JPH0648981B2 - 新規なジヒドロ葉酸還元酵素及び改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、固定化酵素の製造に用
いられる新規な酵素及びそれを生産するための、改変さ
れた大腸菌由来の遺伝子に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、バイオテクノロジーの進展に伴
い、固定化酵素や固定化微生物を素子とするバイオリア
クターによる有用物質を生産するシステムは急速な発展
を遂げ、例えばアミノ酸、有機酸、核酸関連物質、糖
質、化学薬品、医薬品などの製造、あるいは食品の製造
・加工、アルコールやメタンなどのエネルギー物質の生
産、さらには分析・計測分野、医療分野、環境浄化分野
などにおいて利用されはじめている。

【０００３】このバイオリアクターは、酵素又微生物を
固定化し、その生体触媒としての反応特性を利用する化
学反応システムであって、従来の化学反応触媒を使用す
る反応に比べて、（１）常温、常圧の穏和な条件下で反
応が行われる、（２）反応特異性が高く、特定の物質し
か産生しない、（３）構造特異性や立体特異性の物質が
得られる、（４）省エネルギー性である、などの特徴を
有している。

【０００４】このようなバイオリアクターの素子として
用いられる固定化酵素を得るための酵素の固定化方法と
しては、従来担体結合法、架橋法及び包括法などが主に
用いられているが、これらの方法はそれぞれ長所及び短
所を有しており、必ずしも十分に満足しうる方法とはい
えない。

【０００５】例えば、前記担体結合法は、その結合様式
により、物理的吸着やイオン結合などによる非共有結合
型固定化法と化学的反応による共有結合型固定化法に大
別することができる。しかしながら、非共有結合型固定
化法は、担体と酵素タンパク質との結合力が弱いため
に、得られた固定化酵素の利用範囲が制限されるのを免
れないし、一方、共有結合型固定化法は、酵素タンパク
質のアミノ酸側鎖の化学的反応性を利用しているため、
結合については極めて安定であるものの、新たな化学結
合を形成させることにより、酵素タンパク質を失活させ
るおそれがある上、酵素タンパク質中には同種のアミノ
酸側鎖（例えば、リジンのアミノ基、アスパラギン酸及
びグルタミン酸のカルボキシル基など）があり、このも
のが固定化反応に関与するために、固定化部位を制御す
ることが極めて困難であるなどの欠点を有している。

【０００６】また、架橋法による固定化法においては、
前記の共有結合型固定化法と同様に架橋部位を制御する
ことは極めて困難であるという欠点がある。さらに、包
括法による固定化法は、このような欠点はないものの、
包括に用いられるゲルを作成するための条件が使用する
酵素タンパク質にとってか酷であるため、破壊されるお
それがある上、酵素の反応基質や生成物の包括ゲルへの
透過についても配慮しなければならない。

【０００７】他方、酵素タンパク質のカルボキシ末端側
に短いアミノ酸配列を導入しても、酵素の機能はほとん
ど影響を受けないことが知られている〔特開平１−１４
４９９２号公報、「メソッズ・イン・エンザイモロジー
（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第
１８５巻、第１２９ページ（１９９０年）〕。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、カルボキシ
末端側に固定用担体と容易に結合しうる残基を有する酵
素特にジヒドロ葉酸還元酵素及びそれを生産するように
改変された遺伝子を提供することを目的としてなされた
ものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、固定用担
体と容易に結合しうる残基を有する酵素について種々研
究を重ねた結果、この残基としてはシステイン残基が適
していること及びこのような酵素が大腸菌由来のジヒド
ロ葉酸還元酵素遺伝子の３′末端側を改変したものを用
いれば容易に生産しうることを見出し、この知見に基づ
いて本発明をなすに至った。

【００１０】すなわち、本発明は、式

【化３】 （式中のＡｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓ
ｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓは
システイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン
酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅは
イソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｍ
ｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏ
はプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔ
ｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバ
リンのアミノ酸単位を示し、またアミノ酸配列における
番号は、ジヒドロ葉酸還元酵素１番目のアミノ酸である
メチオニンから起算したものである）で示されるアミノ
酸配列を有する、カルボキシ末端にシステイン残基をも
つジヒドロ葉酸還元酵素及び大腸菌由来のジヒドロ葉酸
還元酵素遺伝子の３′末端側を改変することにより得ら
れ、式

