JPH0584072A - Ｎａｄｈオキシダーゼ及びその製造法 - Google Patents
Ｎａｄｈオキシダーゼ及びその製造法Info
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- JPH0584072A JPH0584072A JP25117791A JP25117791A JPH0584072A JP H0584072 A JPH0584072 A JP H0584072A JP 25117791 A JP25117791 A JP 25117791A JP 25117791 A JP25117791 A JP 25117791A JP H0584072 A JPH0584072 A JP H0584072A
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- nadh oxidase
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 活性測定に際しＳＨ保護剤やＦＡＤによる処
理を必要とせず且つＮＡＤＨに基質特異性を有し、ＮＡ
ＤＨの定量やＮＡＤリジェネレーティング・システムへ
の応用等に有用なＮＡＤＨオキシダーゼを提供する。 【構成】 酸素分子存在下にＮＡＤＨを基質特異的に酸
化して水を生成し、分子量４８,０００〜５２,０００を
有することを、特徴とする。
理を必要とせず且つＮＡＤＨに基質特異性を有し、ＮＡ
ＤＨの定量やＮＡＤリジェネレーティング・システムへ
の応用等に有用なＮＡＤＨオキシダーゼを提供する。 【構成】 酸素分子存在下にＮＡＤＨを基質特異的に酸
化して水を生成し、分子量４８,０００〜５２,０００を
有することを、特徴とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＮＡＤＨ(還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド)オキシダーゼ及び
その製造法に関する。より詳しくは本発明は、ＮＡＤＨ
の測定やＮＡＤリジェネレーティング・システムへの応
用等に有用なＨ2Ｏ・ジェネレーティング(Ｈ2Ｏ generat
ing)ＮＡＤＨオキシダーゼ、及びその製造法に関する。
チンアミドアデニンジヌクレオチド)オキシダーゼ及び
その製造法に関する。より詳しくは本発明は、ＮＡＤＨ
の測定やＮＡＤリジェネレーティング・システムへの応
用等に有用なＨ2Ｏ・ジェネレーティング(Ｈ2Ｏ generat
ing)ＮＡＤＨオキシダーゼ、及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｈ2Ｏ・ジェネレイティングＮＡＤ
Ｈオキシダーゼとしては、腸内細菌ストレプトコッカス
・フェカリシス(Streptococcus faecalis)由来のもの[ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal
of Biological Chemistry)、第２３７巻、第２６４７
頁;及びヨーロッピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー(European Journal of Biochemistry)、第１５６
巻、第１４９頁]が知られる。
Ｈオキシダーゼとしては、腸内細菌ストレプトコッカス
・フェカリシス(Streptococcus faecalis)由来のもの[ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal
of Biological Chemistry)、第２３７巻、第２６４７
頁;及びヨーロッピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー(European Journal of Biochemistry)、第１５６
巻、第１４９頁]が知られる。
【０００３】しかしながら、この微生物由来のＨ2Ｏ・ジ
ェネレイティングＮＡＤＨオキシダーゼは不安定であ
り、その活性測定に際しては予めＳＨ保護剤(例えばシ
ステイン、ジチオスレイトール等)とＦＡＤ(フラビンア
デニンジヌクレオチド)とで一定時間保温処理せねばな
らない、という欠点を有する。
ェネレイティングＮＡＤＨオキシダーゼは不安定であ
り、その活性測定に際しては予めＳＨ保護剤(例えばシ
ステイン、ジチオスレイトール等)とＦＡＤ(フラビンア
デニンジヌクレオチド)とで一定時間保温処理せねばな
