JPS63313580A

JPS63313580A - 蟻酸脱水素酵素

Info

Publication number: JPS63313580A
Application number: JP14691987A
Authority: JP
Inventors: Yasuhisa Asano; 泰久浅野; Akiko Nakazawa; 仲沢　章子; Osanori Numao; 沼尾　長徳
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute
Priority date: 1987-06-15
Filing date: 1987-06-15
Publication date: 1988-12-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は、蟻酸脱水素酵素及び、該酵素を産生する微
生物に関する。蟻酸脱水素酵素は酸化還元酵素の補酵素
であるＮＡＤ）ｌの再生に必要な酵素であって有用であ
る。また、蟻酸の定量、にも用いることができる。

〔従来の技術〕

ＮＡＤ＋関与の蟻酸脱水素酵素は、メタノール、蟻酸や
シュウ酸等を単一炭素源として生育する微生物等に多く
分布している。　ＮＡＤ＋関与の蟻酸脱水素酵素の内、
均一状態までに精製され酵素化学的諸性質が明らかにさ
れている細菌由来の蟻酸脱水素酵素は、シュードモナス
・オキザラティカス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｘａ
ｌａｔｉｃｕｓ）及びアクロモバクタ−〇パルブルスみであって、その他の細菌におけるＨＡＤ＋関与の蟻酸
脱水素酵素の酵素化学的諸性質については不明である．
シュードモナス・オキザラティカスの蟻酸脱水素酵素は
、メラーら、７　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ肚四■紅畦墜，８
３，４８５〜４９８（１９７８）に記載されているよう
に、分子量３１５，０００と１７５，０００の二種類か
ら成っており、さらにそれぞれが分子量１００，０００
及び５９，０００の二種類のサブユニットから成ってい
る。よって本発明の蟻酸脱水素酵素とは全く異なるし、
さらに生産する微生物の属も異なる。アクロモバクタ−
・パルブルスの蟻酸脱水素酵素は、エゴロフら、７　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａｉｓｔｒｙ。

９９、５６９〜５７６（１９７９）に記載されているよ
うに分子量約ｓｏ、ｏｏｏ±８，０００で４６，０００
±２．０００の同一のサブユニットから成っている。ま
た本発明の微生物とは属が異なる。

従って、モラキセラΩ憔び五１ユリー属細菌により生産
される蟻酸脱水素酵素は知られていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明は、今まで蟻酸脱水素酵素を生産すること
が知られていなかった微生物に由来する蟻酸脱水素酵素
、並びに該酵素を生産する新規な微生物及び該酵素の新
規な製造方法を提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

前記の目的は、モラキセラ属細菌により生産される蟻酸
脱水素酵素、及び該酵素を生産することができるモラキ
セラ・フェニルピルビ力（Ｍｏｒａｘｅ−〔具体的な説
明〕（１）微生物本発明において使用する微生物としてはモラキセラ属に
属し、蟻酸脱水素酵素を生産することができるものであ
ればよく、このような微生物は自然界から分離すること
ができる。モラキセラ属に属する微生物としては、モラ
キセラ・フェニルピルビ力５ＣＲＣ−ＣＩ、モラキセラ
・フェニルピルビ力５ＣＲＣ−Ｄ２ｂを挙げることがで
きる。新菌株モラキセラ・フェニルビルビ力５ＣＲＣ−
ＣＩ、及びモラキセｑ３ｑ４）として寄託されている。

前記の新菌株は次の第１表に示す組成の培地を用いて神
奈川県相模原市の土壌より分離しな。

第１表メタノール　　　　　０．８％蟻酸ナトリウム　　　１．０％硫酸アンモニウム　　０．２％に２ＨＰＯ，０，２％ＮａＣＩ　　　　　　　　　０　、１％ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２００，０２％ＮａｚＣＯ３０，２％水道水　　　　　　　ｐＨ９，０〜１０．０前記の新規
な２菌株は第２表に示すような菌学的性質を有する。

