JPS6332482A - L−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 - Google Patents
L−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、L−フェニルアラニン脱水素酵素及びその
製造方法に関する。
製造方法に関する。
本発明のL−フェニルアラニン脱水素酵素に類似する作
用を有するL−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及び
この酵素を利用するし一α−アミノカルボン酸の製造方
法が特開昭59−198972に記載されている。しか
しながらこの公開された明細書に記載されているL−フ
ェニルアラニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム
(Brevibacterium)属細菌により生産さ
れたものであり、この明細書には、バシルス(Baci
llus)属細菌が同情の酵素を生産することは全く示
唆されていない。またこのL−フェニルアラニンデヒド
ロゲナーゼはL30.OO’0±10,000の分子量
を有し、分子! 6.600±5,000のサブユニッ
トから成る点、及びフェニルピルビン酸のみならずp−
ヒドロキシフェニルピルビン酸、インドールピルビン酸
等広範囲の基質に対して高い特異性を有する点等におい
て、本発明のL−フェニルアラニン脱水素酵素とは全く
異なる。
用を有するL−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及び
この酵素を利用するし一α−アミノカルボン酸の製造方
法が特開昭59−198972に記載されている。しか
しながらこの公開された明細書に記載されているL−フ
ェニルアラニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム
(Brevibacterium)属細菌により生産さ
れたものであり、この明細書には、バシルス(Baci
llus)属細菌が同情の酵素を生産することは全く示
唆されていない。またこのL−フェニルアラニンデヒド
ロゲナーゼはL30.OO’0±10,000の分子量
を有し、分子! 6.600±5,000のサブユニッ
トから成る点、及びフェニルピルビン酸のみならずp−
ヒドロキシフェニルピルビン酸、インドールピルビン酸
等広範囲の基質に対して高い特異性を有する点等におい
て、本発明のL−フェニルアラニン脱水素酵素とは全く
異なる。
特開昭61−146183にはロドコッカス(Rhod
ococcus)属細菌の生産するL−フェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼ及びこの酵素を利用するし一α−7
ミノカルボン酸の製造方法が記載されている。この明細
書には、バシルス(Bacillus)属細閑が同様の
酵素を生産することは全く示唆されていない。ロドコッ
カス属細菌の生産する酵素はL−フェニルアラニンに対
して著しく高い基質特異性を有することが記載されてい
るが、酵素の分子量については全く記載されていない。
ococcus)属細菌の生産するL−フェニルアラニ
ンデヒドロゲナーゼ及びこの酵素を利用するし一α−7
ミノカルボン酸の製造方法が記載されている。この明細
書には、バシルス(Bacillus)属細閑が同様の
酵素を生産することは全く示唆されていない。ロドコッ
カス属細菌の生産する酵素はL−フェニルアラニンに対
して著しく高い基質特異性を有することが記載されてい
るが、酵素の分子量については全く記載されていない。
本発明者等の発明に係る特願昭60−080293号及
び特願昭60−127118号明細書にはバシルス属微
生物又はスポロサルシナμ江犯1と猛劇1り一属微生物
が生産するし一フヱニルアラニン脱水素酵素及びその製
造方法、並びに該酵素を使用するL−フェニルアラニン
の製造方法が記載されている。しかし、これらの微生物
に由来するフェニルアラニン脱水素酵素はいずれも高速
液体クロマトグラフィー(TSK 3000 Sりによ
り測定される約290.000の分子量を有する点など
において、360.000〜370,000の分子量を
有する本発明のフェニルアラニン脱水素酵素と異る。
び特願昭60−127118号明細書にはバシルス属微
生物又はスポロサルシナμ江犯1と猛劇1り一属微生物
が生産するし一フヱニルアラニン脱水素酵素及びその製
造方法、並びに該酵素を使用するL−フェニルアラニン
の製造方法が記載されている。しかし、これらの微生物
に由来するフェニルアラニン脱水素酵素はいずれも高速
液体クロマトグラフィー(TSK 3000 Sりによ
り測定される約290.000の分子量を有する点など
において、360.000〜370,000の分子量を
有する本発明のフェニルアラニン脱水素酵素と異る。
従って本発明は、今まで知られているL−フェニルアラ
ニン脱水素酵素とは異る新規なL−フェニルアラニン脱