らない、という欠点を有する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、活性測定に
際し上記のようなＳＨ保護剤やＦＡＤによる処理を必要
とせず且つＮＡＤＨに基質特異性を有し、ＮＡＤＨの定
量やＮＡＤリジェネレーティング・システムへの応用等
に有用なＮＡＤＨオキシダーゼを提供することを、目的
とする。本発明は又、そのようなＮＡＤＨオキシダーゼ
を、短時間で容易に大量生産・精製出来る製造方法を提
供することも、目的とする。
際し上記のようなＳＨ保護剤やＦＡＤによる処理を必要
とせず且つＮＡＤＨに基質特異性を有し、ＮＡＤＨの定
量やＮＡＤリジェネレーティング・システムへの応用等
に有用なＮＡＤＨオキシダーゼを提供することを、目的
とする。本発明は又、そのようなＮＡＤＨオキシダーゼ
を、短時間で容易に大量生産・精製出来る製造方法を提
供することも、目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記目的を
達成するため工業的生産に適したＮＡＤＨオキシダーゼ
について広く検索した結果、ＳＨ保護剤やＦＡＤによる
処理を必要とせず且つＮＡＤＨにのみに特異的に作用す
るようなＨ2Ｏ・ジェネレイティングＮＡＤＨオキシダー
ゼは、通性嫌気性細菌ストレプトコッカス・ミュータン
スから得られることを見出した。更に本発明者等は、上
記嫌気性細菌の培養を先ず嫌気性下に次いで好気性下に
移して行うだけで、容易に上記のようなＮＡＤＨオキシ
ダーゼが大量生産され、又このように生産された上記Ｎ
ＡＤＨオキシダーゼは硫安で塩析することにより容易に
精製出来ることも見出した。
達成するため工業的生産に適したＮＡＤＨオキシダーゼ
について広く検索した結果、ＳＨ保護剤やＦＡＤによる
処理を必要とせず且つＮＡＤＨにのみに特異的に作用す
るようなＨ2Ｏ・ジェネレイティングＮＡＤＨオキシダー
ゼは、通性嫌気性細菌ストレプトコッカス・ミュータン
スから得られることを見出した。更に本発明者等は、上
記嫌気性細菌の培養を先ず嫌気性下に次いで好気性下に
移して行うだけで、容易に上記のようなＮＡＤＨオキシ
ダーゼが大量生産され、又このように生産された上記Ｎ
ＡＤＨオキシダーゼは硫安で塩析することにより容易に
精製出来ることも見出した。
【０００６】即ち本発明は、酸素分子存在下にＮＡＤＨ
を基質特異的に酸化して水を生成し、分子量４８,００
０〜５２,０００を有するＮＡＤＨオキシダーゼを、提
供する。更に本発明は、酵素生産菌ストレプトコッカス
・ミュータンス(Streptococcusmutans)を培養し、培養
物に硫安を加え塩析して上記ＮＡＤＨオキシダーゼを採
取することを特徴とする上記ＮＡＤＨオキシダーゼの製
造法も、提供する。
を基質特異的に酸化して水を生成し、分子量４８,００
０〜５２,０００を有するＮＡＤＨオキシダーゼを、提
供する。更に本発明は、酵素生産菌ストレプトコッカス
・ミュータンス(Streptococcusmutans)を培養し、培養
物に硫安を加え塩析して上記ＮＡＤＨオキシダーゼを採
取することを特徴とする上記ＮＡＤＨオキシダーゼの製
造法も、提供する。
【０００７】本発明のＮＡＤＨオキシダーゼは、以下の
酵素化学的諸性質を有する。
酵素化学的諸性質を有する。
【０００８】作用及び基質特異性: 本発明の酵素Ｎ
ＡＤＨオキシダーゼは、次式; ２ＮＡＤＨ＋２Ｈ+＋Ｏ2→２ＮＡＤ+＋２Ｈ2Ｏ で表される酸化反応に対し触媒作用する。又本酵素は、
ＮＡＤＨにのみ基質特異的に作用しＮＡＤＰＨには作用
しない。このＮＡＤＰＨは酸化しないという本酵素の基
質特異性により、一般にはＮＡＤＨとＮＡＤＰＨが混在
する生体試料に対してもＮＡＤＨ量を選択的に測定でき
る。更に、従来のＮＡＤＨオキシダーゼがＮＡＤＨを酸
化する際に、副生成物として酵素活性を阻害する過酸化
水素を生成するのに対し、本酵素は上記反応式に示され
るが如く、酵素活性には全く影響を及ぼさない水のみを
生成する。従って例えば、ＮＡＤＨをオキシダーゼで酸
化しＮＡＤ+とし、これを再び適当な還元剤で還元しＮ
ＡＤＨとし、以後このサイクルを繰り返さす循環システ
ムのバイオリアクターに於いてオキシダーゼとして本酵
素を使用すれば、バイオリアクターに本酵素を全く若し
くは殆ど追加補充しなくても酵素活性は低下せず、従っ
てＮＡＤＨを繰り返し再酸化することが出来、その結果
サイクルを回転し続けられる。
ＡＤＨオキシダーゼは、次式; ２ＮＡＤＨ＋２Ｈ+＋Ｏ2→２ＮＡＤ+＋２Ｈ2Ｏ で表される酸化反応に対し触媒作用する。又本酵素は、
ＮＡＤＨにのみ基質特異的に作用しＮＡＤＰＨには作用