【化４】 （式中のＡはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃ
はシトシンであり、塩基配列の番号はジヒドロ葉酸還元
酵素を暗号化するＤＮＡ配列中１番目のアミノ酸である
メチオニンのコードＡＴＧのＡを１番として数えたもの
である）で表わされるＤＮＡ配列を有する改変ジヒドロ
葉酸還元酵素遺伝子を提供するものである。

【００１１】本発明の改変ジヒドロ葉酸還元酵素は、そ
の酵素タンパク質のカルボキシ末端側にシステイン残基
をカルボキシ末端とする数個のアミノ酸残基から成るア
ミノ酸配列が導入されたものであり、その導入は、例え
ば遺伝子組換え法によって行うことができる。

【００１２】この遺伝子組換え法においては、所望の酵
素タンパク質を暗号化する遺伝子ＤＮＡを用いて、該酵
素タンパク質のカルボキシ末端部分を暗号化する配列部
分を化学合成ＤＮＡで置き換えることにより、カルボキ
シ末端がシステイン残基となるように短いアミノ酸配列
が導入された改変酵素タンパク質を暗号化する遺伝子Ｄ
ＮＡを作成したのち、これを発現用プラスミドなどのベ
クターに組込んで発現ベクターを構築し、次いで大腸菌
などの宿主に導入して発現させ、宿主菌体から改変酵素
タンパク質を分離精製することにより、目的の改変酵素
タンパク質を作成することができる。

【００１３】このようにして得た酵素は、前記化３で示
されるアミノ酸配列を有する１６５個のアミノ酸残基か
ら成る酵素タンパク質であり、補酵素ＮＡＤＰＨ存在下
にジヒドロ葉酸を還元してテトラヒドロ葉酸を生成する
反応を触媒する。野生型のジヒドロ葉酸還元酵素は１５
９個のアミノ酸残基から成り、１５２番目のアミノ酸残
基がシステイン残基であることを除けば上記配列の１か
ら１５９番目までの配列と全く同一の配列である。

【００１４】本発明の改変ジヒドロ葉酸還元酵素中に
は、２個のシステイン残基が存在するが（８５番目と１
６５番目）、そのメルカプト基の反応性は全く異なって
おり、中性（ｐＨ７．０）、室温（１５〜３０℃）で
の、５，５′‐ジチオビス（２‐ニトロ安息香酸）を用
いたチオール‐ジスルフィド交換反応では、８５番目の
システイン残基では全く反応しないのに対して、１６５
番目のシステイン残基では迅速に反応し約数分でその反
応を完結する。また、野生型ジヒドロ葉酸還元酵素中に
も、２個のシステイン残基が存在するが（８５番目と１
５２番目）、そのメルカプト基の反応性は低く、同様な
反応条件で８５番目のシステイン残基では全く不活性で
あり、１５２番目のシステイン残基における反応性は、
改変ジヒドロ葉酸還元酵素１６５番目のシステイン残基
における反応性の数分の１である。

【００１５】次に、この改変ジヒドロ葉酸還元酵素を発
現するための遺伝子としては、大腸菌由来のものが用い
られる。この大腸菌由来の遺伝子は、本発明者らによ
り、すでにクローンニングが行われており、また、ジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子ＤＮＡが組込まれた発現ベクタ
ーも作成されている（特公平１−４８７５６号公報）。
さらにこれを改変したジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子ＤＮ
Ａが組込まれた発現ベクターも作成されている（特開昭
６３−２６７２７６号公報、特開平１−２５２２８９号
公報）。したがって、これらの公知の技術を利用するこ
とにより、大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子か
らカルボキシ末端がシステイン残基である改変ジヒドロ
葉酸還元酵素を暗号化する改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子ＤＮＡが組込まれた発現ベクターを容易に構築する
ことができる。

