JPH03297383A - 耐熱性キサンチンオキシダーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な耐熱性キサンチンオキシダーゼおよびそ
の製造法に関するものである。本発明のキサンチンオキ
シダーゼはヒポキサンチンおよびキサンチンを酸化し、
過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であり、熱安
定性に優れることを特徴とする。

本発明のキサンチンオキシダーゼは腎炎・甲状腺障害の
指標となる無機リン、免疫疾患の指標となるアデノシン
デアミナーゼ等を測定するために用いられる。

（従来の技術） 従来、牛乳中にこの酵素の存在が知られているが、牛乳
に由来するキサンチンオキシダーゼはヒポキサンチンお
よびキサンチンを含有する試料に作用させ、生成する過
酸化水素を色素に変換せしめた場合、短時間に色素が分
解されて、過酸化水素に基づく定量ができない。

又、微生物に由来するものとして、シュードモナス属、
エシキリキア属、アースロバフタ−属、ノカルデイア属
等に属する微生物から得られる酵素［Ｊ、　Ｂａｃｔｅ
ｒｏｌｏｌｏｇｙ、Ｌｔｌ、１１７５（１９７７）、Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｌ　ｏ　ｌ　、　、　ＪＪｊｌ、　４
２２　（１９７８）　］　や、］エンテロバクタークロ
アカニから得られる酵素（Ａ、Ｂ、Ｃ，，４５，４２５
（１９８１））が知られているが、活性や熱安定性にお
いて充分ではなかった。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは上記の背景を踏まえ、公知のキサンチンオ
キシダーゼよりも熱安定性の優れたキサンチンオキシダ
ーゼを見出そうと試みた。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた
結果、アースロバフタ−属に属する微生物から熱安定性
に優れたキサンチンオキシダーゼを見い出した。すなわ
ち、本発明は少なくともヒポキサンチンおよびキサンチ
ンに基質特異性を有し、ヒポキサンチンをキサンチンし
て酸化し、さらにキサンチンを尿酸に酸化する反応（下
記反応式参照）を触媒し、酵素を電子受容体とし過酸化
水素を生成するキサンチンオキシダーゼにおいて、６０
℃、３０分間処理で少なくとも７０％の残存活性を有す
ることを特徴とする耐熱性キサンチンオキシダーゼであ
る。

反応式：ピポキサンチン＋ｏ２→キサンチン＋Ｈ２０２
キサンチン＋０□→尿酸＋Ｈ２０□ また、本発明はアースロバフタ−属に属し、耐熱性キサ
ンチンオキシダーゼの生産能を有する菌株を栄養培地に
て培養し、該培養物から耐熱性キサンチンオキシダーゼ
を採取することを特徴とする。耐熱性キサンチンオキシ
ダーゼの製造法である。

本発明に用いる微生物は上記性質を有するキサンチンオ
キシダーゼを産生しうるアースロバフタ−属菌などであ
って、好適な例としては、アースロバクター〇ルーテウ
ス（Ａｒｔｈｒｄａｃｔｅｒ　Ｉ　ｕ　ｔ　ｅ　ｕ　ｓ
　）ムＴＣＣ２１Ｂ０６などが挙げられる。

本発明の酵素を製造するにあたっては、キサンチンオキ
シダーゼ生産菌を酵素を生産する通常の方法で培養する
。使用する培地組成としては、使用菌株が資化しうる炭
素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有
するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用で
きる。また、キサンチンオキシダーゼの生産誘導物質と
して、ヒポキサンチン、キサンチン等の核酸物質を培地
中に添加しておくことが望ましい。

培養は通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行う。培養
温度は３０℃〜４０℃で行うことが好ましい。これら以
外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。

通常１〜２日の培養期間で生育し、菌体内にキサンチン
オキシダーゼが生成蓄積される。

本発明酵素の精製法は一般に使用される精製法を用いる
ことができる。例えば抽出法には超音波破砕、ガラスピ
ーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性
剤などいずれを用いてもよい。さらに抽出液については
、硫安や芒硝なとの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カ
ルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやエチレンイミ
ンポリマーなどの凝集法、さらにはイオン交換クロマト
グラフィーなどにより精製することができる。