しない。このＮＡＤＰＨは酸化しないという本酵素の基
質特異性により、一般にはＮＡＤＨとＮＡＤＰＨが混在
する生体試料に対してもＮＡＤＨ量を選択的に測定でき
る。更に、従来のＮＡＤＨオキシダーゼがＮＡＤＨを酸
化する際に、副生成物として酵素活性を阻害する過酸化
水素を生成するのに対し、本酵素は上記反応式に示され
るが如く、酵素活性には全く影響を及ぼさない水のみを
生成する。従って例えば、ＮＡＤＨをオキシダーゼで酸
化しＮＡＤ+とし、これを再び適当な還元剤で還元しＮ
ＡＤＨとし、以後このサイクルを繰り返さす循環システ
ムのバイオリアクターに於いてオキシダーゼとして本酵
素を使用すれば、バイオリアクターに本酵素を全く若し
くは殆ど追加補充しなくても酵素活性は低下せず、従っ
てＮＡＤＨを繰り返し再酸化することが出来、その結果
サイクルを回転し続けられる。
【０００９】分子量: 本発明のＮＡＤＨオキシダー
ゼの分子量は、４８,０００〜５２,０００、通常５０,
０００〜５１,０００を有する。分子量測定は、例えば
ゲル濾過クロマトグラフィー等により行ってよい。具体
的にはゲル濾過クロマトグラフィーとしては、例えば標
準蛋白としてリボヌクレエースＡ、キモトリプシノーゲ
ンＡ、オボアルブミン、牛血清アルブミン、アルドラー
ゼ、カタラーゼ及びフェリチン(ファルマシア高分子量
及び低分子量タンパク質マーカー)等を使用したスーパ
ーロース１２等のゲル濾過クロマトグラフィー等であっ
てよい。更に、本酵素は通常構成ユニット数が１個、即
ち単量体であるが、必ずしもこれに限定されない。構成
ユニット数は、例えばゲル電気泳動法等により求めてよ
い。具体的にはゲル電気泳動法としては、例えば標準蛋
白としてカルボニック・アンヒドラーゼ、オボアルブミ
ン、牛血清アルブミン、オボトランスフェリン(ＢＤＨ
分子量マーカー)等を使用したナトリウムドデシルサル
フェートを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動法等
であってよい。
ゼの分子量は、４８,０００〜５２,０００、通常５０,
０００〜５１,０００を有する。分子量測定は、例えば
ゲル濾過クロマトグラフィー等により行ってよい。具体
的にはゲル濾過クロマトグラフィーとしては、例えば標
準蛋白としてリボヌクレエースＡ、キモトリプシノーゲ
ンＡ、オボアルブミン、牛血清アルブミン、アルドラー
ゼ、カタラーゼ及びフェリチン(ファルマシア高分子量
及び低分子量タンパク質マーカー)等を使用したスーパ
ーロース１２等のゲル濾過クロマトグラフィー等であっ
てよい。更に、本酵素は通常構成ユニット数が１個、即
ち単量体であるが、必ずしもこれに限定されない。構成
ユニット数は、例えばゲル電気泳動法等により求めてよ
い。具体的にはゲル電気泳動法としては、例えば標準蛋
白としてカルボニック・アンヒドラーゼ、オボアルブミ
ン、牛血清アルブミン、オボトランスフェリン(ＢＤＨ
分子量マーカー)等を使用したナトリウムドデシルサル
フェートを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動法等
であってよい。
【００１０】Ｋm値(「Ｋm値」は、 「酵素反応物生成速
度比が最大の速度Ｖの１／２となる基質濃度」と定義さ
れ、数値が小さい程、酵素とＮＡＤＨとの親和性が高
い。): 本酵素のＫm値は、通常１０-6Ｍ〜１０-5Ｍの
範囲内にある。この値は、本酵素のＮＡＤＨに対する親
和性が非常に強いことを示す。尚、生体内のＮＡＤＨの
濃度は１０-5Ｍレベルであり、親和性が弱い従来のＮＡ
ＤＨオキシダーゼでは生体試料中のＮＡＤＨの定量は不
可能である。
度比が最大の速度Ｖの１／２となる基質濃度」と定義さ
れ、数値が小さい程、酵素とＮＡＤＨとの親和性が高
い。): 本酵素のＫm値は、通常１０-6Ｍ〜１０-5Ｍの
範囲内にある。この値は、本酵素のＮＡＤＨに対する親
和性が非常に強いことを示す。尚、生体内のＮＡＤＨの
濃度は１０-5Ｍレベルであり、親和性が弱い従来のＮＡ
ＤＨオキシダーゼでは生体試料中のＮＡＤＨの定量は不
可能である。
【００１１】要求性: 本酵素は、その活性発現に前
記ＳＨ保護剤やＦＡＤ、更にはＦＭＮ(フラビンモノヌ
クレオチド)等の添加を必要としない。
記ＳＨ保護剤やＦＡＤ、更にはＦＭＮ(フラビンモノヌ
クレオチド)等の添加を必要としない。
【００１２】至適pＨ及びpＨ安定性: 本酵素は、pＨ
６.０〜８.５、特にpＨ７.０付近で最大活性を示す(図
１参照)。本酵素の至適pＨが中性付近にあることは、生
体試料そのものの測定に適する。更に本酵素は、pＨ５.