【００１６】本発明の改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
は前記化４で示されるＤＮＡ配列を有しているが、この
配列の末端は、制限酵素ＢｇＩＩＩの認識切断部位を有
し、任意のベクターに組み込むことが可能である。改変
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む発現プラスミドｐＣ
ＹＳ１は、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌体中に安定に保持され、ｐＣ
ＹＳ１を含有するＥ．Ｃｏｌｉは、微工研にＦＥＲＭ
ＢＰ‐３６００として寄託されている。そして、このプ
ラスミドを用いることにより、次のようにして、前記し
た改変ジヒドロ葉酸還元酵素が容易に得ることができ
る。

【００１７】一般に、形質転換された微生物に、外来タ
ンパク質遺伝子を効率よく発現させ、目的とするタンパ
ク質を量産させるには、該外来タンパク質遺伝子の転写
効率や翻訳効率を高めたり、該外来タンパク質遺伝子の
コピー数を多くすることが必要である。そして該外来遺
伝子の転写効率を高めるために、一般に外来タンパク質
遺伝子の上流に強力なプロモーターを結合させることが
行われている。したがって、前記発現ベクターは、改変
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子ＤＮＡの上流に適当なプロ
モーターを結合したものが好ましい。また、この発現ベ
クターは、宿主微生物に導入するが、この発現ベクター
が導入された微生物の選択は、通常該ベクターの薬剤耐
性マーカーに基づく選択培地で該微生物を培養して生育
する微生物を選ぶことにより行われるので、該発現ベク
ターには薬剤耐性遺伝子ＤＮＡも組込まれているのが望
ましい。

【００１８】次に、このようにして得られた発現ベクタ
ーは、大腸菌などの宿主微生物に公知の方法によって導
入し、宿主微生物を形質転換させて、所望の改変ジヒド
ロ葉酸還元酵素を産生する形質転換微生物を作出する。
宿主微生物の発現ベクター導入の有無についての選択
は、前記したように、ベクターの薬剤耐性マーカーに基
づく選択培地で微生物を培養して生育する微生物を選択
すればよい。

【００１９】この形質転換微生物の作出は、例えば化学
合成法により得られた２本の２３ヌクレオチド5′-GATC
CTGGGTGGCTGTTAAC-3′及び5′-TCGACTTAACAGCCACCGAC-
3′（ただし、式中のＡ、Ｔ、Ｇ及びＣは前記と同じ意
味をもつ）から成るＤＮＡをアニールさせ、一方プラス
ミドｐＭＥＫ２（特開平１−２５２２８９号公報参照、
ジヒドロ葉酸還元酵素‐メチオニンエンケファリン融合
タンパク質を暗号化する遺伝子ＤＮＡ、プロモーター、
トリメトプリム耐性及びアンピシリン耐性遺伝子ＤＮＡ
などを含有）に適当な制限酵素を作用させて切断し、Ｄ
ＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片と前記のアニールさせた
化学合成ＤＮＡとをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ
せたのち、これを形質転換法に従ってエシエリヒア・コ
リ（以下Ｅ．Ｃｏｌｉと略記する）に導入し、次いでア
ンピシリンナトリウム及びトリメトプリムを含む栄養寒
天培地を用いて、形質転換株を選択した。

【００２０】このようにして作出された形質転換株はカ
ルボキシ末端がシステイン残基である改変ジヒドロ葉酸
還元酵素を大量に産生することを確認するとともに、こ
の形質転換株から公知の方法により、図１に示す制限酵
素切断地図を有するプラスミドｐＣＹＳ１を調製する。

【００２１】このｐＣＹＳ１は、プラスミドｐＭＥＫ２
（特開平１−２５２２８９号公報）のＢａｍＨＩとＸｈ
ｏＩ部位の間の配列を、前記した二本鎖ＤＮＡで置き換
えることにより作出される。このｐＣＹＳ１は４６３７
塩基対から成り、宿主にアンピシリン耐性及びトリメト
プリム耐性を付与する。図１の制限酵素切断地図に、そ
れぞれの遺伝子の位置が示されており、図中Ａｍｐで示
したのがアンピシリン耐性遺伝子の位置であり、ＤＨＦ
Ｒで示した部位がトリメトプリム耐性を与えるジヒドロ
葉酸還元酵素の遺伝子の部位である。前記のＢｇＩＩＩ
部位にはさまれた改変ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子部位
は、図中では黒く塗りつぶした矢印で表わされている。
ｏｒｉはプラスミドの複製に必要な部位、ｐは改変ジヒ
ドロ葉酸還元酵素遺伝子の高効率発現に必要なプロモー
ターの位置を示している。