第２表、　Ｉ　　　　　　　　　　　　５ＣＲＣ−ＣＩ　　　
５ＣＲＣ−ＤＺｂａ）形態１　細胞の型　　　　　　　　　　短桿菌　　　　　短
桿菌大きさ　　　　　　　　　　　１．５Ｘ０．８μ１
１１１．５Ｘ０．８μｍ２　多形性の有無　　　　　　
　　　−−３運動性の有無　　　　　　　　　−−４胞
子の有無　　　　　　　　　　−−５グラム染色　　　
　　　　　　　−−６抗酸性　　　　　　　　　　　　
−−ｂ）各培地における生育状態１　肉汁寒天平板培養（３０℃、３日間イ）コロニー形
状（直’ｔｌ）　　　　　１．６５ｍ　　　　　　１，
３１１１１１１ａ）コロニーの形　　　　　　　円形　
　　　　　円形へ）コロニー表面の形状　　　　平滑　
　　　　　平滑；）コロニーの隆起状態　　　　台状　
　　　　　半レンズ状本）コロニーの周縁　　　　　　
全円　　　　　　全円へ）コロニー（糟す屑　　　　　
　　白色　　　　　　白色ト）コロニーの透明度　　　
　　不透明　　　　　不透明、　　　　　　　　　　　
　　　５ＣＲＣ−ＣＩ　　　　５ＣＲＣ−Ｄ２ｂチ）コ
ロニーの光沢　　　　　　　純米　　　　　　純米す）
可容性色素の生成　　　　　−− ２肉汁寒天斜面培養（３０℃、３日間）イ）生育の良否
　　　　　　　　生育良好　　　生育良好ｔＦ）コロニ
ーの光沢　　　　　　純米　　　　　　純米３　肉汁液
体培養（３０℃、７日画イ）表面の生育　　　　　　　　−− Ｕ）濁度　　　　　　　　　　　　　かす屑こ濁る　　
かすかに濁るハ）沈殿　　　　　　　　　　　粉状　　
　　　粉状二）ガス発生　　　　　　　　　　−−４肉
汁ゼラチン（３０℃、７日ｍゼラチン液化　　　　　　　　　−− Ｃ）生理学的性質１　硝酸塩の還元　　　　　　　　　−−２脱窒　　　
　　　　　　　　　　−−３ＭＲ−− ４ＶＰ　　　　　　　　　　　　　　−−肌袈几！　　
　　　　　　　　　　　５ＣＲＣ−ＣＩ　　　　５ＣＲ
Ｃ−Ｄ２ｂ５　インドール生成　　　　　　　−−６硫
イＰン→く素り一−ｔすｆこ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　−７デンプンの加水分解　　　　　　−
−８クエン酸利用　　　　　　　　　　−−イ）Ｋｏｓ
ｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
−ｕ）　Ｓｉ鵬ワｎｓ　　　　　　　　　　　−一ハ）
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　　　　　　　　　　　　　　
　−−９硝酸塩の利用　　　　　　　　　−−１０色素
生成　　　　　　　　　　　−−イ）ＫｉｎｇＡ　　培
地　　　　　　−−ロ）ＫｉｎｇＢ　　培地　　　　　
　−−１１ウレアーゼ　　　　　　　　　　−−１２オ
キシダーゼ　　　　　　　　　＋　　　　　　　＋１３
　カタラーゼ　　　　　　　　　　＋　　　　　　　＋
１４　生育の範囲イ）９Ｈ６，０−１０，０６，０−１０，ＯＶ）温度　
　　　　　　　　　　６−３９℃　　　　６−羽℃１５
　酸素に対する態度　　　　　　　好気性　　　　　好
気性１６　０−Ｆテスト（グルコース）　　　作用しな
い　　　作用しない墾３り頁目　　　　　　　　　　　
　　　　　５ＣＲＣ−ＣＩ　　　　　５ＣＲＣ−Ｄ２ｂ
１７　糖類からの酸およびガスの生成　　　　　　　　　　酸　　ガス　　　酸　
　ガスＩ　Ｌ−アラビノース　　　　　−一一一２　Ｄ
−キシロース　　　　　　−−ｍ−３Ｄ−グルコース　
　　　　　−一一一４　Ｄ−マンノース　　　　　　−
−一−５Ｄ−フラクトース　　　　　−ｍ−−６Ｄ−ガ
ラクトース　　　　　−−−−７　麦芽糖　　　　　　
　　　　−−ｍ−８ショ糖　　　　　　　　＋−−− ９　乳糖　　　　　　　　　−−ｍ− １０トレハロース　　　　　　　＋　　十−一１１　　
Ｄ−ソルビット　　　　　　＋　　十−−１２Ｄ−マン
ニット　　　　　　　＋　　＋−−１３　グリセリン　
　　　　　　−一一一１４　デンプン　　　　　　　　
　−一一一１５　ラフィノース　　　　　　　−−ｍ−
１６イヌリン　　　　　　　　　−−ｍ−１７Ｄ−リボ
ース　　　　　　　−−一一眠犯酊り一一一一−５ＣＲ
Ｃ−ＣＩ　　　　５ＣＲＣ−Ｄ２ｂ１８　ソルボース　
　　　　　　　十　　−ｍ−１９カルボキシメチル　　
　　　十　　−一一セルロース２０　グリコーゲン　　　　　　　−−一−ｄ）　抗生
物質番こ吋１“る想６石生１　ペニシリンＧ　　　　　　　　＋　　　　　　　　
＋２　ストレプトマイシン　　　　＋　　　　　　　＋
３　クロラムフェニコール　　　＋　　　　　　　＋４
　テトラザイクリン　　　　　＋　　　　　　　千５　
ノボビオシン　　　　　　　十　　　　　　　−６ポリ
ミキシンＢ　　　　　　　＋　　　　　　　　＋７　フ
ェニルアラニン　　　　　＋　　　　　　　＋脱アミノ
イｄ体素ｅ）その他の諸性質フォスファターゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　
＋ＤＮａｓｅ　　　　　　　　　　　　　　−−アルギ
ニンの分解　　　　　　　　−−ゼラチンの分解性　　
　　　　　　　−−耐塩性　５％　　　　　　　　　　
＋　　　　　　　−肌犯　　　　　　　　　　　　　５
ＣＲＣ−ＣＩ　　　　Ｓ印Ｃ−Ｄ２ｂ７％　　　　　　
　　　　−− １０％　　　　　　　　　　　−− 上記の菌学的性質に基づきに１旺’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆ鉦■叩１亘」ｙぶ工区ｌ旺、第１版、１９８４年の
骨頂基準に従って、前記の２菌株を次のように同定した
。すなわち、ダラム陰性、胞子の生成無し、短桿菌、非
運動性、好気的、オキシダーゼ及びカタラーゼ陽性、及
びグルコースからの酸の生成無し。