０〜１０.０、特に６.５〜８.５に於いて活性が９０％
保持され、pＨ安定性が大きい(図３参照)。
６.０〜８.５、特にpＨ７.０付近で最大活性を示す(図
１参照)。本酵素の至適pＨが中性付近にあることは、生
体試料そのものの測定に適する。更に本酵素は、pＨ５.
０〜１０.０、特に６.５〜８.５に於いて活性が９０％
保持され、pＨ安定性が大きい(図３参照)。
【００１３】作用適温の範囲: リン酸緩衝液(５０m
Ｍ、pＨ７.０)を用いて測定したところ、本酵素は３０
〜５０℃、特に３７℃〜４０℃付近で最大活性を示す
(図２参照)。本酵素の作用至適温度が体温付近にあるこ
とは、生体試料そのものの測定に適する。
Ｍ、pＨ７.０)を用いて測定したところ、本酵素は３０
〜５０℃、特に３７℃〜４０℃付近で最大活性を示す
(図２参照)。本酵素の作用至適温度が体温付近にあるこ
とは、生体試料そのものの測定に適する。
【００１４】耐熱性: 本酵素の熱安定性をリン酸緩
衝液(５０mＭ、pＨ７.０)で測定したところ、５０℃で
加熱した時、３０分間で約２０％の活性が保持される
(図４参照)。リン酸緩衝液に、更にＥＤＴＡ(エチレン
ジアミン四酢酸)、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、ＤＴＴ(ジチオス
レイトール)等を添加することによって、耐熱性を高め
ることができる。
衝液(５０mＭ、pＨ７.０)で測定したところ、５０℃で
加熱した時、３０分間で約２０％の活性が保持される
(図４参照)。リン酸緩衝液に、更にＥＤＴＡ(エチレン
ジアミン四酢酸)、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、ＤＴＴ(ジチオス
レイトール)等を添加することによって、耐熱性を高め
ることができる。
【００１５】上記のように本発明のＨ2Ｏ・ジェネレイテ
ィングＮＡＤＨオキシダーゼは、Ｈ 2Ｏ2の定量法と組み
合わせてＮＡＤＨが関与する各種脱水素酵素の活性測定
及びＮＡＤを補酵素とする各種脱水素酵素の基質量の測
定等に利用できる有用な酵素である。
ィングＮＡＤＨオキシダーゼは、Ｈ 2Ｏ2の定量法と組み
合わせてＮＡＤＨが関与する各種脱水素酵素の活性測定
及びＮＡＤを補酵素とする各種脱水素酵素の基質量の測
定等に利用できる有用な酵素である。
【００１６】上記のような本発明のＮＡＤＨオキシダー
ゼの製造法において、先ず適当な酵素生産菌を培養す
る。
ゼの製造法において、先ず適当な酵素生産菌を培養す
る。
【００１７】上記適当な生産菌としては、例えばストレ
プトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)が
挙げられる。そのような生産菌の菌株としては、例えば
ストレプトコッカス・ミュータンスＮＣＴＣ１０４４
９、ストレプトコッカス・ミュータンス・イングブリッド
(Ingbritt)、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣ２
を挙げることができる。
プトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)が
挙げられる。そのような生産菌の菌株としては、例えば
ストレプトコッカス・ミュータンスＮＣＴＣ１０４４
９、ストレプトコッカス・ミュータンス・イングブリッド
(Ingbritt)、ストレプトコッカス・ミュータンスＪＣ２
を挙げることができる。
【００１８】上記菌株の培養培地としては、使用菌株が
ＮＡＤＨオキシダーゼを生産するものであれば特に限定
されず、通常のものを使用してよい。培地には、使用菌
株の生育を促進する目的で、炭酸塩を添加するのが好ま
しい。更に培地には、オキシダーゼ生産のための炭素源
としてグルコース、マンニトール、ソルビトール等、及
び窒素源としてカゼイン、トリプティカーゼ、ペプト
ン、酵母エキス等を添加するのが好ましい。その他培地
には添加剤として通常使用されるもの、例えばリン酸
塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩等の無機塩及び