【００２２】このプラスミドｐＣＹＳ１の制限酵素Ｂｇ
ＩＩＩによる切断によって得られる約７００ヌクレオチ
ド長のＤＮＡについて、公知の方法により塩基配列を決
定し、目的の化学合成ＤＮＡが正しく組込まれているこ
とを確認し、さらにこの決定したＤＮＡの塩基配列か
ら、改変ジヒドロ葉酸還元酵素のアミノ酸配列を決定し
た。

【００２３】次に発現プラスミドベクターｐＣＹＳ１が
導入された形質転換Ｅ．Ｃｏｌｉ（微工研菌寄ＦＥＲＭ
ＢＰ‐３６００）の培養は、該Ｅ．Ｃｏｌｉの生育に
必要な炭素源や窒素源などの栄養源及び無機成分などを
含む培地中において行うことができる。

【００２４】該炭素源としては、例えばグルコース、デ
ンプン、ショ糖、モラッセ、デキストリンなどが、窒素
源としては、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン加水
分解物、コーンスチープリカー、硝酸塩、アンモニウム
塩などが、無機成分としては、例えばナトリウム、カリ
ウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、亜鉛、マ
ンガン、鉄などの陽イオンや塩素、硫酸、リン酸などの
陰イオンを含む塩が挙げられる。

【００２５】培養の形態は液体培養が好ましく、工業的
には深部通気かくはん培養を行うのが有利である。培養
温度はＥ．Ｃｏｌｉが生育し、改変ジヒドロ葉酸還元酵
素が生産される範囲で適宜選ばれるが、通常２０〜４０
℃の範囲の温度で選ばれる。培養時間は条件により左右
されるが、酵素が最高収量に達する時間を見計らって適
当な時期に培養を終了すればよい。

【００２６】このようにして得られた培養物は、ろ過又
は遠心分離などの手段により菌体を回収し、次いでこの
菌体をボールミルや超音波による機械的破砕方法やリゾ
チームなどの酵素的破砕方法で破砕し、必要に応じてキ
レート剤や界面活性剤を添加して改変ジヒドロ葉酸還元
酵素を可溶化して分離採取し、精製すればよい。精製方
法については、例えば改変ジヒドロ葉酸還元酵素含有溶
液を減圧濃縮、膜濃縮、硫安や硫酸ナトリウムなどでの
塩析処理、メタノールやエタノール、アセトンなどの親
水性有機溶媒での分別沈殿などの手段を適宜選択し、組
み合わせて沈殿を得たのち、さらにこの改変ジヒドロ葉
酸還元酵素を含有する沈殿物を、必要に応じて、水又は
緩衝液に溶解し、透析膜にて透析して、より低分子量の
不純物を除去してもよく、また、吸着剤やゲルろ過剤な
どによるイオン交換クロマトグラフィー、サイズ分離ゲ
ルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどにより精
製してもよい。これらの精製方法は１種用いてもよい
し、２種以上を組み合わせて用いてもよく、あるいは１
種以上の精製方法を繰り返して用いてもよい。

【００２７】本発明のジヒドロ葉酸還元酵素は、そのカ
ルボキシ末端のシステイン残基のメルカプト基の反応を
利用して、固定化担体に該酵素タンパク質を結合させ固
定化させることができる。このシステイン残基のメルカ
プト基は、穏和な条件で特異的に共有結合を作ることが
できる〔「生物化学実験法８、ＳＨ基の化学修飾」学会
出版センター刊行（１９７８年）〕。特にチオール‐ジ
スルフィド交換反応は、システイン残基に特有のもので
あり、他のアミノ酸側鎖では起こらない。また、メルカ
プト基は、金属イオン（特に、水銀イオン）と結合して
メルカプチドを生成するし、ハロゲン化アルキルを含む
化合物は、メルカプト基を穏和な条件でアルキル化す
る。さらに、Ｎ‐エチルマレイミドなどを代表とする容
易に分極可能な二重結合をもつ化合物と付加化合物を形
成する。このような反応は、ｐＨなどの条件を適当に選
択することによりメルカプト基に対して特異的にひき起
こすことができる。これらの反応を利用して、酵素タン
パク質のカルボキシ末端に導入されたシステイン残基の
メルカプト基のみを共有結合を介して固定化担体に結合
させることができる。なお、この際使用する固定化担体
については、システイン残基のメルカプト基と特異的に
反応する官能基を有する担体であればよく特に制限はな
いが、例えば市販のチオプロピルセファローズ６Ｂなど
を用いることができる。