次に本発明のキサンチンオキシダーゼの活性測定法を示
す。

〔測定法Ｉ〕 ５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液２．９−１１０ｍＭキサンチ
ン水溶液ｏ、ｔ１Ｌｌを混合し、３７℃で予備加温する
。酵素液０．０１１Ｌｌを添加し、ゆるやかに混和後、
水に対照に３７℃で制御された分光光度計で１分間あた
りの２９３ｎｍの吸光度変化を求める。キサンチンオキ
シダーゼの活性の表示は上記条件下で１分間あたり１マ
イクロモルの尿酸を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とす
る。

〔測定法■〕

５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液２．１−１０．１５％４−ア
ミノアンチピリン０．２５．Ｊ、０．３％Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−）
ルイジ７　（ＴＯＯＳ）０．２５　ｄ、５０　Ｕ／Ｌｌ
パーオキシダーゼ０．４−１５ｍＭヒポキサチン水溶液
０．１ｗ１ｉを混合し、３７℃で予備加温する。酵素液
０．０１−を添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に３
７℃で制御された分光光度計で１分間あたりの５５０ｎ
ｍの吸光度変化を求める。キサンチンオキシダーゼの活
性表示は上記条件下で１分間あたり１マイクロモルのキ
ノンイミン色素を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする
。

次に本発明の酵素の一例の理化学的な性質について述べ
る。

（１）　　熱安定性 本発明の酵素０．８　Ｕ／、ｊを５０ｍＭ）リス・塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０）中で各温度（０，３７，４０，４
５，５０，５５，６０，６５，７０℃）で３０分処理し
た後、５分間水冷やし、キサンチン酸化反応の残存活性
を測定法王で測定した。結果は５５℃まで安定で、６０
℃で約８０％の残存活性であった。（第２図参照） また、本発明の酵素を５０℃および５５℃で熱処理時間
を変化させて測定した結果を第３図に示す。

■　至適ｐｎ 本発明の酵素の至適ｐＨは７．５付近であった。

■　　　　ｋ菖　値 本発明の酵素のｐＨ７，５の条件下、ヒポキサンチンに
対するｋｍ値は約５．２Ｘ１０−ＩＳＭ１キサンチンに
対するｋｍ値は約５．４Ｘ１０−５Ｍであった。

（２）分子量 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した本発明の
酵素の分子量は約８α０００であった。

■　安定ｐＨの範囲 本発明の酵素の安定ｐＨ範囲は、６．０〜１０゜０であ
った。

本発明の酵素は、従来の牛乳由来のキサンチンオキシダ
ーゼと比較して作用する基質の定量において優れている
。即ち、キサンチンまたはヒポキサンチンに、酸素を電
子受容体として本発明の酵素を作用させ、生成する過酸
化水素を色素に変換する発色系において、安定した呈色
が得られる。

また、従来の微生物由来のキサンチンオキシダーゼ（特
公昭６０−２０９９４号公報参照）と本発明の酵素を熱
安定性について比較した結果、エンテロバタタークロア
カエの産生ずる酵素は６０℃、３０分間処理での残存活
性が３０％であり、また、従来公知のアースロバフタ−
の産生ずる酵素（東洋醸造株式会社）の残存活性は４０
％であるのに対し、本発明の酵素は約８０％の残存活性
があり、従来のものより熱安定性の点で優れている。

（実施例） 以下、実施例をあげ、本発明を具体的に示す。

実施例１ ポリペプトン０．３％、肉エキス０．３％、酵母エキス
０．３％、ＫＨ２Ｐ０．０．１％、Ｋ２ＨＰＯ，０，２
２％、Ｍｇ５０．７Ｈ２００，０５％、ヒポキサンチン
０．１％を含む培地（ｐＨ７゜０）５−を３〇−各試験
管に移し、１２１℃、１５分間オートクレーブ殺菌を行
った。種菌としてアースロバクター・ルーテウス（Ａｒ
ｔｈｒｏｂａｃｔｅｒＩｕｔｅｎｓ）　ＡＴＣＣ２１Ｇ
（Ｈを１白金耳植菌し、３０℃で１８時間振盪培養し、
種培養液とした。次に同培地２５０−を２１容坂ロフラ
スコ４本に移し、１２１℃、１５分間オートクレーブ殺
菌を行った。