このような性質から両菌株ともモラキセラ属に属する細
菌であることが明らかである。さらに両菌株ともにフェ
ニルアラニン脱アミノ化酵素を有することからいずれも
モラキセラ・フェニルビルビカ（Ｍｏｒａｘｅｌ　ｌａ
吐姐れ旺匹畦組）と同定した。

なお、本菌に変異を生じさせて一層生産性の高い菌株を
得ることもできる。これらの菌株の細胞中に存在する蟻
酸脱水素酵素の生産に関与する遺伝子を切り出し、これ
を適切なベクター例えばプラスミドに挿入し、このベク
ターを用いて適当な宿主、例えばエッシェリッヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ−ｈｉａ　ｃｏｌｉ　）や酵母の
ごとき異種宿主を形質転換することにより、本発明の方
法において蟻酸脱水素酵素生産株を人為的に創成するこ
ともできる。

（２）酵素の製造方法前記の微生物を培養して本発明の蟻酸脱水素酵素を製造
しようとする場合、基礎栄養培地として、この発明の微
生物が増殖し得るものであればいずれを使用してもよい
。この培地は、窒素源として例えば硫安、酵母上キス、
ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類を含有する
。また、この培地には必要に応じて炭素源としてグルコ
ース、澱粉、グリセリン等を加えることができる。この
培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム、塩化ナト
リウム、硫酸マグネシュウム等を加えることが好ましい
。

蟻酸脱水素酵素の製造に当っては前記基礎培地に、誘導
物質として小量のメタノールあるいは蟻酸を添加するの
が好ましい、このメタノールあるいは蟻酸の添加量は、
基礎培地の組成、培養する菌株の性質等により異なるが
およそ０．０１〜５１１１／Ｖ％である。

培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いて・　もよ
いが、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い
、振盪培養、通気・撹拌培養等により好気的条件下で培
養を行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、蟻酸
脱水素酵素が生産される温度範囲内であればいずれの温
度でも良いが、好ましくは２５〜４５℃である。ｐＨは
６〜１１、好ましくは７〜１０の範囲である。培養時間
は酵素活性が発現される時間を選べば良いが好ましくは
６〜４８時間である。

