JP3215117B2 - コレステロールオキシダーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａおよびそれを用いた製造法 - Google Patents
コレステロールオキシダーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａおよびそれを用いた製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はコレステロールオキシダ
ーゼ（以下、ＣＨＯという）の遺伝情報を担うＤＮＡを
ベクターに組み込んだ組換えＤＮＡ及び該組換えＤＮＡ
を導入した形質転換体に関するものである。
ーゼ（以下、ＣＨＯという）の遺伝情報を担うＤＮＡを
ベクターに組み込んだ組換えＤＮＡ及び該組換えＤＮＡ
を導入した形質転換体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＣＨＯは次の反応式 コレステール＋Ｏ２→コレステ−４−エン−３−オン＋
Ｈ２Ｏ２で表される反応、即ち、コレステロールと１分
子の酸素からコレステ−４−エン３−オンと１分子の過
酸化水素を生ずる反応を触媒する酵素である。このよう
にＣＨＯはコレステロールを基質とする酸化酵素である
ことから、特に血中コレステロール定量用診断薬として
利用され、肝疾患、高血圧症の診断に有用である。
Ｈ２Ｏ２で表される反応、即ち、コレステロールと１分
子の酸素からコレステ−４−エン３−オンと１分子の過
酸化水素を生ずる反応を触媒する酵素である。このよう
にＣＨＯはコレステロールを基質とする酸化酵素である
ことから、特に血中コレステロール定量用診断薬として
利用され、肝疾患、高血圧症の診断に有用である。
【０００３】ＣＨＯはノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）
属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
属及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等
の微生物から生産されている。酵素の生産性を向上させ
るために従来より数々の検討がなされてきた。最近にな
ってストレプトマイセス属菌由来のＣＨＯの生産に関与
する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド
を調製し、これを用いて微生物を形質転換し、ＣＨＯを
生産するために誘導物質の添加を必要としない新規な微
生物によるＣＨＯの製造法が報告されている（特開昭６
２−２８５７８９）。
属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
属及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等
の微生物から生産されている。酵素の生産性を向上させ
るために従来より数々の検討がなされてきた。最近にな
ってストレプトマイセス属菌由来のＣＨＯの生産に関与
する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込んだプラスミド
を調製し、これを用いて微生物を形質転換し、ＣＨＯを
生産するために誘導物質の添加を必要としない新規な微
生物によるＣＨＯの製造法が報告されている（特開昭６
２−２８５７８９）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らはＣ
ＨＯの遺伝情報を担うＤＮＡ断片を得、それを組み込ん
でいる新規なプラスミドを調製し、更にこのプラスミド
によって形質転換された微生物を得、この微生物を培養
することによってＣＨＯを得ることに成功して本発明を
完成した。
ＨＯの遺伝情報を担うＤＮＡ断片を得、それを組み込ん
でいる新規なプラスミドを調製し、更にこのプラスミド
によって形質転換された微生物を得、この微生物を培養
することによってＣＨＯを得ることに成功して本発明を
完成した。
【０００５】すなわち、本発明はＣＨＯを生産するシュ
ードモナス属菌、更に詳しくシュードモナス・セパシア
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）Ｍ−１２
−３３（本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されその寄託番号は微工研条寄第２２９３号であ
る。）由来のＣＨＯの遺伝情報を有し、図１あるいは図
２に示されるような制限酵素切断地図を特徴とするＤＮ
Ａ断片及びこれを組み込んだプラスミド、さらにはこれ
が導入された大腸菌に関するものである。
ードモナス属菌、更に詳しくシュードモナス・セパシア
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）Ｍ−１２
−３３（本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されその寄託番号は微工研条寄第２２９３号であ
る。）由来のＣＨＯの遺伝情報を有し、図１あるいは図
２に示されるような制限酵素切断地図を特徴とするＤＮ
Ａ断片及びこれを組み込んだプラスミド、さらにはこれ