【００２８】このチオプロピルセファローズ６Ｂは、改
変ジヒドロ葉酸還元酵素と中性条件で混合するのみで、
チオプロピルセファローズ６Ｂ１ｇ当り、改変ジヒドロ
葉酸還元酵素約０．３ｍｇを固定化することができる。

【００２９】このようにして固定化された改変ジヒドロ
葉酸還元酵素は活性であり、ガラスカラムに充填して酵
素反応器として用いたところ、４℃で流速１０ｍｌ／分
という高流速条件でも、約５００ｍｇの少量の固定化ゲ
ルを用いるだけで酵素反応をほぼ完全に完了させること
ができ、その有効性を確認することができた。

【００３０】固定化した改変ジヒドロ葉酸還元酵素の酵
素活性は、反応液〔０．０５ｍＭのジヒドロ葉酸、０．
０６ｍＭのＮＡＤＰＨ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）〕をペリスタポンプを用いてガラスカラムに充
填して酵素反応器に連続的に送り込み、適当な時間後に
溶出した溶液を分取し、その溶液の３４０ｎｍの吸光度
を測定し、カラムに通す前の溶液の３４０ｎｍの吸光度
との差を算出することにより求める。この際、過剰量の
ジヒドロ葉酸還元酵素を用いて反応させたときの３４０
ｎｍの吸光度の全変化を１００％の転換効率として用い
る。

【００３１】このような固定化方法を用いることによ
り、固定化担体と結合する部位としては酵素タンパク質
のカルボキシ末端だけに限定することが可能となり、こ
のことにより、従来の固定化方法で障害となっていた固
定化反応による酵素それ自体の活性の低下及び固定化さ
れた酵素の不均一性などを解消することができる。

【００３２】

【実施例】次に、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。

【００３３】実施例１ ホスホアミダイト法により化学合成された２本の２３ヌ
クレオチドすなわち5′-GATCCTGGGTGGCGGCTGTTAAC-3′
及び5′-TCGACTTAACAGCCGCCACCGAC-3′からなるＤＮＡ
それぞれを、約０．１ｍｌ（約０．０１μｇのＤＮＡを
含んでいる）ずつ採り、これを６０℃でインキュベート
することによって両ＤＮＡをアニールさせた（これをＤ
ＮＡ１と呼ぶ）。

【００３４】ｐＭＥＫ２（特開平１−２５２２８９号公
報）約１μｇを、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩを用いて切断し
たのち、その後エタノールでＤＮＡを沈殿させた。沈殿
したＤＮＡを７０ｗｔ％エタノールで洗ったのち、エタ
ノールを除き、減圧下に沈殿を乾燥させた。制限酵素に
よるＤＮＡの切断などの組換えＤＮＡに係わる各操作
は、いずれも、マニアティスらの方法〔「モレキュラル
・クローニング・エイ・ラボラトリー・マニュアル、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８
２年）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌ
ｏｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９
８２年）」〕に従って行った。切断したｐＭＥＫ２断片
とＤＮＡ１をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合し、形質
転換法に従って、大腸菌に取り込ませた。形質転換株
を、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウム及び１０
ｍｇ／ｍｌのトリメトプリムを含む栄養寒天培地（培地
１１中に、２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウ
ム、５ｇのイーストエキス、５ｇのポリペプトン、１５
ｇの寒天を含む）を用いて、アンピシリン耐性及びトリ
メトプリム耐性で選択した。さらに、得られた形質転換
株を培養し、その菌体が作る全タンパク質をＳＤＳ‐ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法〔「ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）」第２２７巻、第６８０ページ（１９７０
年）〕に従って分析した。分子量マーカーとしてラクト
アルブミン（分子量１４，２００）、トリプシンインヒ
ビター（分子量２０，１００）、トリプシノーゲン（分
子量２４，０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（分
子量２９，０００）、グリセロアルデヒド３‐リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（分子量３６，０００）、卵アルブミン
（分子量４５，０００）及び牛血清アルブミン（分子量
６６，０００）を含むサンプルをポリアクリルアミド濃
度の１０から２０％濃度勾配ゲルで泳動した。その結
果、改変ジヒドロ葉酸還元酵素を大量に発現する菌体が
約８０％の頻度で得られた。