次に得られた培養物から本発明の蟻酸脱水素酵素が採取
されるが、精製法として通常の酵素精製法を用いること
が出来る。遠心分離等によって、粗酵素を得、さらにこ
れに硫酸プロタミン又は硫酸ストレプトマイシンを加え
て処理を行ない、塩析、有機溶媒沈殿、吸着クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー等を行ない、さらに硫酸アンモニウム
等の塩やポリエチレングリコール等の添加による結晶化
等の公知の方法によって均一の結晶酵素標品を単離する
ことが出来る。なお、酵素の製造方法の具体的な例を実
施例に記載する。

（３）　力価の測定法本発明においては次の方法により力価を測定した。グリ
シン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐ）１９．０）１００　μｍｏ
ｌ　。

ＮＡＤ”　２．５　μｍｏｌ、蟻酸ナトリウム１０μ１
ｌＩｏｌ、及び適当量のサンプルを１ｍｌになるように
混合して反応せしめ、２５℃におけるＮＡＤＨの増加を
３４０ｎｍの吸光度の増加として計測し、１分間当り１
μＩＩＩｏｉのＮＡＤＨを増加せしめる酵素量を１単位
とした。

（４）酵素の性質本発明の５ＣＲＣ−Ｃ１株により生産される蟻酸脱水素
酵素は次の性質を有する。

（１）作用二次式に示す反応を触媒する。

蟻酸十ＮＡＤ”□二酸化炭素十ＮＡＤＨ＋　Ｈ”（２）
基質特異性二本酵素は蟻酸以外のカルボン酸には全く反
応しない。

補酵素としては、ＮＡＤ＋が必要である。

（３）　ｐＨ安定性：各ｐＨの緩衝液（０，０５Ｍ）中
３０℃にて１時間保温した後の残存活性を測定した場合
、ｐＨ５，０−９，０付近が安定である。

（４）至適温度＝６５℃付近における活性が最大である
。

（５）温度安定性：０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ４Ｊｌ
ｉｒ液（ｐＨ９，０）中、各温度において１０分間処理
した後の残存活性を測定する場合、ｐＨ９，０において
は６０℃で活性が半減する。

（６）吸収スペクトル：　　２８０ｎｍに極大吸収を有
する。

（７）金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金属イ
オン及びＰＣＭＢによって活性が阻害される。

（８）等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合ｐ！３．４である。

（９）分子量：高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫＧ
　−３０００舗）により約９８，０００と算出される。

（１０）サブユニットの分子量：　５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により約４８　、０００と算出さ
れる。

（１１）均一性：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７
，５％、　ｐＨ８，４）により第１図Ａに示す如く単一
のバンドを与える。また、５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（１０，０％、　ｐＨ７，２）により第１
図Ｂに示す如く単一のバンドを与える。

また、本発明の５ＣＲＣ−ＤＺｂ株により生産される蟻
酸脱水素酵素は前記５ＣＲＣ−Ｃ１株により生産される
蟻酸脱水素酵素と同様の隠素化学的性質を有する。

メタノール０．８％、蟻酸ナトリウム１．０％、酵母エ
キス０．０５％、Ｋ２ＨＰＯ４０，２％、ＮａＣｌ　Ｏ
，１％及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０２％を含有し、
ｐＨ８，０に調製した培地４．８リツターを１２０℃、
１５分間加熱殺菌した後、モラキセラ・フェニルピルビ
力５ＣＲＣ−ＣＩ　（微工研菌寄第７３タヨ号）のを接
種し、３０℃で４８時間振盪培養した。以下の精製操作
は、高速液体クロマトグラフィー以外は、すべて０〜５
℃で行った。菌体を生理的食塩水で洗浄した後、０．１
　ｍＭＥＤＴ＾及び５ｎ＋Ｍ２−メルカプトエタノール
を含む０．０１Ｍリン酸Ｍ街液（ｐＨ７，０＞０．４リ
ツターに懸濁し、９　ＫＨｚにおける超音波処理を約２
時間行ない菌体を破砕した。破砕菌体は１４，０００　
Ｘ　ｇ、２０分間の遠心分離で除去し、蟻酸脱水素酵素
を含む素抽出液を得た。この無細胞抽出液に固形硫酸ア
ンモニウムを加え３０％硫酸アンモニウム飽和とした。