水素酵素、及びその製造方法を提供しようとするもので
ある。
ニン脱水素酵素とは異る新規なL−フェニルアラニン脱
水素酵素、及びその製造方法を提供しようとするもので
ある。
本発明者等は、該酵素を生産する新規な微生物及び該酵
素の新規な製造方法を開発するために、L−フェニルア
ラニン脱水素酵素活性を有する菌株を広範囲にスクリー
ニングしたところ、バシルス属微生物が高活性で新規な
し一フヱニルアラニン脱水素酵素を生産することを見い
出した。
素の新規な製造方法を開発するために、L−フェニルア
ラニン脱水素酵素活性を有する菌株を広範囲にスクリー
ニングしたところ、バシルス属微生物が高活性で新規な
し一フヱニルアラニン脱水素酵素を生産することを見い
出した。
前記の目的は、次の性質:(1)1モルのL−フェニル
アラニン、1モルのNAD’及び1モルの水から1モル
のフェニルピルビン酸、1モルのアンモニウムイオン及
び1モルのNADHを生成する反応、並びにこの逆反応
を触媒する;(2)高速液体クロマトグラフィーゲル濾
過法において約360,000〜370、000の分子
量を示し、SDS−ポリアクリルアミドディスク電気泳
動法において約38.000〜39.000の分子量を
有するサブユニットを示す;及び(3)L−フェニルア
ラニンに特異的に作用し、L−チロシン、L−トリプト
ファン及びL−メチオニンに対する特異性が非常に低い
;を有することを特徴とするL−フェニルアラニン脱水
素酵素;並びにバシルス属微生物を培養し、この培養物
から前記酵素を採取することを特徴とする前記酵素の製
造方法を提供することにより解決される。
アラニン、1モルのNAD’及び1モルの水から1モル
のフェニルピルビン酸、1モルのアンモニウムイオン及
び1モルのNADHを生成する反応、並びにこの逆反応
を触媒する;(2)高速液体クロマトグラフィーゲル濾
過法において約360,000〜370、000の分子
量を示し、SDS−ポリアクリルアミドディスク電気泳
動法において約38.000〜39.000の分子量を
有するサブユニットを示す;及び(3)L−フェニルア
ラニンに特異的に作用し、L−チロシン、L−トリプト
ファン及びL−メチオニンに対する特異性が非常に低い
;を有することを特徴とするL−フェニルアラニン脱水
素酵素;並びにバシルス属微生物を培養し、この培養物
から前記酵素を採取することを特徴とする前記酵素の製
造方法を提供することにより解決される。
(1)微生立
本発明において使用する微生物として、例えばバシルス
・バディウスIAM 11059(ATCC14574
)微工研菌寄第8529号(FERM P−8529)
を挙げることができる。本菌はATCCカタログやJF
CCカタログに記載されており、容易に入手することが
できる。
・バディウスIAM 11059(ATCC14574
)微工研菌寄第8529号(FERM P−8529)
を挙げることができる。本菌はATCCカタログやJF
CCカタログに記載されており、容易に入手することが
できる。
なお、本菌に変異を生じさせて一層生産性の高い菌株を
得ることもできる。さらに、これらの菌株の細胞中に存
在するL−フェニルアラニン脱水素酵素の生産に関与す
る遺伝子を切り出し、これを適切なベクター例えばプラ
スミドに挿入し、このベクターを用いて適当な宿主、例
えばエソシエリノヒア・コリ (Eshcherich
ia coli)や酵母のごとき異種宿主を形質転換す
ることにより、L−フェニルアラニン脱水素酵素生産株
を人為的に創成することもできる。
得ることもできる。さらに、これらの菌株の細胞中に存
在するL−フェニルアラニン脱水素酵素の生産に関与す
る遺伝子を切り出し、これを適切なベクター例えばプラ
スミドに挿入し、このベクターを用いて適当な宿主、例
えばエソシエリノヒア・コリ (Eshcherich
ia coli)や酵母のごとき異種宿主を形質転換す
ることにより、L−フェニルアラニン脱水素酵素生産株
を人為的に創成することもできる。
(2) MlぶりもL1汰
前記の微生物を培養して本発明のL−フェニルアラニン
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の1種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム
、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えることが
好ましい。
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の1種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム
、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えることが
好ましい。
L−フェニルアラニン脱水素酵素の製造に当っては前記
基礎培地に、誘導物質として少量のL−フェニルアラニ
ンを添加するのが好ましい。このL−フヱニルアラニン