が導入された大腸菌に関するものである。
【０００６】ＣＨＯの遺伝子情報を担う染色体ＤＮＡは
シュードモナス・セパシアＭ−１２−３３よりフェノー
ル法などにより分離精製することができる。即ち、本菌
株を培養集菌後、リゾチーム処理、ＳＤＳ処理、プロテ
アーゼ処理を行い、フェノール処理を繰り返したのち、
エタノール沈澱法でＤＮＡの糸状の塊を取り出す。さら
にリボヌクレアーゼ処理を行った後再びエタノール沈澱
により染色体ＤＮＡを取り出す。染色体ＤＮＡは制限酵
素（例えばＳａｕ３ＡＩ）で部分分解した後、アガロー
ス電気泳動にかけ、適当なＤＮＡ断片を回収した。一
方、同じく制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）で消化したベ
クタープラスミドＤＮＡ（例えばｐＵＣ１８）にＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを作用させ連結する。
シュードモナス・セパシアＭ−１２−３３よりフェノー
ル法などにより分離精製することができる。即ち、本菌
株を培養集菌後、リゾチーム処理、ＳＤＳ処理、プロテ
アーゼ処理を行い、フェノール処理を繰り返したのち、
エタノール沈澱法でＤＮＡの糸状の塊を取り出す。さら
にリボヌクレアーゼ処理を行った後再びエタノール沈澱
により染色体ＤＮＡを取り出す。染色体ＤＮＡは制限酵
素（例えばＳａｕ３ＡＩ）で部分分解した後、アガロー
ス電気泳動にかけ、適当なＤＮＡ断片を回収した。一
方、同じく制限酵素（例えばＢａｍＨＩ）で消化したベ
クタープラスミドＤＮＡ（例えばｐＵＣ１８）にＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを作用させ連結する。
【０００７】以下に制限酵素としてＢａｍＨＩ及びＳａ
ｕ３ＡＩ、ベクタープラスミドＤＮＡとしてｐＵＣ１８
を例として本発明を説明する。前記の方法で得られた組
換え体ＤＮＡをコレステロールオキシダーゼ活性の無い
大腸菌に培養後、集菌し、塩化カルシウム処理を行い取
り込ませる。
ｕ３ＡＩ、ベクタープラスミドＤＮＡとしてｐＵＣ１８
を例として本発明を説明する。前記の方法で得られた組
換え体ＤＮＡをコレステロールオキシダーゼ活性の無い
大腸菌に培養後、集菌し、塩化カルシウム処理を行い取
り込ませる。
【０００８】ＣＨＯの遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み
込んだプラスミドＤＮＡを保持する大腸菌を選び出すに
は、アンピシリン耐性を保持し、β−ガラクトシダーゼ
活性を喪失した菌株を選択する。すなわち、アンピシリ
ン及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトシッドを含んだ培地（ポリペプトン１．０
％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％を含
有、以後Ｌ培地と言う）に寒天１．５％を含有した培地
で培養し、ここで生育するコロニーを形成する菌株の全
てをプレートアッセイ法により検出し、ＣＨＯ活性を示
す菌株を選択する。最終的に確認するためにはＬ培地で
この菌株を培養して酵素を抽出し、そのＣＨＯ活性を測
定する。
込んだプラスミドＤＮＡを保持する大腸菌を選び出すに
は、アンピシリン耐性を保持し、β−ガラクトシダーゼ
活性を喪失した菌株を選択する。すなわち、アンピシリ
ン及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトシッドを含んだ培地（ポリペプトン１．０
％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％を含
有、以後Ｌ培地と言う）に寒天１．５％を含有した培地
で培養し、ここで生育するコロニーを形成する菌株の全
てをプレートアッセイ法により検出し、ＣＨＯ活性を示
す菌株を選択する。最終的に確認するためにはＬ培地で
この菌株を培養して酵素を抽出し、そのＣＨＯ活性を測
定する。
【０００９】ついで上記の方法で得られた組換え体プラ
スミド保持株よりの組換え体ＤＮＡの分離は以下の方法
で行う。
スミド保持株よりの組換え体ＤＮＡの分離は以下の方法
で行う。
【００１０】培養後、菌体を集め、リゾチーム処理、Ｓ
ＤＳ−ＮａＯＨ処理、酢酸カリウム処理を行い、遠心分
離して得られた上澄にイソプロパノールを加えて、プラ
スミドを抽出する。そしてリボヌクレアーゼ処理、フェ
ノール処理、クロロホルム・イソアミルアルコール処理
を行ってＲＮＡ、タンパク質を除いた後、エタノール沈
澱を行ってプラスミドを得る。このようにして得られた
組換え体ＤＮＡは再び大腸菌に導入する事ができる。
ＤＳ−ＮａＯＨ処理、酢酸カリウム処理を行い、遠心分
離して得られた上澄にイソプロパノールを加えて、プラ
スミドを抽出する。そしてリボヌクレアーゼ処理、フェ
ノール処理、クロロホルム・イソアミルアルコール処理
を行ってＲＮＡ、タンパク質を除いた後、エタノール沈
澱を行ってプラスミドを得る。このようにして得られた
組換え体ＤＮＡは再び大腸菌に導入する事ができる。
【００１１】上記のようにして得られた組換え体プラス
ミドを保持する大腸菌を常法により培養し、ソニケータ
ーなどで破砕することにより、ＣＨＯの粗酵素液を得る
ことができる。