３０分撹拌の後、さらに硫酸アンモニウムを加え６０％
硫酸アンモニウム飽和とした。１４，０００　Ｘ　ｇで
２０分間遠心分離して得られる、酵素活性を有する沈殿
を少量の０．ＯＩＭ　リン酸ＭＩ街液（ｐＨ７，０）に
溶解し、透析した。この酵素液をあらかじめ０．１…Ｈ
のＥＤＴ＾及び５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含
む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化した
ＤＥＡＥ−セルロースのカラムに通過させ、０．１ｍＭ
のＥＤＴ＾及び５−の２−メルカプトエタノールを含む
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞で溶出した。酵素
液を３０％硫酸アンモニウム飽和とし、同様に３０％硫
酸アンモニウム飽和とした０、０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で平衡化したブチル−トヨパール６５０Ｍの
カラムに通過させ、３０％硫酸アンモニウム飽和から０
％の同じ緩衝液の（ｐＨ７，０）の直線な濃度勾配で酵
素を溶出させた。活性区分を集め、透析後濃縮し０．１
ｍＭのＥＤＴ＾及び５ＩＩＩＭの２−メルカプトエタノ
ール及び０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む０．０５Ｍリン酸Ｍ
衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したセファデックスＧ−１
００によるゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。こ
のようにして得た酵素液を限外濾過により濃縮し、以下
のように高速液体クロマトグラフィーを行なった。すな
わち、０．２ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸緩衝液
（、Ｈ７，Ｏ）で初期化したＴＳＫ　Ｇ−３００ＯＳＨ
のカラムにつけ、同じＭ漬液により溶出した。こう　　
　□して、蟻酸脱水素酵素を約８．２％の収率で約２３
倍に精製した。この精製工程における比活性及び回収率
を第３表に示す、この酵素はポリアクリルアミドゲル電
気泳動及び５ＤＳ−ボリアクリルア゛ミドゲル電気泳動
において均一であることが証明された。

第３表５．セファデックス　　　　７２　　　　　１８　　　
　４．００　　　　　１５メタノール０．８％、蟻酸ナ
トリウム１．０％、酵母エキ、２．０．０５％、Ｋ、Ｉ
ＩＰｏ、　０．２％、ＮａＣｌ　０．１％及びＭｇＳＯ
４・７Ｈ２Ｑ　Ｏ，０２％を含有し、ｐＩＩ９．０Ｇ、
：調製した培地３０リツターを１２０℃、１５分間加熱
殺菌した後、モラキセラ・フェニルピルビ力５ＣＲＣ−
Ｄ２ｂ（微工研菌寄第０３７４号）を接種し湿重量的３
８ｇの菌体を得た。以下の精製操作は、すべて０〜５℃
で行った。菌体を生理的食塩水で洗浄した後、０．１ｍ
Ｍ　ＥＤＴ＾及び５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含
むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）０．４リツターに懸濁し
、９　ＫＨｚにおける超音波処理を約３時間行ない菌体
を破砕した。破砕菌体は１４，０００χｇ、２０分間の
遠心分離で除去し、蟻酸脱水素酵素を含む素抽出液を得
た。この無細胞抽出液を５５℃、１Ｇ分間の熱処理の後
、固形硫酸アンモニウムを加え３０％硫酸アンモニウム
飽和とした。３０分撹拌の後、さらに硫酸アンモニウム
を加え６０％硫酸アンモニウム飽和とした。　１４，０
００　Ｘ、で２Ｇ分間遠心分離して得られる、酵素活性
を有する沈殿を少量の０．０１Ｍ　ＩＪ　ンＲ緩街液（
ｐ　ＩＩ　７　、　Ｏ）　Ｇ、：溶解し、さラニ０．１
ｍＭのＥＤＴ＾及び５ｍＭの２−メルカプトエタノール
を含む０．ＯＩＭリン酸Ｍ街液（ｐＨ１７，０）で透析
した。この酵素液をあらかじめ０．１＋＊ＭのＥＤＴ＾
及び５ＩＩＩＭの２−メルカプトエタノールを含む０．
０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＤＥＡ
Ｅ−セルロースのカラムに通過させ、０．０１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄し、さらに０．１論ＨのＥ
ＤＴ＾及び５論Ｈの２−メルカプトエタノールを含む０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出した。酵素液
を３０％硫酸アンモニウム飽和とし、同様に３０％硫酸
アンモニウム飽和の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）で平衡化したブチル−トヨバール６５０Ｍのカラム
に通過させ、３０％硫酸アンモニウム飽和から０％の同
じ緩衝液の（ｐＨ７，０）の直線な濃度勾配で酵素を溶
出させた。