【００３５】この菌体から、田中らの方法〔「ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ）」第１２１巻、第３５４ページ（１９７５
年）〕に従って、プラスミドを調製し、ｐＣＹＳ１と名
づけた。このｐＣＹＳ１のＢｇｌＩＩによる切断によっ
て得られる約７００ヌクレオチド長のＤＮＡについて、
Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ法〔「メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー（Ｍｅｈｔｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）」第１０１巻、第２０ページ（１９８
３年）〕に従って塩基配列を決定し、目的の化学合成Ｄ
ＮＡが正しく組み込まれていることを確認した。また、
決定したＤＮＡ配列から、改変ジヒドロ葉酸還元酵素の
アミノ酸配列を決定した。

【００３６】実施例２ （１）菌体の培養 ｐＣＹＳ１を含有する大腸菌の培養は、６リットルのＹ
Ｔ＋Ａｐ培地（培地１リットル中に、５ｇのＮａＣｌ、
８ｇのトリプトン、５ｇのイーストエキス及び５０ｍｇ
のアンピシリンナトリウムを含む液体培地）で、３７℃
で対数成長期の後期で培養した。培養した菌体は、５，
０００回転／分の遠心分離により集め、培地６リットル
より湿重量約１７ｇの菌体が得らた。

【００３７】（２）菌体の破砕 培養して得られた菌体を、湿重量の２倍の緩衝液１
〔０．１ｍＭ エチレンジアミン４酢酸ナトリウム（Ｅ
ＤＴＡ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ
７．０〕に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕
した。菌体破砕液を５，０００回転、１０分間遠心分離
し、上清を得た。さらに、上清を、３５，０００回転、
１時間超遠心分離し、上清を得る（無細胞抽出液）。

【００３８】（３）ＤＥＡＥ‐トヨパールカラム処理 この操作は、次のＭＴＸ結合アフィニティクロマトグラ
フィーによる精製工程の前処理の目的で行った。無細胞
抽出液を、あらかじめ０．１ＭのＫＣｌを含む緩衝液１
で平衡化したＤＥＡＥトヨパールカラムにかけ、０．１
ＭのＫＣｌを含む緩衝液１でカラムを洗い、酵素の溶出
は、０．３ＭのＫＣｌを含む緩衝液１を用いて行った。
溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画し、分画した溶出液についてＤＨＦＲ活性を測定して
酵素活性が含まれる画分を集めた。

【００３９】（４）ＭＴＸ結合アフィニティクロマトグ
ラフィー 上記の操作により得られた酵素液を、あらかじめ緩衝液
１で平衡化したＭＴＸ結合セファローズアフィニティカ
ラムに吸着させた。吸着後、１ＭのＫＣｌを含む緩衝液
２（０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液、ｐＨ８．５）で洗浄した。洗浄は、カラムか
らの溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度が
０．１以下になるまで同緩衝液を流し続けた。酵素の溶
出は、１ＭのＫＣｌと３ｍＭの葉酸を含む緩衝液２を用
いて行い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクター
を用いて分画した。分画した溶出液についてＤＨＦＲ活
性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集めた。得られ
た酵素液を、緩衝液１に対して、３回透析した。

【００４０】（５）ＤＥＡＥ‐トヨパールカラムクロマ
トグラフィー 透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液１で平衡化したＤ
ＥＡＥ‐トヨパールカラムに吸着させたのち、０．１Ｍ
のＫＣｌを含む緩衝液１で洗浄した。洗浄は、カラムか
らの溶出液の２８０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度が
０．０１以下になるまで同緩衝液を流し続けた。酵素の
溶出は、緩衝液１を用いて０．１Ｍから０．３ＭのＫＣ
ｌの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量ずつフ
ラクションコレクターを用いて分画した。分画した溶出
液について２８０ｎｍの吸光度とジヒドロ葉酸還元酵素
とを測定した。酵素活性／２８０ｎｍの吸光度の値が、
一定な画分を集めた。