ミドを保持する大腸菌を常法により培養し、ソニケータ
ーなどで破砕することにより、ＣＨＯの粗酵素液を得る
ことができる。
【００１２】以下に本発明を実施例により更に明確にす
る。
る。
（１） ＣＨＯ遺伝子を担う染色体ＤＮＡの抽出 シュードモナス・セパシアＭ−１２−３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２２９３）を下記に示す培地（前培養培地及び本
培養培地）を用いて培養した。なお、前培養でＣＨＯ前
培養培地５ｍｌ、３０℃で２４時間培養したものを、Ｃ
ＨＯ本培養培地５０ｍｌに０．１ｍｌ接種し２８℃で４
１時間培養した。そして、培養液を遠心した上清を粗酵
素液とした。
ＢＰ−２２９３）を下記に示す培地（前培養培地及び本
培養培地）を用いて培養した。なお、前培養でＣＨＯ前
培養培地５ｍｌ、３０℃で２４時間培養したものを、Ｃ
ＨＯ本培養培地５０ｍｌに０．１ｍｌ接種し２８℃で４
１時間培養した。そして、培養液を遠心した上清を粗酵
素液とした。
【００１３】ＣＨＯ前培養培地（ｐＨ６．０） グルコース １．０％ グルタミン酸ナトリウム ０．５％ 肉エキス ０．２％ ＫＨ2ＰＯ4 ０．１％ ＭｇＳＯ4 ０．０５％ ＦｅＣｌ2 １ ｐ．ｐ．ｍ．
【００１４】ＣＨＯ本培養培地（ｐＨ４．３） グルコース ２．０％ グルタミン酸ナトリウム ０．５％ 尿素 ０．５％ コーンスティープリカー ０．２％ 肉エキス ０．２％ ＫＨ2ＰＯ4 ０．２％ ＭｇＳＯ4 ０．１％ ＺｎＣｌ2 ２ ｐ．ｐ．ｍ． ＦｅＣｌ2 １ ｐ．ｐ．ｍ．
【００１５】得られた粗酵素液を用いて［Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，４４巻，３６７〜３８１頁
（１９８０）］に記載の方法に従って染色体ＤＮＡの調
製を行なった。つまり、得られた培養液にフェノール処
理を３回繰り返し、２，０００×ｇで１５分間遠心分離
し、その上澄を得る。得られた上澄に３Ｍの酢酸ナトリ
ウム及びエタノールを加えてガラス棒で巻き取る。更に
５０ｍＭのｐＨ７．５トリス・塩酸緩衝液（１ｍＭのＥ
ＤＴＡを含有）を加え、２００μｇ／ｍｌのリボヌクレ
アーゼ溶液を４℃，１２時間作用させる。作用後、クロ
ロホルム処理を行い更に１，０００×ｇで１５分間遠心
分離し、上澄部を得る。得られた上澄部に３Ｍの酢酸ナ
トリウム及びエタノールを加えてガラス棒で巻き取り、
ＤＮＡを得る。得られたＤＮＡを５０ｍＭのｐＨ７．５
のトリス・塩酸緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡを含有）で溶
解して染色体ＤＮＡ溶液を得た。培養液１００ｍｌから
約９００μｇの染色体ＤＮＡを得た。
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，４４巻，３６７〜３８１頁
（１９８０）］に記載の方法に従って染色体ＤＮＡの調
製を行なった。つまり、得られた培養液にフェノール処
理を３回繰り返し、２，０００×ｇで１５分間遠心分離
し、その上澄を得る。得られた上澄に３Ｍの酢酸ナトリ
ウム及びエタノールを加えてガラス棒で巻き取る。更に
５０ｍＭのｐＨ７．５トリス・塩酸緩衝液（１ｍＭのＥ
ＤＴＡを含有）を加え、２００μｇ／ｍｌのリボヌクレ
アーゼ溶液を４℃，１２時間作用させる。作用後、クロ
ロホルム処理を行い更に１，０００×ｇで１５分間遠心
分離し、上澄部を得る。得られた上澄部に３Ｍの酢酸ナ
トリウム及びエタノールを加えてガラス棒で巻き取り、
ＤＮＡを得る。得られたＤＮＡを５０ｍＭのｐＨ７．５
のトリス・塩酸緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡを含有）で溶
解して染色体ＤＮＡ溶液を得た。培養液１００ｍｌから
約９００μｇの染色体ＤＮＡを得た。
【００１６】（２） 染色体ＤＮＡの制限酵素による部
分分解及びリガーゼ処理 ベクターとしてプラスミドｐＵＣ１８を使用し、このプ
ラスミド５０μｇ にＢａｍＨＩ 制限酵素１０単位を
加え、１０ｍＭのｐＨ７．５トリス・塩酸緩衝液、５０
ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム及
び１ｍＭのジチオスレイトールの溶液６０μｌ中で３７
℃、１２時間分解した。反応後、フェノール・クロロホ
ルム処理を一度行い、エタノール沈澱でプラスミドを沈
澱させる。得られたプラスミドに１ＭのｐＨ８．３トリ
ス・塩酸緩衝液１５μｌにアルカリフォスファターゼ１
単位を加え、６０℃で１時間の処理を行い、１００ｍＭ
のＥＤＴＡを含む溶液（ｐＨ７．５）で反応を停止した
後、フェノール・クロロホルム処理を２回行い１２，０
００×ｇで５分間遠心分離する。得られた上澄を更に２
回クロロホルムで処理した後、上記と同じ条件で遠心分
離し、上澄部よりエタノール沈澱によって末端処理した
完全分解プラスミドｐＵＣ１８を得る。
分分解及びリガーゼ処理 ベクターとしてプラスミドｐＵＣ１８を使用し、このプ
ラスミド５０μｇ にＢａｍＨＩ 制限酵素１０単位を
加え、１０ｍＭのｐＨ７．５トリス・塩酸緩衝液、５０
ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム及
び１ｍＭのジチオスレイトールの溶液６０μｌ中で３７