活性区分を集め、透析後濃縮し０．１ａ＋ＭのＥＤＴ＾
及び５−の２−メルカプトエタノール及び０．１Ｍ　Ｎ
ａＣ１を含む０．０５Ｍリンリン酸緩衝液Ｈ７，０）で
平衡化したセファデックスＧ−２００によるゲル濾過ク
ロマトグラフィーを行なった。こうして、蟻酸脱水素酵
素を約１７％の収率で約１５倍に精製した。この精製工
程における比活性及び回収率を第４表に示す、この酵素
はポリアクリルアミドゲル電気泳動及び５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動において均一であることが証
明された。

第ユ４−宍１、無細胞抽出液　　　　１２９０　　　　７０５０　
　　　　０．１８３　　　　１００２、熱処理及び　　
　　　９５０　　　　１４００　　　　０．６７８　　
　　７４硫安分画３．０ＥＡＥ−セルロース　　　３７２　　　　　２５
１　　　　　１．４９　　　　　２９４、　Ｂｕｔｙｌ
　−）ヨパール　　３０５　　　　　１０６　　　　　
２．８８　　　　　２４５、セファデックス　　　　２
１５　　　　　８０．５　　　　２．６７　　　　　１
７第４表に示した工程５のモラキセラ・フェニルビルビ
カ５ＣＲＣ−Ｄ２ｂ由来の蟻酸脱水素酵素を用いて、以
下のようにＬ−フェニルアラニンの合成を行った。すな
わち、Ｎ）１．０１１−ＮＨ，ＣＩ緩衝液、ｐＨ９，０
１００μｍｏｌ、フェニルピルビン酸ナトリウム１００
μ輸ｏ１．　ＮＡＤ”　２．５μｓｏｌ、蟻酸ナトリウ
ム１．２　＋ｎｍｏｌフェニルアラニン脱水素酵素（バ
シルス・スフェリカス５ＣＲＣ−Ｒ７９ａ由来〉２８単
位、蟻酸脱水素酵素１５単位を含む５０輪１の反応液を
３０℃で、２４時間保温した。反応液中に生成したし一
フェニルアラニンをペディオコッカス・アシディラクテ
ィシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　ａｃｉｄｉｌａｃｔｉ
ｃｉ）＾ＴＣＣ８０４２を用いる微生物定量法で定量し
たところ、収率６３％でＬ−フェニルアラニンが生成し
ていた。

【図面の簡単な説明】

第１図はモラキセラ・フェニルビルビカ５ＣＲＣ−Ｃ１
株が生産する蟻酸脱水素酵素の均一性な示す電気泳動図
であって、Ａはポリアクリルアミド電気泳動（７，５％
、　ｐＨ８，４）を示し、そしてＢは５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（１０，０％、　ｐＨ７，２）
を示す。 ■　　　　　　　　　　　　　　○ 第１図手続補正書く自発）昭和６３年７り／３日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、　事件の表示昭和６２年特許願第１４６９１９号４、代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号（外
５名）５、補正の対象明細書の「発明の詳細な説明」の欄５、補正の内容明細書第１４頁第１７行目「−」をｒ−→」に補正する。

Claims

【特許請求の範囲】１、モラキセラ（￥ｍｏｒａｘｅｌｌａ￥）属細菌によ
り生産される蟻酸脱水素酵素。２、前記細菌がモラキセラ・フェニルピルビカ（￥Ｍｏ
ｒａｘｅｌｌａ￥￥ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃａ￥）
である特許請求の範囲第１項記載の蟻酸脱水素酵素。３、蟻酸脱水素酵素を生産することができるモラキセラ
・フェニルピルビカ（￥Ｍｏｒａｘｅｌｌａ￥￥ｐｈｅ
ｎｙｌ−￥￥ｐｙｒｕｖｉｃａ￥）種細菌。４、モラキセラ・フェニルピルビカ（￥Ｍｏｒａｘｅｌ
ｌａ￥￥ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃａ￥）ＳＣＲＣ−
Ｃ１（微工研菌寄第９３９３号）及びモラキセラ・フェ
ニルピルビカ（￥Ｍｏｒａｘｅｌｌａ￥￥ｐｈｅｎｙｌ
ｐｙｒｕｖｉｃａ）ＳＣＲＣ−Ｄ２ｂ（微工研菌寄第９
３９４号）である特許請求の範囲第３項記載の細菌。