【００４１】以上の操作により、ジヒドロ葉酸還元酵素
の高度精製均一化を、再現性良く行うことができた。精
製の際の酵素活性は、反応液〔０．０５ｍＭのジヒドロ
葉酸、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ、１２ｍＭの２‐メル
カプトエタノール、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）〕を、１ｍｌのキュベットとり、これに酵素液を加
え、３４０ｎｍの吸光度の時間変化を測定することによ
り行った。酵素１ユニットは、上記反応条件において、
１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するのに
必要な酵素量として定義した。

【００４２】以上の結果を表１に示す。湿重量約１７ｇ
の菌体から、約１３０ｍｇの均一に精製された改変ジヒ
ドロ葉酸還元酵素が得られた。なお表１における精製工
程は、無細胞抽出液、ＤＥＡＥ‐トヨパールカラム
処理、ＭＴＸ結合アフィニティクロマトグラフィー及
びＤＥＡＥ‐トヨパールカラムクロマトグラフィーを
表わす。

【００４３】

【表１】

【００４４】参考例１ 改変ジヒドロ葉酸還元酵素中における、システイン残基
のメルカプト基の反応性を５，５′‐ジチオビス（２‐
ニトロ安息香酸）を用いて測定した。

【００４５】緩衝液として、２．５ｍＭのＥＤＴＡを含
む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用い
た。タンパク質の濃度は０．７ｍｇ／ｍｌであり、ま
た、５，５′‐ジチオビス（２‐ニトロ安息香酸）は２
ｍＭの濃度、反応の温度は１５℃であった。反応は５，
５′‐ジチオビス（２‐ニトロ安息香酸）を添加するこ
とにより開始し、反応に伴い遊離する５‐チオ‐２‐ニ
トロフェノールの４１２ｎｍの吸光度の増加で測定し
た。その結果を図２に示す。

【００４６】図２において、（１）はタンパク質として
本発明の改変ジヒドロ葉酸還元酵素〔２個のシステイン
残基（８５番目と１６５番目）を有する〕を用いた場
合、（２）はタンパク質として野生型ジヒドロ葉酸還元
酵素〔２個のシステイン残基（８５番目と１５２番目）
を有する〕を用いた場合、及び（３）はジヒドロ葉酸還
元酵素変異体〔ＤＨＦＲ（Ｃ１５２Ｅ）‐ＩＱＩ、特開
昭６３−２６７２７６号公報、１個のシステイン残基
（８５番目）を有する〕を用いた場合を示す。

【００４７】この図２から、本発明におけるジヒドロ葉
酸還元酵素の反応性が著しく高いこと〔曲線（１）〕、
８５番目のシステイン残基はこの条件では全く反応しな
いこと〔曲線（３）〕、野生型ジヒドロ葉酸還元酵素中
の１５２番目のシステインの反応性が改変酵素タンパク
質中のカルボキシ末端のシステインの反応性に比べて数
分の１以下であること〔曲線（２）〕が容易に分かる。
このように、カルボキシ末端がシステイン残基である数
個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を導入したこと
により、反応性の高いメルカプト基が得られた。

【００４８】参考例２ 固定化担体として、ファルマシア社より市販されている
チオプロピルセファローズ６Ｂを用いた。乾燥重量が２
８ｍｇ、５２ｍｇ、１０８ｍｇのそれぞれのゲルに、
０．３５ｍｇ／ｍｌの改変ジヒドロ葉酸還元酵素２ｍｌ
（２．５ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液、ｐＨ８．０、の溶液）を加え、室温で２時間放
置し、上清中の酵素活性を測定し、その減少量から固定
化された改変ジヒドロ葉酸還元酵素量を求めたところ、
チオプロピルセファローズ６Ｂゲル１ｇ当り酵素タンパ
ク質約０．３ｍｇが結合することが判明した。次に、チ
オプロピルセファローズ６Ｂ１０ｇに改変ジヒドロ葉酸
還元酵素１００ｍｌを加え、室温で一晩反応させ、その
後ガラスフィルターを用いてゲルを分離後、２．５ｍＭ
のＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）で洗浄し、次の実験に用いた。