の添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株の性質等に
より異なるがおよそ0.01〜1 w / v%である
。
基礎培地に、誘導物質として少量のL−フェニルアラニ
ンを添加するのが好ましい。このL−フヱニルアラニン
の添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株の性質等に
より異なるがおよそ0.01〜1 w / v%である
。
培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いてもよいが
、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い、振
盪培養、通気・撹拌培養等により好気的条件下で培養を
行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、L−フェ
ニルアラニン脱水素酵素が生産される温度範囲内であれ
ばいずれの温度でも良いが、好ましくは25〜45℃で
ある。pHは6〜11、好ましくは7〜IOの範囲であ
る。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良い
が好ましくは6〜48時間である。
、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い、振
盪培養、通気・撹拌培養等により好気的条件下で培養を
行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、L−フェ
ニルアラニン脱水素酵素が生産される温度範囲内であれ
ばいずれの温度でも良いが、好ましくは25〜45℃で
ある。pHは6〜11、好ましくは7〜IOの範囲であ
る。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べば良い
が好ましくは6〜48時間である。
次に得られた培養物から本発明のL−フェニルアラニン
脱水素酵素が採取されるが、精製法として通常の酵素精
製法を用いることが出来る。遠心分離等によって、粗酵
素を得、さらにこれに硫酸プロタミン又は硫酸ストレプ
トマイシンを加えて処理を行ない、塩析、有機溶媒沈澱
、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行ない、さらに
硫酸アンモニウム等の塩やポリエチレングリコール等の
添加による結晶化等の公知の方法によって均一の結晶酵
素標品を単離することが出来る。なお、本発明の酵素の
製造方法の具体的な一例を実施例に記載する。
脱水素酵素が採取されるが、精製法として通常の酵素精
製法を用いることが出来る。遠心分離等によって、粗酵
素を得、さらにこれに硫酸プロタミン又は硫酸ストレプ
トマイシンを加えて処理を行ない、塩析、有機溶媒沈澱
、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行ない、さらに
硫酸アンモニウム等の塩やポリエチレングリコール等の
添加による結晶化等の公知の方法によって均一の結晶酵
素標品を単離することが出来る。なお、本発明の酵素の
製造方法の具体的な一例を実施例に記載する。
(3)力l■亙定抹
本発明においては次の方法により力価を測定した。酸化
的脱アミノ化反応ニゲリシン−Kct−Ko[l衝液(
pH10,5) 100 p mol 、 NAD”
2.5 、czmol 、L−フェニルアラニン10μ
mol−、及び適当量のサンプルを1mlになるように
混合して反応せしめ、25℃におけるNADHの増加を
340nmの吸光度の増加として計測し、1分間当り1
μmol のNA叶を増加せしめる酵素量を1単位とす
る。
的脱アミノ化反応ニゲリシン−Kct−Ko[l衝液(
pH10,5) 100 p mol 、 NAD”
2.5 、czmol 、L−フェニルアラニン10μ
mol−、及び適当量のサンプルを1mlになるように
混合して反応せしめ、25℃におけるNADHの増加を
340nmの吸光度の増加として計測し、1分間当り1
μmol のNA叶を増加せしめる酵素量を1単位とす
る。
還元的アミノ化反応ニゲリシン−KC1lfi衝液(p
H9、5)100 # molXNADHO,1p m
ol、NH4Cl 12001! mol−フェニルピ
ルビン酸ナトリウム10μff1o1及ヒ適当量のサン
プルを1mlになるように混合して反応せしめ、25℃
におけるNADHの減少を340nmの吸光度の減少と
して計測し、1分間当り1μmolのNADHを減少せ
しめる酵素量を1単位とする。なお本文中の酵素活性の
単位は酸化的脱アミノ化反応における活性の値を用いて
いる。
H9、5)100 # molXNADHO,1p m
ol、NH4Cl 12001! mol−フェニルピ
ルビン酸ナトリウム10μff1o1及ヒ適当量のサン
プルを1mlになるように混合して反応せしめ、25℃
におけるNADHの減少を340nmの吸光度の減少と
して計測し、1分間当り1μmolのNADHを減少せ