℃、１２時間分解した。反応後、フェノール・クロロホ
ルム処理を一度行い、エタノール沈澱でプラスミドを沈
澱させる。得られたプラスミドに１ＭのｐＨ８．３トリ
ス・塩酸緩衝液１５μｌにアルカリフォスファターゼ１
単位を加え、６０℃で１時間の処理を行い、１００ｍＭ
のＥＤＴＡを含む溶液（ｐＨ７．５）で反応を停止した
後、フェノール・クロロホルム処理を２回行い１２，０
００×ｇで５分間遠心分離する。得られた上澄を更に２
回クロロホルムで処理した後、上記と同じ条件で遠心分
離し、上澄部よりエタノール沈澱によって末端処理した
完全分解プラスミドｐＵＣ１８を得る。
【００１７】（１）で得られた染色体ＤＮＡを使用し、
このＤＮＡ２００μｇにＳａｕ３ＡＩ制限酵素１０単位
を加え、６ｍＭのｐＨ７．５ トリス・塩酸緩衝液、５
０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化マグネシウム及
び１ｍＭのジチオスレイトールの溶液４．５ｍｌ中で３
７℃、１時間分解した。反応後、フェノール・クロロホ
ルム処理を一度行い、エタノール沈澱でＤＮＡを沈澱さ
せる。得られたＤＮＡにフェノール・クロロホルム処理
を２回行い１２，０００×ｇで５分間遠心分離する。得
られた上澄を更に２回クロロホルムで処理した後、上記
と同じ条件で遠心分離し、上澄部よりエタノール沈澱に
よってシュードモナス・セパシアＭ−１２−３３株のＳ
ａｕ３ＡＩ制限酵素分解物を回収し、減圧乾燥後，水５
０μｌに溶解した。
このＤＮＡ２００μｇにＳａｕ３ＡＩ制限酵素１０単位
を加え、６ｍＭのｐＨ７．５ トリス・塩酸緩衝液、５
０ｍＭの塩化ナトリウム、５ｍＭの塩化マグネシウム及
び１ｍＭのジチオスレイトールの溶液４．５ｍｌ中で３
７℃、１時間分解した。反応後、フェノール・クロロホ
ルム処理を一度行い、エタノール沈澱でＤＮＡを沈澱さ
せる。得られたＤＮＡにフェノール・クロロホルム処理
を２回行い１２，０００×ｇで５分間遠心分離する。得
られた上澄を更に２回クロロホルムで処理した後、上記
と同じ条件で遠心分離し、上澄部よりエタノール沈澱に
よってシュードモナス・セパシアＭ−１２−３３株のＳ
ａｕ３ＡＩ制限酵素分解物を回収し、減圧乾燥後，水５
０μｌに溶解した。
【００１８】４μｌの末端処理した完全分解プラスミド
ｐＵＣ１８と１０μｌの部分分解シュードモナス・セパ
シアＭ−１２−３３株のＳａｕ３ＡＩ制限酵素分解物を
混合し、緩衝液（６６ｍＭの塩化マグネシウム、６６０
μＭのＡＴＰ及び１００ｍＭのジチオスレイトールを含
む６６０ｍＭのｐＨ７．６トリス・塩酸緩衝液）を５μ
ｌ及び水３０μｌを加えた後、１０００単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより１６℃で２０時間反応させて、ベクタ
ーと染色体ＤＮＡを連結させた組換えプラスミドを得
た。
ｐＵＣ１８と１０μｌの部分分解シュードモナス・セパ
シアＭ−１２−３３株のＳａｕ３ＡＩ制限酵素分解物を
混合し、緩衝液（６６ｍＭの塩化マグネシウム、６６０
μＭのＡＴＰ及び１００ｍＭのジチオスレイトールを含
む６６０ｍＭのｐＨ７．６トリス・塩酸緩衝液）を５μ
ｌ及び水３０μｌを加えた後、１０００単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼにより１６℃で２０時間反応させて、ベクタ
ーと染色体ＤＮＡを連結させた組換えプラスミドを得
た。
【００１９】（３） 組換えプラスミドを用いた大腸菌
の形質転換 エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０９株を１０ｍｌのＳＯＢ培地（バクトトリ
プトン２％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１０
ｍＭ、塩化カリウム２．５ｍＭ 、塩化マグネシウム１
０ｍＭ及び硫酸マグネシウム１０ｍＭを含むｐＨ６．８
〜７．０の培地）に接種し、３７℃で７０分間振とう培
養したのち集菌する。菌体を１００ｍＭの冷塩化カルシ
ウム溶液２００ｍｌに懸濁して氷中で２０分間放置後、
遠心集菌する。更に１００ｍＭの冷塩化カルシウム溶液
５ｍｌに懸濁して氷中で２４時間放置後、その０．２ｍ
ｌに組換えプラスミド１０μｌを加え懸濁して氷中で６
０分間放置する。ついで４２℃で２分間熱処理し、直ち
に冷却する。その後Ｌ培地１ｍｌを加えて３７℃で４０
分間振とう培養する。これを５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンと５０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトシッドを含んだＬ培地
（寒天１．５ ％を含有）を用いて３７℃で１２時間培
養し、白色コロニー菌株（５０００株）の全てを５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬ培地（寒天１．５％
を含有）に接種して３７℃で１２時間培養した。活性の
あるコロニーの検出は、以下のプレートアッセイ法によ
って行った。
の形質転換 エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０９株を１０ｍｌのＳＯＢ培地（バクトトリ
