JP2917400B2 - 耐熱性キサンチンオキシダーゼおよびその製造法 - Google Patents

耐熱性キサンチンオキシダーゼおよびその製造法

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な耐熱性キサンチンオキシダーゼおよび
その製造法に関するものである。本発明のキサンチンオ
キシダーゼはヒポキサンチンおよびキサンチンを酸化
し、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であり、
熱安定性に優れることを特徴とする。
本発明のキサンチンオキシダーゼは腎炎・甲状腺障害
の指標となる無機リン、免疫疾患の指標となるアデノシ
ンデアミナーゼ等を測定するために用いられる。
（従来の技術） 従来、牛乳中にこの酵素の存在が知られているが、牛
乳に由来するキサンチンオキシダーゼはヒポキサンチン
およびキサンチンを含有する試料に作用させ、生成する
過酸化水素を色素に変換せしめた場合、短時間に色素が
分解されて、過酸化水素に基づく定量ができない。
又、微生物に由来するものとして、シュードモナス
属、エシエリキア属、アースロバクター属、ノカルデイ
ア属等に属する微生物から得られる酵素〔J.Bacteriolo
gy,130,1175（1977）,J.Bacteriol.,135,422（1978）〕
や、エンテロバクター・クロアカエから得られる酵素
〔A.B.C.,45,425（1981）〕が知られているが、活性や
熱安定性において充分ではなかった。
（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは上記の背景を踏まえ、公知のキサンチン
オキシダーゼよりも熱安定性の優れたキサンチンオキシ
ダーゼを見出そうと試みた。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を重ね
た結果、アースロバクター属に属する微生物から熱安定
性に優れたキサンチンオキシダーゼを見い出した。すな
わち、本発明は少なくともヒポキサンチンおよびキサン
チンに基質特異性を有し、ヒポキサンチンをキサンチン
して酸化し、さらにキサンチンを尿酸に酸化する反応
（下記反応式参照）を触媒し、酵素を電子受容体とし過
酸化水素を生成するキサンチンオキシダーゼにおいて、
60℃、30分間処理で少なくとも70％の残存活性を有する
ことを特徴とする耐熱性キサンチンオキシダーゼであ
る。
反応式：ヒポキサンチン＋O2→キサンチン＋H2O2 キサンチン＋O2→尿素＋H2O2 また、本発明はアースロバクター属に属し、耐熱性キ
サンチンオキシダーゼの生産能を有する菌株を栄養培地
にて培養し、該培養物から耐熱性キサンチンオキシダー
ゼを採取することを特徴とする、耐熱性キサンチンオキ
シダーゼの製造法である。
本発明に用いる微生物は上記性質を有するキサンチン
オキシダーゼを産生しうるアースロバクター属菌などで
あって、好適な例としては、アースロバクター・ルーテ
ウス（Arthrdacter Iuteus）ATCC 21606などが挙げら
れる。
本発明の酵素を製造するにあたっては、キサンチンオ
キシダーゼ生産菌を酵素を生産する通常の方法で培養す
る。使用する培地組成としては、使用菌株が資化しうる
炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含
有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用
できる。また、キサンチンオキシダーゼの生産誘導物質
として、ヒポキサンチン、キサンチン等の核酸物質を培
地中に添加しておくことが望ましい。
培養は通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行う。培
養温度は30℃〜40℃で行うことが好ましい。これら以外
の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。通
常１〜２日の培養期間で生育し、菌体内にキサンチンオ
キシダーゼが生成蓄積される。
本発明酵素の精製法は一般に使用される精製法を用い
ることができる。例えば抽出法には超音波破砕、ガラス
ビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活
性剤などいずれを用いてもよい。さらに抽出液について
は、硫安や芒硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化
カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやエチレンイ
ミンポリマーなどの凝集法、さらにはイオン交換クロマ
トグラフィーなどにより精製することができる。
次に本発明のキサンチンオキシダーゼの活性測定法を
示す。
〔測定法Ｉ〕
50mMトリス塩酸緩衝液2.9ml、10mMキサンチン水溶液
0.1mlを混合し、37℃で予備加温する。酵素液0.01mlを
添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に37℃で制御され
た分光光度計で１分間あたりの293nmの吸光度変化を求
める。キサンチンオキシダーゼの活性の表示は上記条件
下で１分間あたり１マイクロモルの尿酸を生成する酵素
量を１単位（Ｕ）とする。
〔測定法II〕
50mMトリス塩酸緩衝液2.1ml、0.15％４−アミノアン
チピリン0.25ml、0.3％Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（TOOS）
0.25ml、50U/mlパーオキシダーゼ0.4ml、5mMヒポキサチ
ン水溶液0.1mlを混合し、37℃で予備加温する。酵素液
0.1mlを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に37℃で
制御された分光光度計で１分間あたりの550nmの吸光度
変化を求める。キサンチンオキシダーゼの活性表示は上
記条件下で１分間あたり１マイクロモルのキノンイミン