金属塩、更にはビタミン類、核酸塩基類、等を加えても
よい。尚、使用菌株が乳酸菌等である場合は、菌株の生
育にともなって培地中に酸を蓄積しpＨ値を低下する傾
向がある。従って上記リン酸塩は、リン酸カリウム緩衝
液(例えば０.１Ｍ〜０.２Ｍ程度)の形態で使用すると、
酵素の生産性を高めることができる。
ＮＡＤＨオキシダーゼを生産するものであれば特に限定
されず、通常のものを使用してよい。培地には、使用菌
株の生育を促進する目的で、炭酸塩を添加するのが好ま
しい。更に培地には、オキシダーゼ生産のための炭素源
としてグルコース、マンニトール、ソルビトール等、及
び窒素源としてカゼイン、トリプティカーゼ、ペプト
ン、酵母エキス等を添加するのが好ましい。その他培地
には添加剤として通常使用されるもの、例えばリン酸
塩、マグネシウム塩、マンガン塩、鉄塩等の無機塩及び
金属塩、更にはビタミン類、核酸塩基類、等を加えても
よい。尚、使用菌株が乳酸菌等である場合は、菌株の生
育にともなって培地中に酸を蓄積しpＨ値を低下する傾
向がある。従って上記リン酸塩は、リン酸カリウム緩衝
液(例えば０.１Ｍ〜０.２Ｍ程度)の形態で使用すると、
酵素の生産性を高めることができる。
【００１９】前記菌株の培養条件は適宜選択されるが、
例えば培養温度は通常３０〜４０℃、具体的には３７℃
付近で行ってよい。本発明で使用される菌株は通常、通
性嫌気性菌であり嫌気条件、即ち無酸素環境下でよく生
育する。しかし、無酸素環境下では本ＮＡＤＨオキシダ
ーゼの生産が抑制される傾向を有する。逆に、好気条件
下では本ＮＡＤＨオキシダーゼの生産は促進されるが、
菌の生育が遅い傾向を有する。従って本発明の製造法に
於いては具体的には例えば、ある程度嫌気的条件下でス
トレプトコッカス・ミュータンスを生育させた後に、環
境を好気条件下に移し、好ましくは２〜８時間、より好
ましくは３〜４時間の通気撹拌培養を行うことによっ
て、ＮＡＤＨオキシダーゼを誘導させることが好まし
い。この際、通気撹拌条件、集菌の時期等は適宜選択し
てよい。
例えば培養温度は通常３０〜４０℃、具体的には３７℃
付近で行ってよい。本発明で使用される菌株は通常、通
性嫌気性菌であり嫌気条件、即ち無酸素環境下でよく生
育する。しかし、無酸素環境下では本ＮＡＤＨオキシダ
ーゼの生産が抑制される傾向を有する。逆に、好気条件
下では本ＮＡＤＨオキシダーゼの生産は促進されるが、
菌の生育が遅い傾向を有する。従って本発明の製造法に
於いては具体的には例えば、ある程度嫌気的条件下でス
トレプトコッカス・ミュータンスを生育させた後に、環
境を好気条件下に移し、好ましくは２〜８時間、より好
ましくは３〜４時間の通気撹拌培養を行うことによっ
て、ＮＡＤＨオキシダーゼを誘導させることが好まし
い。この際、通気撹拌条件、集菌の時期等は適宜選択し
てよい。
【００２０】上記培養によって生産されたＮＡＤＨオキ
シダーゼは、大部分が菌体内に存在するため菌体内から
これを取り出す必要がある。取り出し方としては特に限
定されず、例えば通常用いられる方法で菌体細胞を破砕
してよい。その後、得られた破砕液から、不要成分(例
えば細胞膜破砕片、顆粒成分等)を除去して、粗酵素液
が得られる。除去法としては当業者に周知のいかなる方
法でもよく、例えば遠心分離法等であってよい。
シダーゼは、大部分が菌体内に存在するため菌体内から
これを取り出す必要がある。取り出し方としては特に限
定されず、例えば通常用いられる方法で菌体細胞を破砕
してよい。その後、得られた破砕液から、不要成分(例
えば細胞膜破砕片、顆粒成分等)を除去して、粗酵素液
が得られる。除去法としては当業者に周知のいかなる方
法でもよく、例えば遠心分離法等であってよい。
【００２１】このようにして得られた粗酵素液には、本
発明のＨ2Ｏ・ジェネレーティングＮＡＤＨオキシダーゼ
の他に更にＨ2Ｏ2・ジェネレイティングＮＡＤＨオキシ
ダーゼも混在することがある。そのため、次にこれらの
オキシダーゼを互いに分離するのが好ましい。分離法と
