CN116676290A - 酯酶GsEst突变体、工程菌及在制备（S）-3-环己烯-1-甲酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酯酶GsEst突变体、基因、工程菌及在制备S‑3‑环己烯‑1‑甲酸中的应用，本发明提供的酯酶GsEst突变体具有较高的催化活力，使得反应条件温和，生产成本降低且对环境友好。200g/L的外消旋3‑环己烯‑1‑甲酸甲酯在10g/L的酯酶GsEst突变体催化下，2h内S‑3‑环己烯‑1‑甲酸转化率>49.9％，明显优于现有报道的酯酶。
Description
(一)技术领域
本发明属于生物制药和生物转化领域，具体涉及一种高活力酯酶GsEst突变体及其编码基因，含有该编码基因的质粒及重组菌，以及该酯酶突变体在催化3-环己烯-1-甲酸甲酯制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
(二)背景技术
酯酶(Esterases，EC3.1.1.X)是一类催化酯键(羧酯键、酰胺键、硫酯键等)水解和合成的酶的总称，主要包括羧酸酯酶(carboxylesterases，EC3.1.1.1)和脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)。作为一类工业常用的生物催化剂，羧酸酯酶和脂肪酶具有其明显的优势，如区域的立体选择性强，专一性高；有机溶剂耐受性和稳定性好；不需要辅酶和辅因子参与反应；反应条件温和，操作简便；底物谱广；环境污染少等。羧酸酯酶和脂肪酶的最显著的区别在于催化的底物不同，脂肪酶主要催化长链脂肪酸(C>8)，羧酸酯酶主要催化短链酯类(C<8)。同时，脂肪酶会表现出界面活化现象，脂肪酶只有在较低的底物浓度下才能观察到高活性，而羧酸酯酶遵循经典的Michaelis-Menten动力学。
(S)-3-环己烯-1-甲酸是凝血因子Xa抑制剂依度沙班(edoxaban，商品名：Savaysa)合成的重要手性中间体。依度沙班与同类型凝血因子Xa抑制剂药物如阿哌沙班、利伐沙班相比，具有出血风险小、肾脏负担小、使用安全等突出优点，市场前景广阔。而(S)-3-环己烯-1-甲酸作为该药物的关键中间体，其高效制备技术成为研究热点。目前工业上采用非对映异构体拆分技术制备(S)-3-环己烯-1-甲酸，以手性苯乙胺作为手性拆分剂，将外消旋3-环己烯-1-甲酸与苯乙胺形成的非对映体异构体，基于这对非对映体异构体在丙酮中溶解度的差异来进行分离。经缓慢冷却重结晶6次后，最终R-3-环己烯-1-甲酸的得率为28.3％，(S)-3-环己烯-1-甲酸的得率为28.7％，两者的光学纯度均大于99％。但是该技术手性拆分剂价格昂贵，用量大，且操作复杂，收率较低，不符合绿色化学的要求，开发绿色高效的(S)-3-环己烯-1-甲酸制备技术成为依度沙班合成的重要研究领域。
采用酯酶催化外消旋环己烯-1-甲酸甲酯不对称拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸具有专一性高、反应条件温和、反应速度快、环境友好等优点，是生物法合成手性3-环己烯-1-甲酸的重要方法。商品化的猪肝酯酶可催化水解(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯制备手性3-环己烯-1-甲酸，(S)-构型的羧酸转化率为49％，e.e.>99％，但底物浓度较低。王舰等利用含酯酶的Acinetobacter sp 192全细胞作为催化剂，催化40g/L外消旋环己烯-1-甲酸甲酯的不对称拆分，反应5h，产物R-3-环己烯-1-甲酸的e.e.值为75％，收率为40.7％。Wu等对来源于大肠杆菌的羧酸酯酶BioH进行分子改造，通过调整活性口袋的空间位阻作用、酶和底物间的芳香环作用以及氢键作用来调整其对映体选择性，显著提高酶的立体选择性，催化拆分制备S-3-环己烯-1-甲酸的产物e.e.值提升至79.9％。倪晔等利用来源于不动杆菌的酯酶，催化外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯的不对称拆分，底物浓度100-500mM(14-70g/L)，产物(S)-3-环己烯-1-甲酸产率>40％，e.e.值>99％。
但以上催化剂大多为商品酶、底物耐受性差、产物浓度或者选择性不够高。因此，开发具有高活力、高专一性酯酶，用于催化制备(S)-3-环己烯-1-甲酸技术具有重要的研究价值与应用前景。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种高活力酯酶GsEst突变体、编码基因、含有该编码基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及在制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。本发明提供的酯酶GsEst突变体具有较高的催化活力，使得反应条件温和，底物完全转化，生产成本降低且对环境友好。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种酯酶GsEst突变体，能够以3-环己烯-1-羧酸甲酯为底物，在适合的条件下将其不对称拆分合成(S)-3-环己烯-1-甲酸，所述酯酶GsEst突变体是将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列第94位、第95位、第122位、第137位、第195位、第196位或第223位进行单突变或组合突变获得的。