しめる酵素量を1単位とする。なお本文中の酵素活性の
単位は酸化的脱アミノ化反応における活性の値を用いて
いる。
(4)詐素立咀1
本発明のL−フェニルアラニン脱水素酵素は次の性質を
有する。
有する。
(1)作用:次式に示す反応を触媒する。
L−フェニルアラニン+NAD” +11□0−フェニ
ルピルビン成子NADH+NH,” (2)基質特異性二本酵素は酸化的脱アミノ化反応では
、L−フェニルアラニン以外のし一アミノ酸には掻めて
わずかにしか反応しないか又は全く反応しない。
ルピルビン成子NADH+NH,” (2)基質特異性二本酵素は酸化的脱アミノ化反応では
、L−フェニルアラニン以外のし一アミノ酸には掻めて
わずかにしか反応しないか又は全く反応しない。
補酵素としては、NAD”が必要であり、NADP”は
NAD”に対して約1.8%の活性を示すにすぎない。
NAD”に対して約1.8%の活性を示すにすぎない。
(3)至適pH:酸化的脱アミノ化反応では、pH10
,5付近が至適であり、還元的アミノ化反応では、pH
9,4付近が至適である。
,5付近が至適であり、還元的アミノ化反応では、pH
9,4付近が至適である。
(4)pH安定性:各pHの緩衝液(0,05M)中3
0℃にて1時間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ
化反応について測定した場合、pH8,0付近が安定で
ある。
0℃にて1時間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ
化反応について測定した場合、pH8,0付近が安定で
ある。
(5)至適温度265℃付近における活性が最大である
。
。
(6)温度安定性:0.1Mリン酸緩衝液(pH8,0
”)中、各温度において10分間処理した後の残存活性
を酸化的脱アミノ化反応について測定する場合、55℃
で活性が半減する。
”)中、各温度において10分間処理した後の残存活性
を酸化的脱アミノ化反応について測定する場合、55℃
で活性が半減する。
(7)吸収スペクトル:278nmに極大吸収を有する
。
。
(8)金属イオン、阻害剤の影響:銀、水銀等の金属イ
オン及びPCMBによって活性が阻害される。
オン及びPCMBによって活性が阻害される。
(9)等電点:アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合3.5である。
り測定した場合3.5である。
(10)分子量:高速液体クロマトグラフィー(TSK
3000 S誓)により約360.000〜370 、
000と算出される。
3000 S誓)により約360.000〜370 、
000と算出される。
(11)サブユニットの分子量: SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により約38.000〜39 、
000と算出される。
ルアミドゲル電気泳動により約38.000〜39 、
000と算出される。
(12)均一性:ポリアクリルアミドゲル電気泳動(7
,5%、p)1B、4)により第1図式に示す如(単一
のバンドを与える。また、SDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動(10,0%、 pH7,2) ニヨリ第
1図Bに示す如く単一のバンドを与える。
,5%、p)1B、4)により第1図式に示す如(単一
のバンドを与える。また、SDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動(10,0%、 pH7,2) ニヨリ第
1図Bに示す如く単一のバンドを与える。
次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。
L−フェニルアラニン0.2%、酵母エキス0.5%、
ペプトン1.0%、KJPOa O,2%NaCl0.
1%及びMg5Oa・7tlzQ O,02%を含有
し、pH7,0に調製した培地30リツターを120℃
、15分間加熱殺菌した後、バシルス・バディウスIA
M 11059(lk工研菌寄第8529号)を接種し
湿重發約280 gの菌体を得た。菌体を生理的食塩水
で洗浄した後、(L 1 m M EDTA及び5mM
2−メルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液(pH7
,0) 1リツターに懸濁し、9 KHzにおける超
音波処理を約10時間行ない菌体を破砕した。破砕菌体
は14.000X g、20分間の遠心分離で除去し、
L−フェニルアラニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得た
。この無細胞抽出液を50℃、10分間の熱処理の後、
固形硫酸アンモニウムを加え30%硫酸アンモニウム飽
和とした。30分撹拌の後、生成した沈澱を14.00
0X gで20分間遠心分離することにより除去した。
ペプトン1.0%、KJPOa O,2%NaCl0.