プトン２％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１０
ｍＭ、塩化カリウム２．５ｍＭ 、塩化マグネシウム１
０ｍＭ及び硫酸マグネシウム１０ｍＭを含むｐＨ６．８
〜７．０の培地）に接種し、３７℃で７０分間振とう培
養したのち集菌する。菌体を１００ｍＭの冷塩化カルシ
ウム溶液２００ｍｌに懸濁して氷中で２０分間放置後、
遠心集菌する。更に１００ｍＭの冷塩化カルシウム溶液
５ｍｌに懸濁して氷中で２４時間放置後、その０．２ｍ
ｌに組換えプラスミド１０μｌを加え懸濁して氷中で６
０分間放置する。ついで４２℃で２分間熱処理し、直ち
に冷却する。その後Ｌ培地１ｍｌを加えて３７℃で４０
分間振とう培養する。これを５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンと５０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトシッドを含んだＬ培地
（寒天１．５ ％を含有）を用いて３７℃で１２時間培
養し、白色コロニー菌株（５０００株）の全てを５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬ培地（寒天１．５％
を含有）に接種して３７℃で１２時間培養した。活性の
あるコロニーの検出は、以下のプレートアッセイ法によ
って行った。
【００２０】コロニーの成育した平板培地をクロロホル
ム処理した後、基質溶液を噴霧する。そして３０分放置
し、重層寒天培地を重層し３７℃でインキュベートす
る。活性のあるコロニーは、キノンイミン色素による発
色によって検出される。なお、基質溶液として、コレス
テロール５０ｍｇ／ｍｌ（イソプロパノール溶液）を用
いた。また、重層寒天培地としては、フェノールを２２
ｍｇ、４−アミノアンチピリンを２ｍｇ、トリトンＸ−
１００を１１６ｍｇ、パーオキシダーゼを１００単位含
有する２０ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０、１．５％寒天）を使用した。
ム処理した後、基質溶液を噴霧する。そして３０分放置
し、重層寒天培地を重層し３７℃でインキュベートす
る。活性のあるコロニーは、キノンイミン色素による発
色によって検出される。なお、基質溶液として、コレス
テロール５０ｍｇ／ｍｌ（イソプロパノール溶液）を用
いた。また、重層寒天培地としては、フェノールを２２
ｍｇ、４−アミノアンチピリンを２ｍｇ、トリトンＸ−
１００を１１６ｍｇ、パーオキシダーゼを１００単位含
有する２０ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０、１．５％寒天）を使用した。
【００２１】上記操作によりキノンイミン色素の生成が
みられた菌株（２株）を選択した。 （４） 組換え体プラスミドを保持する大腸菌の産生す
るＣＨＯ活性
みられた菌株（２株）を選択した。 （４） 組換え体プラスミドを保持する大腸菌の産生す
るＣＨＯ活性
【００２２】（３）で選択した形質転換した大腸菌を１
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地で培養（３７
℃、１７時間）し、さらに５０ｍｌの同培地に１／１０
００接種し、３７℃で１８時間培養した。集菌後、アル
ミナ破砕により、粗酵素液を得、硫安塩析、透析処理し
て酵素液を得た。そのＣＨＯ活性は以下のようにして測
定した。
０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地で培養（３７
℃、１７時間）し、さらに５０ｍｌの同培地に１／１０
００接種し、３７℃で１８時間培養した。集菌後、アル
ミナ破砕により、粗酵素液を得、硫安塩析、透析処理し
て酵素液を得た。そのＣＨＯ活性は以下のようにして測
定した。
【００２３】試薬（ａ）として、１００ｍｌの０．１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に４−アミノアン
チピリンを５．５ｍｇ、フェノールを５５ｍｇ、トリト
ンＸ−１００を２９０ｍｇ含有、試薬（ｂ）として、パ
ーオキシダーゼを１６５ｕｎｉｔ／ｍｌ、試薬（ｃ）と
して、コレステロール２３０ｍｇ／１００ｍｌイソプロ
パノールを使用した。
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に４−アミノアン
チピリンを５．５ｍｇ、フェノールを５５ｍｇ、トリト
ンＸ−１００を２９０ｍｇ含有、試薬（ｂ）として、パ
ーオキシダーゼを１６５ｕｎｉｔ／ｍｌ、試薬（ｃ）と
して、コレステロール２３０ｍｇ／１００ｍｌイソプロ
パノールを使用した。
【００２４】３７℃の恒温セルホルダーにセルを入れ、
予熱後試薬（ｃ）５０μｌ、試薬（ａ）２．９ｍｌ、試
薬（ｂ）５０μｌを入れ、混合し５分間プレインキュベ
ートする。酵素液１００μｌを加えて３分後、及び５分
後の５００ｎｍの吸光度を測定する。１単位は、上記の
測定条件において１分間に１μｍｏｌｅのＨ2Ｏ2の生成
する酵素量とする。
予熱後試薬（ｃ）５０μｌ、試薬（ａ）２．９ｍｌ、試
薬（ｂ）５０μｌを入れ、混合し５分間プレインキュベ
ートする。酵素液１００μｌを加えて３分後、及び５分
後の５００ｎｍの吸光度を測定する。１単位は、上記の