进一步，优选所述酯酶GsEst突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第122位赖氨酸位突变为丙氨酸；(2)第137位谷氨酸突变为异亮氨酸；(3)第195位甲硫氨酸突变为丝氨酸。(4)第122位赖氨酸位突变为丙氨酸同时第137位谷氨酸突变为异亮氨酸；(5)第122位赖氨酸位突变为丙氨酸同时第195位甲硫氨酸突变为丝氨酸；(6)第137位谷氨酸突变为异亮氨酸同时第195位甲硫氨酸突变为丝氨酸。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有本发明所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
本发明提供一种所述酯酶GsEst突变体的编码基因。
由于核苷酸序列的特殊性，任何本发明所示多核苷酸的变体，只要其与前述多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
本发明还提供一种所述含酯酶GsEst突变体编码基因的重组载体以及构建的工程菌，所述表达载体为pET28a(+)，工程菌宿主为E.coli BL21(DE3)。
本发明所述酯酶GsEst突变体是通过对野生型酯酶GsEst进行单个氨基酸的突变，提高其对外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的催化活力。首先将野生型酯酶GsEst编码基因(SEQID NO.1)与表达载体pET28a(+)连接，构建重组表达质粒。然后将重组表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)中。以含有酯酶基因的重组表达质粒为模板，通过定点突变技术进行基因改造，然后将重组表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)中得到含有酯酶GsEst突变体基因的E.coli BL21(DE3)基因工程菌。对获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组酯酶突变体的菌体细胞，菌体分离得到酯酶突变体粗酶液。将突变体酯酶与野生酯酶进行催化活力的比较，筛选得到催化性能优异的突变体。
本发明涉及所述酯酶GsEst突变体在拆分3-环己烯-1-甲酸甲酯制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用，具体所述应用为：以含酯酶GsEst突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的粗酶液或纯化后的纯酶液为催化剂，以3-环己烯-1-甲酸甲酯为底物，以pH值为6-9(优选7)的磷酸钾缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在20-40℃(优选30℃)，600rpm条件下反应，反应完全，将反应液分离纯化，获得S-3-环己烯-1-甲酸。所述催化剂用量以湿菌体重量计为20-200g/L(优选20g/L)，以粗酶液或纯酶液中蛋白含量计为10-30mg/L，优选20mg/L；所述底物的初始浓度为10-700g/L(优选200g/L)。
本发明所述含酯酶GsEst突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体按如下方法制备：将含有酯酶GsEst突变体编码基因的工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，180rpm下培养10h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
本发明所述粗酶液的制备方法：将酯酶GsEst突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体按照0.4g湿菌体加9.6mL 100mM、pH7.0的磷酸钾缓冲溶液重悬湿菌体，冰浴条件下进行超声破碎(20W，持续2s，间歇4s，连续破碎15min)，获得细胞破碎液。将超声破碎后获得的细胞破碎液于8000rpm、4℃离心10min，所得到的上清即为所需的粗酶液。
