH 7,5 und 10 Minuten)
Molekulargewicht: annähernd 43000
(SDS-PAGE)
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Alle
Veröffentlichungen,
Patente und Patentanmeldungen, die hierin zitiert sind, sind hierbei
unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen.
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