しては、硫安塩析法が好ましい。即ち、上記粗酵素液に
硫安を加え、先ずＨ2Ｏ2・ジェネレイティングＮＡＤＨ
オキシダーゼのみを塩析・除去する。硫安の添加量は適
宜選択されるが、通常粗酵素液の硫安濃度が５５％以
下、具体的には２５〜５０％でＨ2Ｏ2・ジェネレイティ
ングＮＡＤＨオキシダーゼは析出する。これの除去法は
当業者に周知のいかなる方法でもよく、例えば遠心分離
法等であってよい。
発明のＨ2Ｏ・ジェネレーティングＮＡＤＨオキシダーゼ
の他に更にＨ2Ｏ2・ジェネレイティングＮＡＤＨオキシ
ダーゼも混在することがある。そのため、次にこれらの
オキシダーゼを互いに分離するのが好ましい。分離法と
しては、硫安塩析法が好ましい。即ち、上記粗酵素液に
硫安を加え、先ずＨ2Ｏ2・ジェネレイティングＮＡＤＨ
オキシダーゼのみを塩析・除去する。硫安の添加量は適
宜選択されるが、通常粗酵素液の硫安濃度が５５％以
下、具体的には２５〜５０％でＨ2Ｏ2・ジェネレイティ
ングＮＡＤＨオキシダーゼは析出する。これの除去法は
当業者に周知のいかなる方法でもよく、例えば遠心分離
法等であってよい。
【００２２】上記Ｈ2Ｏ2・ジェネレイティングＮＡＤＨ
オキシダーゼが粗酵素液から塩析され分離除去された
後、本発明のＨ2Ｏ・ジェネレイティングＮＡＤＨオキシ
ダーゼを採集する。採集法としては、硫安塩析法が再び
好ましい。即ち、上記Ｈ2Ｏ2・ジェネレイティングＮＡ
ＤＨオキシダーゼが粗酵素液から除去された粗酵素液に
硫安を再度加え、本発明のＨ2Ｏ・ジェネレイティングＮ
ＡＤＨオキシダーゼを塩析・採集する。硫安の添加量は
適宜選択されるが通常、最終的な粗酵素液の硫安濃度が
５５〜８０％、具体的には５５〜７５％で本発明のＨ2
Ｏ・ジェネレーティングＮＡＤＨオキシダーゼが析出す
る。これの採集法は、当業者に周知のいかなる方法でも
よく、例えば遠心分離法等であってよい。
オキシダーゼが粗酵素液から塩析され分離除去された
後、本発明のＨ2Ｏ・ジェネレイティングＮＡＤＨオキシ
ダーゼを採集する。採集法としては、硫安塩析法が再び
好ましい。即ち、上記Ｈ2Ｏ2・ジェネレイティングＮＡ
ＤＨオキシダーゼが粗酵素液から除去された粗酵素液に
硫安を再度加え、本発明のＨ2Ｏ・ジェネレイティングＮ
ＡＤＨオキシダーゼを塩析・採集する。硫安の添加量は
適宜選択されるが通常、最終的な粗酵素液の硫安濃度が
５５〜８０％、具体的には５５〜７５％で本発明のＨ2
Ｏ・ジェネレーティングＮＡＤＨオキシダーゼが析出す
る。これの採集法は、当業者に周知のいかなる方法でも
よく、例えば遠心分離法等であってよい。
【００２３】上記のようにして析出採集された粗Ｈ2Ｏ・
ジェネレイティングＮＡＤＨオキシダーゼは、次いで精
製される。精製法としては特に限定されず、通常行なわ
れるいかなる方法でもよい。具体的には例えば、塩析濃
縮、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等により行ってよ
い。このようにして得られた精製Ｈ2Ｏ・ジェネレイティ
ングＮＡＤＨオキシダーゼは、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動的にも均一な標品である。
ジェネレイティングＮＡＤＨオキシダーゼは、次いで精
製される。精製法としては特に限定されず、通常行なわ
れるいかなる方法でもよい。具体的には例えば、塩析濃
縮、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等により行ってよ
い。このようにして得られた精製Ｈ2Ｏ・ジェネレイティ
ングＮＡＤＨオキシダーゼは、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動的にも均一な標品である。
【００２４】上記のようにして製造される本発明の精製
ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性力価の測定は、例えば
以下のようにして行うことが出来る。即ち、紫外光吸収
測定用石英ブラックセルにＮＡＤＨを含むリン酸緩衝液