測定条件において１分間に１μｍｏｌｅのＨ2Ｏ2の生成
する酵素量とする。
【００２５】
【式１】
【００２６】但し、ｎ；希釈率、Ａ3，Ａ6；３分後、６
分後の吸光度、Ａb6，Ａb3；３分後、６分後のブランク
の吸光度、６．８；キノンイミン色素の分子吸光係数を
示す。
分後の吸光度、Ａb6，Ａb3；３分後、６分後のブランク
の吸光度、６．８；キノンイミン色素の分子吸光係数を
示す。
【００２７】組換え体プラスミドを保持する大腸菌の生
産する酵素は１０００ｍｌの培養液当りで約４８単位で
あった。
産する酵素は１０００ｍｌの培養液当りで約４８単位で
あった。
【００２８】（５） 組換え体プラスミドの制限酵素地
図の作製 （３）で得られた形質転換株３株を１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬ培地２０００ｍｌ中で３７℃で１
４時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離（１，５
００×ｇ，１０分）して集菌する。更にリゾチーム溶液
〔５０ｍＭのグルコース，１０ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍ
ｇ／ｍｌのリゾチームを含有する２５ｍＭのトリス・塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕を加えて、氷中で５分間処理
し、ＳＤＳ−ＮａＯＨ溶液（１％のＳＤＳを含有する
０．２％水酸化ナトリウム溶液）を加えて同様に氷中で
５分間処理し、更に酢酸カリウム溶液〔５Ｍの酢酸カリ
ウム溶液を６０ｍｌと氷酢酸２８．５ｍｌ及び水１１．
５ｍｌの混合溶液（ｐＨ４．８）〕を加えてドライアイ
ス・エタノールの冷媒中で凍結し、続いて室温で解凍す
る。
図の作製 （３）で得られた形質転換株３株を１００μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬ培地２０００ｍｌ中で３７℃で１
４時間振とう培養した。培養終了後、遠心分離（１，５
００×ｇ，１０分）して集菌する。更にリゾチーム溶液
〔５０ｍＭのグルコース，１０ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍ
ｇ／ｍｌのリゾチームを含有する２５ｍＭのトリス・塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕を加えて、氷中で５分間処理
し、ＳＤＳ−ＮａＯＨ溶液（１％のＳＤＳを含有する
０．２％水酸化ナトリウム溶液）を加えて同様に氷中で
５分間処理し、更に酢酸カリウム溶液〔５Ｍの酢酸カリ
ウム溶液を６０ｍｌと氷酢酸２８．５ｍｌ及び水１１．
５ｍｌの混合溶液（ｐＨ４．８）〕を加えてドライアイ
ス・エタノールの冷媒中で凍結し、続いて室温で解凍す
る。
【００２９】これを遠心分離（１２，０００×ｇ，１５
分）して上澄を採取する。更に採取した上澄にイソプロ
パノールを加えてドライアイス・エタノールの冷媒中で
凍結し、続いて室温で解凍する。更にこれを遠心分離
（１２，０００×ｇ，５分）してプラスミドを抽出す
る。これを７０％エタノールで洗浄・乾燥し、さらに１
０ｍＭのｐＨ８．０トリス・塩酸緩衝液（１ｍＭのＥＤ
ＴＡ含有）（以下、ＴＥ緩衝液という）を加えて懸濁
し、リボヌクレアーゼ溶液を室温で１５分間作用させ
る。作用後、フェノール及びクロロホルム：イソアミル
アルコール＝２４：１の混液との等量混合物で処理し、
１２，０００×ｇで５分間遠心分離して上澄部を得る。
得られた上澄部を更にクロロホルム：イソアミルアルコ
ール＝２４：１の混液で処理し、１２，０００×ｇで５
分間遠心分離して上澄部を得る。ついで３Ｍの酢酸ナト
リウム及び９５％エタノールを加えて凍結・溶解操作し
たのち１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、沈澱部を
得る。得られた沈澱部を更に７０％エタノールで洗浄・
遠心分離後ＴＥ緩衝液に溶解し、エチジウムブロマイド
−塩化セシウム平衡密度勾配遠心にかけてプラスミド
（各々、ｐＣＨＯ１及びｐＣＨＯ２とする）を得る。得
られたプラスミドを各種の制限酵素で切断し、制限酵素
切断地図を作製した。その結果、２種類の遺伝子がクロ
ーニングされたことを確認した（図１及び図２）。ｐＣ
ＨＯ１とｐＣＨＯ２は、同一の遺伝子の長さの違う断片
が挿入されていることがわかった。
分）して上澄を採取する。更に採取した上澄にイソプロ
パノールを加えてドライアイス・エタノールの冷媒中で
凍結し、続いて室温で解凍する。更にこれを遠心分離
（１２，０００×ｇ，５分）してプラスミドを抽出す
る。これを７０％エタノールで洗浄・乾燥し、さらに１
０ｍＭのｐＨ８．０トリス・塩酸緩衝液（１ｍＭのＥＤ
ＴＡ含有）（以下、ＴＥ緩衝液という）を加えて懸濁
し、リボヌクレアーゼ溶液を室温で１５分間作用させ
る。作用後、フェノール及びクロロホルム：イソアミル
アルコール＝２４：１の混液との等量混合物で処理し、
１２，０００×ｇで５分間遠心分離して上澄部を得る。
得られた上澄部を更にクロロホルム：イソアミルアルコ
ール＝２４：１の混液で処理し、１２，０００×ｇで５
分間遠心分離して上澄部を得る。ついで３Ｍの酢酸ナト