【００４９】参考例３ 参考例２で得られた固定化ゲルをガラスカラム（直径約
１．５ｃｍ）に種々の量を詰め、これにペリスタポンプ
を用いて種々の流速で完全に脱気した活性測定液〔０．
０５ｍＭのジヒドロ葉酸、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ、
１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）〕を流し、流出液の３４０ｎｍの吸光度を測定し、
カラム通過後の吸光度の減少量を求めた。この値を利用
して酵素反応の程度（転換率％）を算出した。なお、酵
素反応は、４℃で行った。

【００５０】図３は、流速１０ｍｌ／ｍｉｎという非常
に速い流速を用いて固定化酵素ゲルの量を変化させたと
きの、反応効率を示す。乾燥ゲル換算約０．５ｇ以上で
はほとんど１００％の効率で酵素反応が進み、非常に少
量のゲルでバイオリアクターが構成できることを示して
いる。また、それ以下では、ゲルの量に依存して反応効
率が変化し、酵素量が律速であることを示している。

【００５１】図４は、乾燥ゲル換算８０ｍｇという非常
に少量の固定化酵素ゲルを用いて流速を変化させたとき
の反応効率を示す。流速の増大に伴って反応効率が低下
した。

【００５２】以上の結果から、極少量の固定化酵素ゲル
を用い、１０ｍｌ／ｍｉｎという高流速で、かつ４℃と
いう低温でも、非常に高い効率で固定化された改変ジヒ
ドロ葉酸還元酵素が働くことが分る。

【００５３】

【発明の効果】本発明の共有結合型担体結合法による
と、酵素タンパク質の失活を抑え、かつ固定化部位を容
易に制御しうるので、均質で活性の高い固定化酵素を効
率よく製造することができる。

【００５４】例えば、これまでジヒドロ葉酸還元酵素
は、制がん剤のロイコポリンを製造するために用いられ
ているが、これを固定することができないため、工業的
に実施することは困難であった。本発明の改変ジヒドロ
葉酸還元酵素は、容易に担体に固定しうるので、工業上
大きな意義を有している。

【００５５】本発明方法で得られた固定化酵素は、各種
有用物質の生産に利用されるバイオリアクターの素子と
して好適に用いられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドｐＣＹＳ１の制限酵素切断地図。

【図２】 各種酵素におけるシステイン残基のメルカプ
ト基の反応性を示すグラフ。

【図３】 固定化された改変ジヒドロ葉酸還元酵素によ
るジヒドロ葉酸還元反応における反応効率のゲル依存性
を示すグラフ。

【図４】 固定化された改変ジヒドロ葉酸還元酵素によ
るジヒドロ葉酸還元反応における反応効率の流速依存性
を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式 【化１】 （式中のＡｌａはアラニン、Ａｒｇはアルギニン、Ａｓ
   ｎはアスパラギン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ｃｙｓは
   システイン、Ｇｌｎはグルタミン、Ｇｌｕはグルタミン
   酸、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｉｌｅは
   イソロイシン、Ｌｅｕはロイシン、Ｌｙｓはリジン、Ｍ
   ｅｔはメチオニン、Ｐｈｅはフェニルアラニン、Ｐｒｏ
   はプロリン、Ｓｅｒはセリン、Ｔｈｒはスレオニン、Ｔ
   ｒｐはトリプトファン、Ｔｙｒはチロシン、Ｖａｌはバ
   リンのアミノ酸単位を示し、またアミノ酸配列における
   番号は、ジヒドロ葉酸還元酵素１番目のアミノ酸である
   メチオニンから起算したものである）で示されるアミノ
   酸配列を有する、カルボキシ末端にシステイン残基をも
   つジヒドロ葉酸還元酵素。
2. 【請求項２】 大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
   子の３′末端側を改変することにより得られ、式 【化２】 （式中のＡはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグアニン、Ｃ
   はシトシンであり、塩基配列の番号はジヒドロ葉酸還元
   酵素を暗号化するＤＮＡ配列中１番目のアミノ酸である
   メチオニンのコードＡＴＧのＡを１番として数えたもの
   である）で表わされるＤＮＡ配列を有する改変ジヒドロ
   葉酸還元酵素遺伝子。