及びＥＤＴＡ等を加え、反応液を調製する。この反応液
にＮＡＤＨオキシダーゼを加えることにより、ＮＡＤＨ
は溶液中の酸素により酸化されてＮＡＤ+に変換され
る。この際のＮＡＤＨに特異的な３４０nmに於ける吸光
度の減少の時間変化により力価を測定する。尚酵素活性
の力価は、１分間に１μモルのＮＡＤＨを酸化するに要
する酵素量を１単位として表す。ＦＡＤ添加時の力価
は、反応液にＦＡＤを添加して反応させて求める。
ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性力価の測定は、例えば
以下のようにして行うことが出来る。即ち、紫外光吸収
測定用石英ブラックセルにＮＡＤＨを含むリン酸緩衝液
及びＥＤＴＡ等を加え、反応液を調製する。この反応液
にＮＡＤＨオキシダーゼを加えることにより、ＮＡＤＨ
は溶液中の酸素により酸化されてＮＡＤ+に変換され
る。この際のＮＡＤＨに特異的な３４０nmに於ける吸光
度の減少の時間変化により力価を測定する。尚酵素活性
の力価は、１分間に１μモルのＮＡＤＨを酸化するに要
する酵素量を１単位として表す。ＦＡＤ添加時の力価
は、反応液にＦＡＤを添加して反応させて求める。
【００２５】
【実施例】以下本発明を、実施例でより具体的に説明す
る。
る。
【００２６】(実施例)重炭酸アンモニウム０.２％、グ
ルタミン酸ナトリウム０.１％、酵母エキス０.１％、ブ
ドウ糖１％、０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.０)、無機塩
類溶液(硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一
鉄、塩化ナトリウム等)及び還元剤として０.０１％のシ
ステインから成る培地３lを含む５lミニジャー・ファー
メンターに、嫌気的に１４〜１５時間培養したストレプ
トコッカスミュータンスを３００ｍｌ接種し、３７℃で
静置培養した。菌の生育度が６６０ｎｍの吸光度で０.
２〜０.３に達した時、通気撹拌培養を開始した(通気
量：３ｌ／分、撹拌速度：３００回転／分）。約３時間
の通気撹拌でＮＡＤＨオキシダーゼの誘導生産は最高に
達した。得られた菌体量は５g／lであった。菌体を０．
２mＭ−ＥＤＴＡを含む５０mＭリン酸緩衝液(pＨ７.０)
に懸濁後、菌体を破砕し、超遠心分画によって粗酵素液
を得た。この粗酵素液を硫安塩析して、粗Ｈ2Ｏ・ジェネ
レーティングＮＡＤＨオキシダーゼを得た。脱塩後これ
を、予め同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロース
カラムクロマトにかけ、ＫＣlの直線濃度勾配により溶
出した。Ｈ2Ｏ・ジェネレーティングＮＡＤＨオキシダー
ゼ活性画分は、０.２Ｍ〜０.３Ｍ−ＫＣl濃度で溶出さ
れた。活性画分を集め濃縮後、１.２Ｍ−硫酸アンモニ
ウムを含む５０mＭリン酸緩衝液(pＨ７.０)で平衡化し
たブチルセファロースカラムクロマトにかけ、１.２Ｍ
〜０Ｍの硫酸アンモニウムの直線濃度勾配により溶出し
た。尚、活性画分は０.５Ｍ〜０.２Ｍ濃度で溶出され
た。活性画分を回収したモノＱカラムクロマト(ＦＰＬ
Ｃシステム・ファルマシア)で分画後、再クロマトによ
り、ＳＤＳ(ソディウムドデシルサルフェート)ゲル電気
泳動的に均一な酵素として分離精製した。この比活性は
１２７単位／mgであり、粗酵素からの収率は約５％であ
った。
ルタミン酸ナトリウム０.１％、酵母エキス０.１％、ブ
ドウ糖１％、０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ７.０)、無機塩
類溶液(硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一
鉄、塩化ナトリウム等)及び還元剤として０.０１％のシ
ステインから成る培地３lを含む５lミニジャー・ファー
メンターに、嫌気的に１４〜１５時間培養したストレプ
トコッカスミュータンスを３００ｍｌ接種し、３７℃で
静置培養した。菌の生育度が６６０ｎｍの吸光度で０.