1%及びMg5Oa・7tlzQ O,02%を含有
し、pH7,0に調製した培地30リツターを120℃
、15分間加熱殺菌した後、バシルス・バディウスIA
M 11059(lk工研菌寄第8529号)を接種し
湿重發約280 gの菌体を得た。菌体を生理的食塩水
で洗浄した後、(L 1 m M EDTA及び5mM
2−メルカプトエタノールを含むリン酸緩衝液(pH7
,0) 1リツターに懸濁し、9 KHzにおける超
音波処理を約10時間行ない菌体を破砕した。破砕菌体
は14.000X g、20分間の遠心分離で除去し、
L−フェニルアラニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得た
。この無細胞抽出液を50℃、10分間の熱処理の後、
固形硫酸アンモニウムを加え30%硫酸アンモニウム飽
和とした。30分撹拌の後、生成した沈澱を14.00
0X gで20分間遠心分離することにより除去した。
この上清に固形硫酸アンモニウムを加え60%硫酸アン
モニウム飽和とした。遠心分離にり得られる、酵素活性
を有する沈澱を少量の0.01Mリン酸緩衝液(pH7
,0)に溶解し、さらに0.1mMのEDTA及び5m
Mの2−メルカプトエタノールを含むQ、01Mリン酸
緩衝液(pH7,0)で透析した。この酵素液をあらか
じめQ、1mMのEDTA及び5mMの2−メルカプト
エタノールを含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7,0
)で平衡化したDEAE−トヨパール650Mのカラム
に通過させ、さらに0.1mMのEDTA及び5mMの
2−メルカプトエタノールおよび0.1MのNaC1を
含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7,0)で溶出した。
モニウム飽和とした。遠心分離にり得られる、酵素活性
を有する沈澱を少量の0.01Mリン酸緩衝液(pH7
,0)に溶解し、さらに0.1mMのEDTA及び5m
Mの2−メルカプトエタノールを含むQ、01Mリン酸
緩衝液(pH7,0)で透析した。この酵素液をあらか
じめQ、1mMのEDTA及び5mMの2−メルカプト
エタノールを含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7,0
)で平衡化したDEAE−トヨパール650Mのカラム
に通過させ、さらに0.1mMのEDTA及び5mMの
2−メルカプトエタノールおよび0.1MのNaC1を
含む0.1Mリン酸緩衝液(pH7,0)で溶出した。
活性区分を集め、0.1mMのEDTA及び5mMの2
−メルカプトエタノールを含む0.OIMリンeJ11
衝液(pH7,0)で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で
平衡化したDEAE” トヨパール650 Mのカラム
に通過させ、前工程と同様にして酵素を溶出させた。
−メルカプトエタノールを含む0.OIMリンeJ11
衝液(pH7,0)で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で
平衡化したDEAE” トヨパール650 Mのカラム
に通過させ、前工程と同様にして酵素を溶出させた。
この活性区分を集め、固体硫酸了ンモニうムの添加によ
り40%の硫酸アンモニウム飽和とした。
り40%の硫酸アンモニウム飽和とした。
生成する沈澱を遠心分離により除去し、上清をさらに5
0%硫酸アンモニウム飽和とした。酵素活性を有する沈
澱を遠心分離により得、少量の0.01Mリン酸緩衝液
(pH7,0)に溶解し、0.1mMのEDTA及び5
mMの2−メルカプトエタノールを含む0.01Mリン
酸緩衝液(pH7,0)で透析した。この酵素液を再び
30%硫酸アンモニウム飽和とし、あらかじめ0.1
m M EDTA及び5mMの2−メルカプトエタノー
ルを含むO,01Mリン酸緩衝液(pl(7,0)の3
0%硫酸アンモニウム飽和液で平衡化したオクチル−セ
ファロースのカラムに通過させ30%から0%の硫酸ア
ンモニウム飽和の同リン酸緩衝液の直線的な濃度勾配で
酵素を溶出させた。
0%硫酸アンモニウム飽和とした。酵素活性を有する沈
澱を遠心分離により得、少量の0.01Mリン酸緩衝液
(pH7,0)に溶解し、0.1mMのEDTA及び5
mMの2−メルカプトエタノールを含む0.01Mリン
酸緩衝液(pH7,0)で透析した。この酵素液を再び
30%硫酸アンモニウム飽和とし、あらかじめ0.1
m M EDTA及び5mMの2−メルカプトエタノー
ルを含むO,01Mリン酸緩衝液(pl(7,0)の3
0%硫酸アンモニウム飽和液で平衡化したオクチル−セ
ファロースのカラムに通過させ30%から0%の硫酸ア
ンモニウム飽和の同リン酸緩衝液の直線的な濃度勾配で
酵素を溶出させた。
この活性区分を集め、0.1mMのEDTA及び5mM
の2−メルカプトエタノール及び0.1 MNaClを
含む0.05Mリン酸緩衝液(pH7,0)で平衡化し
たセファデックスG−200によるゲル濾過クロマトグ
ラフィーを行なった。こうして、L−フェニルアラニン
