CN102766608A - 菊糖芽孢乳杆菌的d-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）的D-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用。本发明所提供的D-乳酸脱氢酶是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脱氢酶活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明所提供的D-乳酸脱氢酶能够以NADH为辅酶，也可以NADPH为辅酶，催化丙酮酸生成D-乳酸，也能以NADH为辅酶催化苯基丙酮酸生成D-苯基乳酸，且生成产物光学纯度可达100%（无L型产物生成），具有广阔的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种来源于菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）的D-乳酸脱氢酶及其编码基因与应用。
背景技术
3-苯基乳酸，即2-羟基-3-苯基丙酸，是一种重要的化学合成前体，并广泛应用于医药、化工和生物合成等领域。近几年来，它作为一种新型的抑菌剂又受到食品行业的广泛关注。3-苯基乳酸的第二个碳原子是手性碳，有两种构型，即D-苯基乳酸和L-苯基乳酸，这两种构型化合物对生物体的作用及其在医药、化工方面的应用不同。D-苯基乳酸，又名D-3-苯基乳酸、D-2-羟基-3-苯丙酸或(R)-2-羟基-3-苯基丙酸（CAS号7326-19-4）。D-苯基乳酸可用于合成降血糖药、驱肠虫药，并对人体内类固醇的水平有一定的调节作用。D-苯基乳酸是用于制备4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸的手性砌块，也是制备降血糖助剂英格列酮以及15N-标记苯基丙氨酸的起始物。
3-苯基乳酸的制备主要为化学合成法。3-苯基乳酸的化学合成主要有以下几种方法：（1）吖内酯锌汞齐还原法；（2）由β-苯基丙烯酸锌汞齐还原法；（3）用苯甲醛经缩合、开环、水解、还原等几步反应制得。这些方法都在不同程度上存在技术复杂、污染环境、产品不纯、光学纯度低而不能得到单一构型化合物等缺点，因而近几年来转向了生物合成法的开发与研究。1996年，日本学者Hashimoto等从土壤中筛选到了一株假单胞菌（Pseudomonas sp.），能够转化苯乙醛-氰醇为D-苯基乳酸，生成的D-苯基乳酸光学纯度仅为75%。2002年，Katrin等从青贮草中也分离到了一株植质乳杆菌（Lactobacillus plantarum），它产生的D-苯基乳酸光学纯度仅为90%。美国Diversa公司开发了利用腈酶（EC 3.5.5.1）制备光学纯度大于99%的D-苯基乳酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白，该蛋白来源于菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）。
本发明所提供的具有D-乳酸脱氢酶活性的蛋白，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脱氢酶活性的由序列1衍生的蛋白质。
上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
序列表中序列1由335个氨基酸残基组成。
为了便于所述蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6（通常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个） | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述（a）中所述的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中所述的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2的核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。
编码上述蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体是编码所述蛋白的基因；所述基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白质的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有80%以上同源性且编码上述蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
其中，序列2由1008个核苷酸组成，其编码序列为自5’端第1-1008位碱基，编码序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。所述重组表达载体为在出发载体的酶切位点处插入所述基因得到的重组质粒。所述出发载体可为pET-22b、pET-28a、pET-32、pQE-30、pGEX-4T-2、pBR322或pUC18。
在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为T7启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在pET-28a载体的多克隆位点处插入所述基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为Nco I和Hind III。
所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。
在本发明的一个实施例中，所述重组菌具体为表达所述蛋白的大肠杆菌。
扩增所述基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
所述蛋白在作为D-乳酸脱氢酶中的应用也属于本发明的保护范围。
所述蛋白、或所述基因在如下（a）或（b）中的应用也属于本发明的保护范围：
（a）催化丙酮酸生成D-乳酸；
（b）催化苯基丙酮酸生成D-苯基乳酸。
在上述应用中，以NADH或NADPH为辅酶。