所述纯酶液按如下方法制备：将粗酶液与经结合缓冲液(50mM，pH7.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl)平衡过的Ni2+亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲液(50mM，pH 7.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl，50mM咪唑)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM，pH7.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl，500mM咪唑)洗脱并收集目的蛋白，以透析缓冲液(20mM，pH 7.0磷酸钠缓冲液)透析(10kDa分子量截留)24h，取截留液，即为纯酶液。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明提供了一系列对外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯具有高催化活力，高立体选择性的酯酶GsEst突变体，所得酯酶GsEst突变体用于催化拆分生产S-3-环己烯-1-甲酸具有反应条件温和、底物浓度高、立体选择性高、反应时间短、催化剂易得、催化剂用量少、催化剂处理步骤简化、对环境友好的优点。200g/L的外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯在10g/L的酯酶GsEst突变体(湿菌体)催化下，2h内其转化率>49％，ee值达99％，明显优于现有报道的酯酶；其中突变体GsEst-K122A、GsEst-K122A/E137I在2h内其转化率达到49.9％，ee值达99％。
(四)附图说明
图1为酯酶的SDS-PAGE图：泳道3为蛋白质分子量Marker，泳道1为E.coli BL21(DE3)/GsEst发酵制备的粗酶液，泳道2为E.coli BL21(DE3)/GsEst发酵制备的破碎沉淀。
图2为(S)-3-环己烯-1-甲酸不对称合成示意图。
图3为产物S/R-3-环己烯-1-甲酸GC检测示意图；A代表不添加酯酶反应两小时的反应液体，B代表添加GsEst-K122A/E137I反应两小时的反应液体。
图4为酯酶GsEst及突变体转化率示意图。
图5为酯酶GsEst及突变体e.e.p值示意图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。
实施例1：野生型酯酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)/GsEst的构建
将基因库中来源于Geobacillus stearothermophilus酯酶GsEst的基因序列经密码子优化后，通过全基因合成(核苷酸序列如SEQ ID NO.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2)后转入载体pET28a(+)的NcoI，XhoI位点之间，获得pET28a(+)-GsEst质粒，将该质粒化转到E.coli BL21(DE3)中获得野生型E.coli BL21(DE3)/GsEst，记为GsEst。
SEQ ID NO.1
ATGATGAAAATCGTCCCACCAAAACCGTTCTTTTTCGAAGCCGGCGAACGTGCCGTTCTGCTGCTGCACGGCTTTACCGGTAACAGCGCAGATGTCCGCATGCTGGGTCGCTTTCTGGAAAGTAAAGGTTATACCTGTCACGCCCCGATTTATAAAGGTCATGGTGTTCCGCCGGAAGAACTGGTTCATACCGGCCCGGACGATTGGTGGCAGGATGTTATGAATGGTTATGAATTTCTGAAAAACAAAGGCTATGAGAAAATCGCAGTTGCGGGTCTGAGTCTGGGTGGTGTTTTTAGTCTGAAACTGGGTTATACCGTTCCGATTGAAGGGATTGTTACCATGTGCGCACCGATGTATATCAAAAGTGAAGAAACGATGTACGAGGGTGTTCTGGAATATGCGCGTGAATATAAAAAGCGCGAAGGTAAAAGCGAGGAACAGATTGAGCAGGAGATGGAAAAATTTAAACAGACCCCGATGAAAACCCTGAAAGCCCTGCAGGAACTGATTGCAGATGTTCGTGATCATCTGGATCTGATTTATGCACCGACATTTGTTGTGCAGGCACGTCACGATGAGATGATTAACCCGGATAGCGCAAACATTATTTATAACGAAATCGAAAGCCCGGTAAAACAGATTAAATGGTATGAGCAGAGCGGACATGTTATTACACTGGATCAGGAAAAAGATCAGCTGCATGAAGATATTTATGCATTTCTGGAGAGCCTGGATTGGCACCACCACCACCATCAC。
SEQ ID NO.2
MMKIVPPKPFFFEAGERAVLLLHGFTGNSADVRMLGRFLESKGYTCHAPIYKGHGVPPEELVHTGPDDWWQDVMNGYEFLKNKGYEKIAVAGLSLGGVFSLKLGYTVPIEGIVTMCAPMYIKSEETMYEGVLEYAREYKKREGKSEEQIEQEMEKFKQTPMKTLKALQELIADVRDHLDLIYAPTFVVQARHDEMINPDSANIIYNEIESPVKQIKWYEQSGHVITLDQEKDQLHEDIYAFLESLDWHHHHHH.