脱水素酵素を約7.2%の収率で約190倍に精製した
。この精製過程における比活性及び回収率を第1表に示
す。この酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳動(7,
5%ゲル、pH8,4)及びSDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(10,0%ゲル、pH7,2)におい
て均一であることが証明された。
の2−メルカプトエタノール及び0.1 MNaClを
含む0.05Mリン酸緩衝液(pH7,0)で平衡化し
たセファデックスG−200によるゲル濾過クロマトグ
ラフィーを行なった。こうして、L−フェニルアラニン
脱水素酵素を約7.2%の収率で約190倍に精製した
。この精製過程における比活性及び回収率を第1表に示
す。この酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳動(7,
5%ゲル、pH8,4)及びSDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動(10,0%ゲル、pH7,2)におい
て均一であることが証明された。
第1表
1互性上 L−フェニルアラニン 7、索9−フェニ
ルビルビン酸ナトリウム20.4■(100μmol)
、蟻酸アンモニウム50 N (800p mol)、
NAD”3.6N (5μmol)、トリス−塩酸緩衝
液(pH8,5)250、crmol sバシルス・バ
ディウスIAM 11059のL−フェニルアラニン脱
水素酵素0.5単位(均一精製酵素)、および粗蟻酸脱
水素酸素0.5単位((pH8,5)、カンジダ・ボイ
ディニ11h2201より部分精製)を含む5+wlの
反応液を30℃において24時間保温した。微生物定量
法により定量したところ16.2mg (98、crm
ol; 98%の転換率)のし−フェニルアラニンが生
成していた。
ルビルビン酸ナトリウム20.4■(100μmol)
、蟻酸アンモニウム50 N (800p mol)、
NAD”3.6N (5μmol)、トリス−塩酸緩衝
液(pH8,5)250、crmol sバシルス・バ
ディウスIAM 11059のL−フェニルアラニン脱
水素酵素0.5単位(均一精製酵素)、および粗蟻酸脱
水素酸素0.5単位((pH8,5)、カンジダ・ボイ
ディニ11h2201より部分精製)を含む5+wlの
反応液を30℃において24時間保温した。微生物定量
法により定量したところ16.2mg (98、crm
ol; 98%の転換率)のし−フェニルアラニンが生
成していた。
バシルス・バディウスIAM 11059により生産さ
れるL−フェニルアラニン脱水素酵素の基質特異性を酸
化的脱7ミノ化について測定した場合、L−フェニルア
ラニン以外のし一アミノ酸にはきわめてわずかしか反応
しないが、還元的アミノ化反応においては相当に広い基
質特異性を有する。この知見に基き、バシルス・バディ
ウスIAM 11059の菌体あるいはL−フェニルア
ラニン脱水素酵素を用いて第2表に記載する各種のα−
ケト酸からそれぞれ対応するし一アミノ酸の合成を行な
った。
れるL−フェニルアラニン脱水素酵素の基質特異性を酸
化的脱7ミノ化について測定した場合、L−フェニルア
ラニン以外のし一アミノ酸にはきわめてわずかしか反応
しないが、還元的アミノ化反応においては相当に広い基
質特異性を有する。この知見に基き、バシルス・バディ
ウスIAM 11059の菌体あるいはL−フェニルア
ラニン脱水素酵素を用いて第2表に記載する各種のα−
ケト酸からそれぞれ対応するし一アミノ酸の合成を行な
った。
なお、表中でL−フェニルアラニン脱水素酵素の状態で
「粗酵素」とは無細胞抽出液を硫安分画した酵素を意味
し、「部分精製酵素」とは、さらにDEAE−トヨパー
ルカラムを通過させた酵素を意味する。NADゝ又はN
ADHの濃度は1ないし20mMの濃度となるようにし
た。アンモニウムイオンは塩化アンモニウム、蟻酸アン
モニウム又はNH,0R−NH4C1緩衝液(pH9,
0)として供給し、その4度は0.05ないし0.5M
の濃度となるようにした。蟻酸は蟻酸ナトリウム又は蟻
酸アンモニウムとして供給し、その量はα−ケトカルボ
ン酸の1〜30当量とした。反応液のpHは8.5ない
し9であり、トリス−HCl緩衝液(pH8,5)又は
NH,0)l−Nl(4C1緩衝液(pH9,0)を0
.05ないし0.5 Mの?農産となるようにして用い
た。反応は30℃で行なった。反応液中に生成したL−
アミノ酸の定量はロイコノストック1メセンテロイデス
(Leuconostoc mesente−roid
es)ATCC8042を用いるバイオアッセイにより
行なった。
「粗酵素」とは無細胞抽出液を硫安分画した酵素を意味
し、「部分精製酵素」とは、さらにDEAE−トヨパー
ルカラムを通過させた酵素を意味する。NADゝ又はN
ADHの濃度は1ないし20mMの濃度となるようにし
た。アンモニウムイオンは塩化アンモニウム、蟻酸アン
モニウム又はNH,0R−NH4C1緩衝液(pH9,
0)として供給し、その4度は0.05ないし0.5M