２〜０.３に達した時、通気撹拌培養を開始した(通気
量：３ｌ／分、撹拌速度：３００回転／分）。約３時間
の通気撹拌でＮＡＤＨオキシダーゼの誘導生産は最高に
達した。得られた菌体量は５g／lであった。菌体を０．
２mＭ−ＥＤＴＡを含む５０mＭリン酸緩衝液(pＨ７.０)
に懸濁後、菌体を破砕し、超遠心分画によって粗酵素液
を得た。この粗酵素液を硫安塩析して、粗Ｈ2Ｏ・ジェネ
レーティングＮＡＤＨオキシダーゼを得た。脱塩後これ
を、予め同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロース
カラムクロマトにかけ、ＫＣlの直線濃度勾配により溶
出した。Ｈ2Ｏ・ジェネレーティングＮＡＤＨオキシダー
ゼ活性画分は、０.２Ｍ〜０.３Ｍ−ＫＣl濃度で溶出さ
れた。活性画分を集め濃縮後、１.２Ｍ−硫酸アンモニ
ウムを含む５０mＭリン酸緩衝液(pＨ７.０)で平衡化し
たブチルセファロースカラムクロマトにかけ、１.２Ｍ
〜０Ｍの硫酸アンモニウムの直線濃度勾配により溶出し
た。尚、活性画分は０.５Ｍ〜０.２Ｍ濃度で溶出され
た。活性画分を回収したモノＱカラムクロマト(ＦＰＬ
Ｃシステム・ファルマシア)で分画後、再クロマトによ
り、ＳＤＳ(ソディウムドデシルサルフェート)ゲル電気
泳動的に均一な酵素として分離精製した。この比活性は
１２７単位／mgであり、粗酵素からの収率は約５％であ
った。
【００２７】
【発明の効果】本発明により、酵素活性測定に際しＳＨ
保護剤やＦＡＤによる処理を必要とせず且つＮＡＤＨに
基質特異性を有し、ＮＡＤＨの定量やＮＡＤリジェネレ
ーティング・システムへの応用等に有用なＮＡＤＨオキ
シダーゼを得ることが出来る。更に、本発明の製造法に
より、上記のようなＮＡＤＨオキシダーゼを、短時間で
容易に大量生産・精製出来る。
保護剤やＦＡＤによる処理を必要とせず且つＮＡＤＨに
基質特異性を有し、ＮＡＤＨの定量やＮＡＤリジェネレ
ーティング・システムへの応用等に有用なＮＡＤＨオキ
シダーゼを得ることが出来る。更に、本発明の製造法に
より、上記のようなＮＡＤＨオキシダーゼを、短時間で
容易に大量生産・精製出来る。
【図１】本発明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性−pＨ
相関関係図である。
相関関係図である。
【図２】本発明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性−温度
相関関係図である。
相関関係図である。
【図３】本発明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性のpＨ
安定性を示す図である。
安定性を示す図である。
【図４】本発明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性の温度
安定性を示す図である。
安定性を示す図である。
１ ５０mＭ−リン酸緩衝液(pＨ４〜１０)中に於ける
本発明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性のpＨ安定性 ２ ５０mＭ−酢酸緩衝液(pＨ４〜６)中に於ける本発
明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性のpＨ安定性 ３ ３７℃に於ける本発明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵
素活性の安定性 ４ ５０℃に於ける本発明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵
素活性の安定性 ５ ６０℃に於ける本発明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵
素活性の安定性
本発明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性のpＨ安定性 ２ ５０mＭ−酢酸緩衝液(pＨ４〜６)中に於ける本発
明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵素活性のpＨ安定性 ３ ３７℃に於ける本発明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵
素活性の安定性 ４ ５０℃に於ける本発明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵
素活性の安定性 ５ ６０℃に於ける本発明ＮＡＤＨオキシダーゼの酵
素活性の安定性
Claims (2)
- 【請求項１】 酸素分子存在下にＮＡＤＨを基質特異的
に酸化して水を生成し、分子量４８,０００〜５２,００
０を有するＮＡＤＨオキシダーゼ。 - 【請求項２】 酵素生産菌ストレプトコッカス・ミュー
タンス(Streptococcus mutans)を培養し、培養物に硫安
を加え塩析して該ＮＡＤＨオキシダーゼを採取すること
を特徴とする請求項１記載のＮＡＤＨオキシダーゼの製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25117791A JPH0584072A (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | Ｎａｄｈオキシダーゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25117791A JPH0584072A (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | Ｎａｄｈオキシダーゼ及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0584072A true JPH0584072A (ja) | 1993-04-06 |
Family
ID=17218832
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25117791A Pending JPH0584072A (ja) | 1991-09-30 | 1991-09-30 | Ｎａｄｈオキシダーゼ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0584072A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008092832A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Keio Gijuku | 新規過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼ |
| WO2009091054A1 (ja) | 2008-01-17 | 2009-07-23 | Keio University | 新規過酸化水素生成型nadhオキシダーゼ及びそれをコードするdna |
-
1991
- 1991-09-30 JP JP25117791A patent/JPH0584072A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008092832A (ja) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Keio Gijuku | 新規過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼ |
| WO2009091054A1 (ja) | 2008-01-17 | 2009-07-23 | Keio University | 新規過酸化水素生成型nadhオキシダーゼ及びそれをコードするdna |
| US8546113B2 (en) | 2008-01-17 | 2013-10-01 | Keio University | Hydrogen peroxide-forming NADH oxidase and DNA encoding the same |
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