实施例2：定点突变构建E.coli BL21(DE3)/GsEst-muts
对目的蛋白和底物分子进行建模和分子对接，初步选定需要改造的位点，再结合已有报道相关序列的突变进行筛选(多序列比对)，最终确定需要进行改造的位点。对确定的位点进行丙氨酸扫描，根据扫描结果进行点突变。
通过定点突变技术，在酯酶GsEst中引入定点突变。设计引物如下：
S94P
上游引物1：5’-GCAGTTGCGGGTCTGccgCTGGGTGGTGTTTTTAG-3’
下游引物2：5’-cggCAGACCCGCAACTGCGATTTTCTCATAGCC-3’
L95G
上游引物3：5’-GTTGCGGGTCTGAGTggcGGTGGTGTTTTTAGT-3’
下游引物4：5’-gccACTCAGACCCGCAACTGCGATTTTCTCATA-3’
K122A
上游引物5：5’-GATGTATATCgcgAGTGAAGAAACGATGTACG-3’
下游引物6：5’-GTTTCTTCACTcgcGATATACATCGGTGC-3’
E137G
上游引物7：5’-CTGGAATATGCGCGTggcTATAAAAAGCGCGAAG-3’
下游引物8：5’-gccACGCGCATATTCCAGAACACCCTCGTACAT-3’
E137I
上游引物9：5’-CTGGAATATGCGCGTatcTATAAAAAGCGCGAAG-3’
下游引物10：5’-gatACGCGCATATTCCAGAACACCCTCGTACAT-3’
M195S
上游引物11：5’-GCACGTCACGATGAGagcATTAACCCGGATAGC-3’
下游引物12：5’-gctCTCATCGTGACGTGCCTGCACAACAAATG-3’
I196A
上游引物13：5’-CGTCACGATGAGATGgcgAACCCGGATAGCGC-3’
下游引物14：5’-cgcCATCTCATCGTGACGTGCCTGCACAACAAA-3’
H223S
上游引物15：5’-TATGAGCAGAGCGGAagcGTTATTACACTGGAT-3’
下游引物16：5’-gctTCCGCTCTGCTCATACCATTTAATCTG-3
定点突变引物如上所述，小写字母标出了突变位点。以含有GsEst基因的质粒DNA为模板，通过PCR引入突变，PCR反应程序如下：95℃5min；95℃30s，55℃10s，72℃4min 30s，重复35个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，80℃灭活10min后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L卡那抗性的LB固体平板上，37℃培养12h后。随机挑取单菌落进行测序分析，获得GsEst突变体，即含有表达酯酶GsEst突变体基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/GsEst-muts，分别为GsEst-S94P、GsEst-L95G、GsEst-K122A、GsEst-E137G、GsEst-E137I、GsEst-M195S、GsEst-I196A、GsEst-H223S。
组合突变以E137I/M195S为例，E137I/M195S以含有GsEst-137I基因的质粒DNA为模板，通过PCR引入M195S突变，PCR反应程序如下：95℃5min；95℃30s，55℃10s，72℃4min30s，重复35个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理3h，80℃灭活10min后转化至E.coli BL21(DE3)受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L卡那抗性的LB固体平板上，37℃培养12h后。随机挑取单菌落进行测序分析，获得含有表达酯酶GsEst突变体基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/GsEst-E137I/M195S。同理可获得GsEst突变体GsEst-K122A/M195S、GsEst-K122A/E137I、GsEst-E137G/M195S。
实施例3：重组酯酶突变体湿菌体的制备
将实施例2获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/GsEst-muts接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，180rpm下培养10h，再以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心15min，弃去上清液，收集沉淀，即获得含有表达酯酶GsEst突变体基因的重组大肠杆菌湿菌体。该湿菌体可直接作为生物催化剂或者用于蛋白纯化。相同方法制备含有表达重组酯酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/GsEst湿菌体。