の濃度となるようにした。蟻酸は蟻酸ナトリウム又は蟻
酸アンモニウムとして供給し、その量はα−ケトカルボ
ン酸の1〜30当量とした。反応液のpHは8.5ない
し9であり、トリス−HCl緩衝液(pH8,5)又は
NH,0)l−Nl(4C1緩衝液(pH9,0)を0
.05ないし0.5 Mの?農産となるようにして用い
た。反応は30℃で行なった。反応液中に生成したL−
アミノ酸の定量はロイコノストック1メセンテロイデス
(Leuconostoc mesente−roid
es)ATCC8042を用いるバイオアッセイにより
行なった。
なお、具体的には次の様にして反応を行ない、後記の結
果を得た。
果を得た。
反応1号上
フェニルピルビン酸ナトリウム74.3■(364μm
o+)、グリセロール28■(300μmol)、バシ
ルス・バディウスTA?’l 11059の菌体(51
の培養液から菌体を遠心分離で集菌し、生理的食塩水で
1回洗浄した菌体)を含む5mlの反応液を30℃で2
4時間静置した。反応液中のL−フェニルアラニンの量
を微生物定量法により測定したところ25■(153μ
mol:42%の転換率)のし−フェニルアラニンが生
成していた。
o+)、グリセロール28■(300μmol)、バシ
ルス・バディウスTA?’l 11059の菌体(51
の培養液から菌体を遠心分離で集菌し、生理的食塩水で
1回洗浄した菌体)を含む5mlの反応液を30℃で2
4時間静置した。反応液中のL−フェニルアラニンの量
を微生物定量法により測定したところ25■(153μ
mol:42%の転換率)のし−フェニルアラニンが生
成していた。
反応番号2はこの例と同様に実験を行なった。
反息脣号主
フェニルピルビン酸ナトリウム20.4■(100μm
ol)、NADH76,3mg (100u mo+)
、トリス−塩酸緩衝液(pH8、5)250 μmol
、塩化アンモニウム107mg(2mmol)、バシ
ルス・バディウスIAM 11059のL−フェニルア
ラニン脱水素酵素0.5単位(硫安分画における30〜
60%飽和画分)を含む5mlの反応液を30℃におい
て24時間保温した。
ol)、NADH76,3mg (100u mo+)
、トリス−塩酸緩衝液(pH8、5)250 μmol
、塩化アンモニウム107mg(2mmol)、バシ
ルス・バディウスIAM 11059のL−フェニルア
ラニン脱水素酵素0.5単位(硫安分画における30〜
60%飽和画分)を含む5mlの反応液を30℃におい
て24時間保温した。
反応液中のL−フェニルアラニン量を微生物定量法によ
り測定したところ、15.7■(95μmol;95%
の転換率)のし−フェニルアラニンが生成していた。反
応番号5はこの例と同様に実験を行なった。
り測定したところ、15.7■(95μmol;95%
の転換率)のし−フェニルアラニンが生成していた。反
応番号5はこの例と同様に実験を行なった。
及近11艷土
フェニルピルビン酸ナトリウム20.4■(100μm
ol)、蟻酸アンモニウム50 mg(800,crm
oり、NAD”3.6rrw (5μmol)、トリス
−塩酸緩衝液(pH8,4)250、crmol %バ
シルス・バディウスIAM 11059のL−フヱニル
アラニン脱水素酵素0.5単位(硫安分画における30
〜60%飽和画分)、および粗蟻酸脱水素酵素0.5単
位(p)18.5、カンジダ・ポイディニm2201よ
り部分精製)を含む5mlの反応液を30℃において2
4時間保温した。微生物定量法により定量したところ1
5.7q (95μmol; 98%の転換率)のし−
フェニルアラニンが生成していた。
ol)、蟻酸アンモニウム50 mg(800,crm
oり、NAD”3.6rrw (5μmol)、トリス
−塩酸緩衝液(pH8,4)250、crmol %バ
シルス・バディウスIAM 11059のL−フヱニル
アラニン脱水素酵素0.5単位(硫安分画における30
〜60%飽和画分)、および粗蟻酸脱水素酵素0.5単
位(p)18.5、カンジダ・ポイディニm2201よ
り部分精製)を含む5mlの反応液を30℃において2
4時間保温した。微生物定量法により定量したところ1
5.7q (95μmol; 98%の転換率)のし−
フェニルアラニンが生成していた。
反応番号6,7.8は、この例と同様に実験を行なった
。
。
これらの結果を次の第2表に要約する。
以下余白
第1図は、本発明のフェニルアラニン脱水素酵素のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(A)及びSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動(B)の泳動図のスケッチで
ある。
アクリルアミドゲル電気泳動(A)及びSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動(B)の泳動図のスケッチで
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、次の性質: (1)1モルのL−フェニルアラニン、1モルのNAD
^+及び1モルの水から1モルのフェニルピルビン酸、