これに種培養液５−を移し、３０℃で２４時間振１培養
した。培養終了時のキサンチンオキシダーゼ活性は培養
液あたり４０ｍＵ／−であった。

培養液１）を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭ）リス・塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）　１００ｄに懸濁した。超音波
破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ製、５ＯＮＩＦＩＥＲ）にて１
０分間処理し遠心分離にて上清液１０２−を得た。この
上清液をエチレンイミンポリマー処理、硫酸アンモニウ
ムで塩析処理し、塩析沈殿物を得た。これを５０ｍＭ）
！Ｊス・塩酸緩衝液で懸濁し、遠心分離にて上清液を得
た。上溝液を５０ｍＭ１−リス・塩酸緩衝液にて平衡化
したセファデックスＧ−２５（ファルマシア製）で脱塩
を行った。

次に同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−セファロース　
ＣＬ−８Ｂ　（ファルマシア製）カラムクロマトグラフ
ィーに供し、Ｏ〜０．５Ｍ　　ＮａＣ１溶出画分にキサ
ンチンオキシダーゼ活性を得た。

溶出液をセファデックスＧ−２５で脱塩し、１３゜８Ｕ
の酵素が得られた。得られた酵素の理化学的性質を第１
表に記す。また、熱安定性の測定結果を第２図に示す。

比較例 従来のミルク由来のキサンチンオキシダーゼおよびエン
テロバクタ−クロアカニ由来のキサンチンオキシダーゼ
について測定した。理化学的性質を第１表に記す。また
、熱安定性の測定結果を第２図に示す。

実施例２ 実施例１同様にして得られた酵素について、５０℃およ
び５５℃で熱処理時間を変化させて熱安定性を測定した
。結果を第３図に示す。

（発明の効果） 本発明では６０℃、３０分間処理で少なくとも７０％の
残存活性を有する熱安定性に優れキサンチンオキシダー
ゼが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のキサンチンオキシダーゼの至適ｐＨを
示す。 第２図は本発明のキサンチンオキシダーゼとエンテロバ
クタ−クロアカニ由来のキサンチンオキシダーゼ、ミル
ク由来のキサンチンオキシダーゼとの熱安定性の比較を
示す。 第３図は本発明のキサンチンオキシダーゼの５０℃およ
び５５℃における熱処理時間と残存活性の関係を示す。 以　　上

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくともヒポキサンチンおよびキサンチンに基
   質特異性を有し、ヒポキサンチンをキサンチンに酸化し
   、さらにキサンチンを尿酸に酸化する反応を触媒し、酸
   素を電子受容体とし、過酸化水素を生成するキサンチン
   オキシダーゼにおいて６０℃、３０分間処理で少なくと
   も７０％の残存活性を有することを特徴とする耐熱性キ
   サンチンオキシダーゼ。
2. （２）下記の理化学的性質を有する請求項（１）記載の
   耐熱性キサンチンオキシダーゼ。 ［１］分子量：約８０，０００（ポリアクリルアミドゲ
   ル電気泳動法）［２］ｋｍ値：キサンチン約５．４×１
   ０＾−＾５Ｍヒポキサンチン約５．２×１０＾−＾５Ｍ ［３］至適ｐＨ：７．５付近 ［４］安定ｐＨ範囲：６．０〜１０．０
3. （３）アースロバクター属に属し、耐熱性キサンチンオ
   キシダーゼの生産能を有する菌株を栄養培地にて培養し
   、該培養物から耐熱性キサンチンオキシダーゼを採取す
   ることを特徴とする耐熱性キサンチンオキシダーゼの製
   造法。
4. （４）アースロバクター属に属するキサンチンオキシダ
   ーゼ生産菌がアースロバクター・ルーテウス（ＡＴＣＣ
   ２１６０６）である請求項（３）記載の製造法。