实施例4：酯酶突变体的分离纯化
本发明所述酯酶粗酶液的制备：将重组大肠杆菌工程菌湿菌体按照0.4g湿菌体加9.6mL 100mM、pH7.0的磷酸钾缓冲溶液重悬湿菌体，冰浴条件下进行超声破碎(60W，持续2s，间歇4s，连续破碎15min)，获得细胞破碎液。将超声破碎后获得的细胞破碎液于12000rpm、4℃离心10min，所得到的上清即为粗酶液。粗酶液和破碎后的沉淀凝胶电泳图见图1。
纯酶液：将该粗酶液与经结合缓冲液(50mM，pH7.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl)平衡过的Ni2+亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲液(50mM，pH7.0磷酸钠缓冲液，含300mMNaCl，50mM咪唑)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM，pH 7.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl，500mM咪唑)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后(单条带)，合并目的蛋白并以透析缓冲液(20mM，pH 7.0磷酸钠缓冲液)透析(10kDa分子量截留)24h。取截留液用BCA试剂盒测定蛋白含量，并冻存于-80℃冰箱中，即为纯酶液。
实施例5：酯酶活力测定
将实施例4方法分离纯化得到的野生型酯酶GsEst纯酶液及酯酶GsEst突变体纯酶液GsEst-S94P、GsEst-L95G、GsEst-K122A、GsEst-E137G、GsEst-E137I、GsEst-M195S、GsEst-I196A、GsEst-H223S、E137I/M195S、GsEst-K122A/M195S、GsEst-K122A/E137I、GsEst-E137G/M195S用于催化底物(外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯)检测酶活。
表1酯酶及突变体酶活
| 湿菌体 | 酶活/U |
| GsEst | 7.10 |
| GsEst-S94P | 0.67 |
| GsEst-L95G | 8.81 |
| GsEst-K122A | 37.26 |
| GsEst-E137G | 7.24 |
| GsEst-E137I | 20.14 |
| GsEst-M195S | 19.47 |
| GsEst-I196A | 13.72 |
| GsEst-H223S | 0.75 |
| GsEst-E137G/M195S | 13.76 |
| GsEst-E137I/M195S | 29.45 |
| GsEst-K122A/M195S | 54.23 |
| GsEst-K122A/E137I | 75.67 |
酶催化体系组成及催化条件如下：取纯酶液0.01g(以蛋白含量计)用磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.0)稀释，加入终浓度20g/L的外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯，用磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.0)构成1mL反应体系，于30℃，600rpm条件下反应10分钟后，取样200μL加入200μL 2M的HCl终止反应，用800μL乙酸乙酯萃取，离心分离水相和有机相，在有机相中加入一定量无水硫酸钠干燥，离心后取200μL用高效气相色谱(GC)检测底物转化率。
GC检测方法如下：气相仪：安捷伦6890N；手性气相柱：B-DM(0.25mm×30m×0.12mm)，进样口温度：250℃；FID检测器温度：250℃；空气流量300mL/min，尾吹气流量25mL/min；分流比：50；恒流1mL/min。柱箱升温程序：初始温度80℃保持0.5min，8℃/min升温至120℃，保持0.5min，2℃/min升温至140℃，保持2min。
酶活单位(U)定义为：在30℃、pH 7.0条件下，1min内消耗3-环己烯-1-甲酸甲酯所需的酶量定义为1U。
利用BCA法测定各酶液中蛋白含量。本实验借助凯基BCA蛋白含量检测试剂盒测定蛋白含量，操作按照试剂盒说明书进行。