1モルのアンモニウムイオン及び1モルのNADHを生
成する反応、並びにこの逆反応を触媒する; (2)高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約360,000〜370,000の分子量を示し、S
DS−ポリアクリルアミドディスク電気泳動法において
約38,000〜39,000の分子量を有するサブユ
ニットを示す; (3)L−フェニルアラニンに特異的に作用し、そして
L−チロシン、L−トリプトファン及びL−メチオニン
に対する特異性が非常に低い;を有することを特徴とす
るL−フェニルアラニン脱水素酵素。 2、バシルス・バディウス(Bacillus bad
ius)(FERM P−8529)により生産される
特許請求の範囲第1項記載の酵素。 3、次の性質: (1)1モルのL−フェニルアラニン、1モルのNAD
^+及び1モルの水から1モルのフェニルピルビン酸、
1モルのアンモニウムイオン及び1モルのNADHを生
成する反応、並びにこの逆反応を触媒する; (2)高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約360,000〜370,000の分子量を示し、S
DS−ポリアクリルアミドディスク電気泳動法において
約38,000〜39,000の分子量を有するサブユ
ニットを示す; (3)L−フェニルアラニンに特異的に作用し、L−チ
ロシン、L−トリプトファン及びL−メチオニンに対す
る特異性が非常に低い; を有するL−フェニルアラニン脱水素酵素の製造方法に
おいて、該酵素を生産することができるバシルス(Ba
cillus)属微生物を培養し、この培養物から該酵
素を採取することを特徴とする方法。 4、前記バシルス属微生物がバシルス・バディウス(B
acillus badius)(FERM P−85
29)である特許請求の範囲第3項に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61172832A JPH0655137B2 (ja) | 1986-07-24 | 1986-07-24 | L−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61172832A JPH0655137B2 (ja) | 1986-07-24 | 1986-07-24 | L−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6332482A true JPS6332482A (ja) | 1988-02-12 |
JPH0655137B2 JPH0655137B2 (ja) | 1994-07-27 |
Family
ID=15949177
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61172832A Expired - Lifetime JPH0655137B2 (ja) | 1986-07-24 | 1986-07-24 | L−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0655137B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010067578A1 (ja) | 2008-12-09 | 2010-06-17 | 株式会社カネカ | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびl-アミノ酸、2-オキソ酸、又はd-アミノ酸の製造方法 |
WO2021070943A1 (ja) * | 2019-10-11 | 2021-04-15 | 味の素株式会社 | 改変フェニルアラニン脱水素酵素 |
-
1986
- 1986-07-24 JP JP61172832A patent/JPH0655137B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010067578A1 (ja) | 2008-12-09 | 2010-06-17 | 株式会社カネカ | 新規なアミノ酸脱水素酵素、およびl-アミノ酸、2-オキソ酸、又はd-アミノ酸の製造方法 |
US9267116B2 (en) | 2008-12-09 | 2016-02-23 | Kaneka Corporation | Amino acid dehydrogenase, and process for producing L-amino acid, 2-oxo acid or D-amino acid |
WO2021070943A1 (ja) * | 2019-10-11 | 2021-04-15 | 味の素株式会社 | 改変フェニルアラニン脱水素酵素 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0655137B2 (ja) | 1994-07-27 |
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