リウム及び９５％エタノールを加えて凍結・溶解操作し
たのち１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、沈澱部を
得る。得られた沈澱部を更に７０％エタノールで洗浄・
遠心分離後ＴＥ緩衝液に溶解し、エチジウムブロマイド
−塩化セシウム平衡密度勾配遠心にかけてプラスミド
（各々、ｐＣＨＯ１及びｐＣＨＯ２とする）を得る。得
られたプラスミドを各種の制限酵素で切断し、制限酵素
切断地図を作製した。その結果、２種類の遺伝子がクロ
ーニングされたことを確認した（図１及び図２）。ｐＣ
ＨＯ１とｐＣＨＯ２は、同一の遺伝子の長さの違う断片
が挿入されていることがわかった。
【００３０】（６） 活性領域の特定 ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫ-、及びエシエリヒア・
コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を用いｐＣＨＯ１についてサ
ブクローニングを行った。得られたプラスミドをｐＣＨ
Ｏ１−１及びｐＣＨＯ１−２とする。これによって活性
のある領域を確認したところ、ＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩの
３．２ｋｂ断片に活性があることが確認された（図
３）。又、サブクローニングにより活性は約６倍に上昇
した。
コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を用いｐＣＨＯ１についてサ
ブクローニングを行った。得られたプラスミドをｐＣＨ
Ｏ１−１及びｐＣＨＯ１−２とする。これによって活性
のある領域を確認したところ、ＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩの
３．２ｋｂ断片に活性があることが確認された（図
３）。又、サブクローニングにより活性は約６倍に上昇
した。
【００３１】
【表１】
【００３２】（７） サザンハイブリダイゼーションに
よる確認 シュードモナス・セパシアＭ−１２−３３染色体ＤＮＡ
をＳａｃＩ及びＳｍａＩで完全分解し、電気泳動後、ナ
イロンメンブランにトランスファーした。そして、ｐＣ
ＨＯ１のＳａｃＩ−ＳｍａＩの４．３ｋｂ断片からマル
チプライム法により調製した32Ｐでラベルされたプロー
ブと５０％ホルムアミド存在下、４２℃で一晩ハイブリ
ダイゼーションを行ったところ、４．３ｋｂの断片がハ
イブリダイズし、クローニングされた断片がシュードモ
ナス・セパシアＭ−１２−３３染色体ＤＮＡ由来である
ことが確認された。
よる確認 シュードモナス・セパシアＭ−１２−３３染色体ＤＮＡ
をＳａｃＩ及びＳｍａＩで完全分解し、電気泳動後、ナ
イロンメンブランにトランスファーした。そして、ｐＣ
ＨＯ１のＳａｃＩ−ＳｍａＩの４．３ｋｂ断片からマル
チプライム法により調製した32Ｐでラベルされたプロー
ブと５０％ホルムアミド存在下、４２℃で一晩ハイブリ
ダイゼーションを行ったところ、４．３ｋｂの断片がハ
イブリダイズし、クローニングされた断片がシュードモ
ナス・セパシアＭ−１２−３３染色体ＤＮＡ由来である
ことが確認された。
【００３３】（８） クローニング株からのＣＨＯの精
製 シュードモナス・セパシアＭ−１２−３３のＣＨＯとク
ローニング株の生産する酵素の性質を比較するためにＸ
Ｌ１−ｂｌｕｅ（ｐＣＨＯ−１）からの酵素の精製を試
みた。
製 シュードモナス・セパシアＭ−１２−３３のＣＨＯとク
ローニング株の生産する酵素の性質を比較するためにＸ
Ｌ１−ｂｌｕｅ（ｐＣＨＯ−１）からの酵素の精製を試
みた。
【００３４】１００℃煮沸して調整した沈殿性コレステ
ロールへのアフィニティーによるコレステロールオキシ
ダーゼの特異性な精製法を用いてＣＨＯ精製を行った。
ＸＬ１−ｂｌｕｅ（ｐＣＨＯ−１）を１１培養し、集菌
後、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄後、アルミナ磨砕し、５０ｍｌの０．１Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液で抽出し粗酵素液とした。次に粗酵素液に１
５ｇの沈殿性コレステロールを加え３０分攪拌した後、
遠心して上清を除いた。次に沈殿を５０ｍｌの０．１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液で３０分攪拌し洗浄する操作を３
回繰り返した。次に０．０１％トリトンＸ−１００を含
む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を５ｍ
ｌ加え、３０分攪拌した後、遠心して、上清を０．０１
％トリトンＸ−１００溶出画分とした。同様に０．０５
％及び０．１％トリトンＸ−１００による溶出も行っ
た。その結果、６０％の回収率で、比活性が５．３倍ま
で精製された。
ロールへのアフィニティーによるコレステロールオキシ
ダーゼの特異性な精製法を用いてＣＨＯ精製を行った。
ＸＬ１−ｂｌｕｅ（ｐＣＨＯ−１）を１１培養し、集菌
後、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗
浄後、アルミナ磨砕し、５０ｍｌの０．１Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液で抽出し粗酵素液とした。次に粗酵素液に１
５ｇの沈殿性コレステロールを加え３０分攪拌した後、
遠心して上清を除いた。次に沈殿を５０ｍｌの０．１Ｍ
リン酸カリウム緩衝液で３０分攪拌し洗浄する操作を３
回繰り返した。次に０．０１％トリトンＸ−１００を含
む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を５ｍ
ｌ加え、３０分攪拌した後、遠心して、上清を０．０１
％トリトンＸ−１００溶出画分とした。同様に０．０５
％及び０．１％トリトンＸ−１００による溶出も行っ
た。その結果、６０％の回収率で、比活性が５．３倍ま
で精製された。
【００３５】
【表２】
【００３６】また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで主にＭＷ５６０
００，５９０００及び６２０００前後にバンドが確認さ
れた。
００，５９０００及び６２０００前後にバンドが確認さ
れた。
【００３７】これらの分子量の違いは、シグナルペプチ
ドの有無によるものであり、シグナルペプチドのとれた
形のものがＭＷ５６０００のものであり、シュードモナ
ス・セパシアＭ−１２−３３の菌体外酵素と同一のもの
と考えられる。
ドの有無によるものであり、シグナルペプチドのとれた
形のものがＭＷ５６０００のものであり、シュードモナ
ス・セパシアＭ−１２−３３の菌体外酵素と同一のもの
と考えられる。
【００３８】
【発明の効果】ＣＨＯが本発明により培養が容易な大腸
菌を使用して製造できるようになった。
菌を使用して製造できるようになった。
【図１】プラスミドｐＣＨＯ１の制限酵素地図を表す
図。
図。
【図２】プラスミドｐＣＨＯ２の制限酵素地図を表す
図。
図。
【図３】プラスミドｐＣＨＯ１のサブクローニングの結
果の活性断片を表す図。
果の活性断片を表す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） 1:38） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/02 - 9/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＰＩＲ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｃｃｐａｃｉａ）由来のコレステロールオ
キシターゼの遺伝情報を担うＤＮＡであって、以下に示
す制限酵素地図 あるいは で規定され、かつ活性領域が以下に示す に規定する３．２ｋｂの塩基対数を有するＤＮＡ断片に
存在する該ＤＮＡをベクターに組み込んだ組換えＤＮ
Ａ。 - 【請求項２】請求項１記載のＤＮＡを導入した大腸菌。
- 【請求項３】請求項２記載の大腸菌を培養し、コレステ
ロールオキシダーゼを培養物中に産生せしめ、該培養物
中よりコレステロールオキシダーゼを採取することを特
徴とするコレステロールオキシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05934591A JP3215117B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | コレステロールオキシダーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａおよびそれを用いた製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05934591A JP3215117B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | コレステロールオキシダーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａおよびそれを用いた製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06189754A JPH06189754A (ja) | 1994-07-12 |
| JP3215117B2 true JP3215117B2 (ja) | 2001-10-02 |
Family
ID=13110618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05934591A Expired - Fee Related JP3215117B2 (ja) | 1991-02-28 | 1991-02-28 | コレステロールオキシダーゼ遺伝子を含む組換えｄｎａおよびそれを用いた製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3215117B2 (ja) |
-
1991
- 1991-02-28 JP JP05934591A patent/JP3215117B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06189754A (ja) | 1994-07-12 |
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