比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用U/mg蛋白质表示。
实施例6：重组酯酶GsEst在制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用
以实施例3方法获得的湿菌体作为生物催化剂，以3-环己烯-1-甲酸甲酯为底物，进行催化反应制备(S)-3-环己烯-1-甲酸。
催化反应体系及催化条件如下：湿菌体终浓度为10g/L，外消旋3-环己烯-1-甲酸甲酯终浓度为200g/L，以磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)为反应介质构成转化体系10mL，30℃水浴，磁力搅拌600rpm，通过自动流加2M NaOH溶液的方式控制pH为7.0，反应2h，取样，并通过实施例5所述GC分析转化率和e.e.p值。结果见表2、图4和图5。
表2、酯酶催化效果
Claims (10)
1.一种酯酶GsEst突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第94位、第95位、第122位、第137位、第195位、第196位或第223位进行单突变获得的。
2.如权利要求1所述酯酶GsEst突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第122位赖氨酸位突变为丙氨酸；(2)第137位谷氨酸突变为异亮氨酸；(3)第195位甲硫氨酸突变为丝氨酸；(4)第122位赖氨酸位突变为丙氨酸同时第137位谷氨酸突变为异亮氨酸；(5)第122位赖氨酸位突变为丙氨酸同时第195位甲硫氨酸突变为丝氨酸；(6)第137位谷氨酸突变为异亮氨酸同时第195位甲硫氨酸突变为丝氨酸。
3.一种权利要求1所述酯酶GsEst突变体的编码基因。
4.一种由权利要求3所述编码基因构建的重组基因工程菌。
5.一种权利要求1所述酯酶GsEst突变体在拆分3-环己烯-1-甲酸甲酯制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用为：以含酯酶GsEst突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的粗酶液或纯化后的纯酶液为催化剂，以3-环己烯-1-甲酸甲酯为底物，以pH值为6-9的磷酸钾缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在20-40℃，600rpm条件下反应，反应完全，将反应液分离纯化，获得(S)-3-环己烯-1-甲酸。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以湿菌体重量计为20-200g/L缓冲溶液，所述底物的初始浓度为10-700g/L。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含有酯酶GsEst突变体编码基因的工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，180rpm下培养10h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心15min，弃去上清液，收集湿菌体。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述粗酶液按如下方法制备：将湿菌体按照0.4g湿菌体加9.6mL 100mM、pH7.0的磷酸钾缓冲溶液重悬湿菌体，冰浴条件下60W进行超声破碎，持续2s，间歇4s，连续破碎15min，获得细胞破碎液；将细胞破碎液于8000rpm、4℃离心10min，所得到的上清即为粗酶液。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述纯酶液按如下方法制备：将粗酶液与经结合缓冲液平衡过的Ni2+亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲液冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液洗脱并收集目的蛋白，以20mM，pH 7.0磷酸钠缓冲液的透析缓冲液透析24h，取截留液，即为纯酶液；所述结合缓冲液为含300mM NaCl的50mM，pH7.0磷酸钠缓冲液；所述冲洗缓冲液为含300mM NaCl，50mM咪唑的50mM，pH 7.0磷酸钠缓冲液；洗脱缓冲液为含300mM NaCl，500mM咪唑的50mM，pH 7.0磷酸钠缓冲液。
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