色素を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
次に本発明の酵素の一例の理化学的な性質について述
べる。
（１） 熱安定性 本発明の酵素0.8U/mlを50mMトリス・塩酸緩衝液（pH
8.0）中で各温度（０、37、40、45、50、55、60、65、7
0℃）で30分処理した後、５分間氷冷やし、キサンチン
酸化反応の残存活性を測定法Ｉで測定した。結果は55℃
まで安定で、、60℃で約80％の残存活性であった。（第
２図参照） また、本発明の酵素を50℃および55℃で熱処理時間を
変化させて測定した結果を第３図に示す。
（２） 至適pH 本発明の酵素の至適pHは7.5付近であった。
（３） km値 本発明の酵素のpH7.5の条件下、ヒポキサンチンに対
するkm値は約5.2×10-5M、キサンチンに対するkm値は約
5.4×10-5Mであった。
（４） 分子量 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した本発明
の酵素の分子量は約80,000であった。
（５） 安定pHの範囲 本発明の酵素の安定pH範囲は、6.0〜10.0であった。
本発明の酵素は、従来の牛乳由来のキサンチンオキシ
ターゼと比較して作用する基質の定量において優れてい
る。即ち、キサンチンまたはヒポキサンチンに、酸素を
電子受容体として本発明の酵素を作用させ、生成する過
酸化水素を色素に変換する発色系において、安定した呈
色が得られる。また、従来の微生物由来のキサンチンオ
キシダーゼ（特公昭60−20994号公報参照）と本発明の
酵素を熱安定性について比較した結果、エンテロバクタ
ークロアカエの産生する酵素は60℃、30分間処理での残
存活性が30％であり、また、従来公知のアースロバクタ
ーの産生する酵素（東洋醸造株式会社製）の残存活性は
40％であるのに対し、本発明の酵素は約80％の残存活性
があり、従来のものより熱安定性の点で優れている。
（実施例） 以下、実施例をあげ、本発明を具体的に示す。
実施例１ ポリペプトン0.3％、肉エキス0.3％、酵母エキス0.3
％、KH2PO40.1％,K2HPO40.22％,MgSO47H2O0.05％，ヒポ
キサンチン0.1％を含む培地（pH7.0）5mlを30ml容試験
管に移し、121℃、15分間オートクレーブ殺菌を行っ
た。種菌としてアースロバクター・ルーテウス（Arthro
bacterluteus）ATCC 21606を１白金耳植菌し、30℃で18
時間振盪培養し、種培養液とした。次に同培地250mlを
２容坂口フラスコ４本に移し、121℃、15分間オート
クレーブ殺菌を行った。これに種培養液5mlを移し、30
℃で24時間振盪培養した。培養終了時のキサンチンオキ
シダーゼ活性は培養液あたり40mU/mlであった。
培養液１を遠心分離にて集菌し、50mMトリス・塩酸
緩衝液（pH8.0）100mlに懸濁した。超音波破砕機（BRAN
SON製、SONIFIER）にて10分間処理し遠心分離にて上清
液102mlを得た。この上清液をエチレンイミンポリマー
処理、硫酸アンモニウムで塩析処理し、塩析沈殿物を得
た。これを50mMトリス・塩酸緩衝液で懸濁し、遠心分離
にて上清液を得た。上清液を50mMトリス・塩酸緩衝液に
て平衡化したセファデックスＧ−25（ファルマシア製）
で脱塩を行った。次に同緩衝液にて平衡化したDEAE−セ
ファロース CL−6B（ファルマシア製）カラムクロマト
グラフィーに供し、０〜0.5M NaCl溶出画分にキサンチ
ンオキシダーゼ活性を得た。溶出液をセファデックスＧ
−25で脱塩し、13.8Uの酵素が得られた。得られた酵素
の理化学的性質を第１表に記す。また、熱安定性の測定
結果を第２図に示す。
比較例 従来のミルク由来のキサンチンオキシダーゼおよびエ
ンテロバクタークロアカエ由来のキサンチンオキシダー
ゼについて測定した。理化学的性質を第１表に記す。ま
た、熱安定性の測定結果を第２図に示す。
実施例２ 実施例１同様にして得られた酵素について、50℃およ
び55℃で熱処理時間を変化させて熱安 定性を測定した。結果を第３図に示す。
（発明の効果） 本発明では60℃、30分間処理で少なくとも70％の残存
活性を有する熱安定性に優れキサンチンオキシダーゼが
得られる。
【図面の簡単な説明】 第１図は本発明のキサンチンオキシダーゼの至適pHを示
す。 第２図は本発明のキサンチンオキシダーゼとエンテロバ
クタークロアカエ由来のキサンチンオキシダーゼ、ミル
ク由来のキサンチンオキシダーゼとの熱安定性の比較を
示す。 第３図は本発明のキサンチンオキシダーゼの50℃および
55℃における熱処理時間と残存活性の関係を示す。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくともヒポキサンチンおよびキサンチ
    ンに基質特異性を有し、ヒポキサンチンをキサンチンに
    酸化し、さらにキサンチンを尿酸に酸化する反応を触媒
    し、酸素を電子供与体とし、過酸化水素を生成するキサ
    ンチンオキシダーゼにおいて、60℃、30分間処理で少な
    くとも70％の残存活性を有し、かつ下記の理化学的性質
    を有することを特徴とする耐熱性キサンチンオキシダー
    ゼ。 分子量：約80,000（ポリアクリルアミドゲル電気泳動
    法） Km値：約5.4×10-5M（対キサンチン） 約5.2×10-5M（対ヒポキサンチン） 至適pH:7.5付近 安定pH範囲:6.0〜10.0
  2. 【請求項２】アースロバクター属に属し、耐熱性キサン
    チンオキシダーゼの生産能を有する菌株を栄養培地にて
    培養し、該培養物から耐熱性キサンチンオキシダーゼを
    採取することを特徴とする請求項（１）記載の耐熱性キ
    サンチンオキシダーゼの製造法。
  3. 【請求項３】アースロバクター属に属するキサンチンオ
    キシダーゼ生産菌がアースロバクター・ルーテウス（AT
    CC21606）である請求項（２）記載の耐熱性キサンチン
    オキシダーゼの製造法。
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