本发明的另一个目的是提供一种制备D-乳酸脱氢酶的方法。
该方法包括如下步骤：将表达所述基因的所述重组表达载体导入宿主细胞，表达得到上述蛋白，即为D-乳酸脱氢酶。
本发明的再一个目的是提供一种利用所述蛋白生产D-苯基乳酸的方法。
该方法包括如下步骤：将所述蛋白、苯基丙酮酸、和NADH（或NADPH），在27-35℃（如30℃），pH5.0-6.0（如pH5.5）的条件下反应，得到D-苯基乳酸。其中，所述蛋白为具有催化活性的D-乳酸脱氢酶，所述苯基丙酮酸为底物，所述NADH或NADPH为辅酶。
本发明的还一个目的是提供一种利用所述蛋白生产D-乳酸的方法。
该方法包括如下步骤：将所述蛋白、丙酮酸、和NADH或NADPH，在27-35℃（如30℃），pH5.0-6.0（如pH5.5）的条件下反应，得到D-乳酸。其中，所述蛋白为具有催化活性的D-乳酸脱氢酶，所述丙酮酸为底物，所述NADH或NADPH为辅酶。
在本发明中，所述蛋白（即D-乳酸脱氢酶）的最适反应温度为30℃；最适反应pH为5.5。
本发明所提供的来源于菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）CASDCGMCC No.2185的蛋白具有D-乳酸脱氢酶的活性，能够以NADH为辅酶，也可以NADPH为辅酶，催化丙酮酸生成D-乳酸，也能以NADH为辅酶催化苯基丙酮酸生成D-苯基乳酸，且生成产物光学纯度可达100%（无L型产物生成），具有广阔的工业应用前景。
附图说明
图1为SDS-PAGE检测纯化D-乳酸脱氢酶蛋白的分子量大小。其中，泳道M为蛋白分子量标准；泳道1为全细胞总蛋白；泳道2为细胞超声波破碎上清液；泳道3为流过蛋白纯化柱子后的细胞超生波破碎上清液；泳道4为纯化后D-乳酸脱氢酶蛋白。
图2为D-乳酸脱氢酶的最适反应pH值测定结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中各参数的测定方法如下：
（1）L-乳酸和D-乳酸浓度的测定：采用Agilent 1260液相色谱仪，配备手性分离柱（日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10W，4.6mm ID×50mm，光学异构体分离用）。具体操作条件为：2mM的硫酸铜作为流动相，流速0.5ml/min，进样量10μl，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25℃。利用L-乳酸和D-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中L-乳酸和D-乳酸的含量。
（2）L-苯基乳酸和D-苯基乳酸浓度的测定：采用Agilent 1260液相色谱仪，配备手性分离柱（日本三菱化学公司，CHIRALCEL OJ-RH，4.6mm ID×150mm，光学异构体分离用）。具体操作条件为：0.1%（v/v）的冰醋酸:乙腈=体积比90:10为流动相，流速0.4ml/min，进样量5μl，紫外检测器，检测波长205nm，操作温度15℃。利用L-苯基乳酸和D-苯基乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液中L-苯基乳酸和D-苯基乳酸的含量。
（3）底物转化率定义为：产物D-苯基乳酸产量（mM）÷底物苯基丙酮酸的消耗量（mM）×100%。其中，反应液中苯基丙酮酸浓度的测定采用Agilent 1260液相色谱仪，配备C-18反相柱（美国Agilent公司，ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6mm ID×250mm）。具体操作条件为：1mM硫酸：乙腈=体积比85：15作为流动相，流速1.0ml/min，进样量5μl，紫外检测器，检测波长210nm，操作温度30℃。利用苯基丙酮酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液剩余苯基丙酮酸的含量。
（4）光学纯度（optical purity）是衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度，它可用对映体过量值（enantiomeric excess）表示。本发明中D-苯基乳酸的光学纯度按以下公式计算：（D-苯基乳酸含量-L-苯基乳酸含量）÷（D-苯基乳酸含量+L-苯基乳酸含量）×100%。
（5）测定反应体系中NADH的变化：在340nm的条件下，于反应前后分别检测信号（即吸光度）。在相同条件下，利用NADH标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出反应前后反应体系中NADH含量，从而计算出反应体系中NADH的实际变化的量。
实施例1、D-乳酸脱氢酶基因及其蛋白的获得
一、D-乳酸脱氢酶基因的克隆
经过对菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）CASD CGMCC No.2185的全基因组测序，并注释基因组信息后，获得了一个可能编码乳酸脱氢酶的基因，根据基因序列设计如下引物P1和P2。
P1：5'-GGTCATGAAAATCATTATGTTCAG-3'（下划线处为酶切位点BspH I的识别序列，第5-24位为序列2的第1-20位）
P2：5'-GCAAGCTTGTTTTCTACAGCTACTTTGTT-3'（下划线处为酶切位点HindIII的识别序列，其后的序列为序列2的第985-1005位的反向互补序列）
以菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）CASD CGMCC No.2185总基因为模板，以P1和P2为引物，通过PCR的方式扩增得到目的基因片段。对目的基因进行核苷酸序列测定，序列测定结果表明该基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，由1008个核苷酸组成，整个序列2即为一个完整的开放阅读框，编码序列表中序列1所述的氨基酸残基组成的蛋白质。
二、D-乳酸脱氢酶蛋白的获得
1、重组原核表达载体的构建
将步骤一经PCR获得的目的基因片段用BspH I和Hind III双酶切后，连接到经Nco I（与BspH I为同尾酶）和Hind III酶切处理的表达载体pET-28a（美国Merck公司，产品货号：69864-3）中，将含有D-乳酸脱氢酶基因的连接产物转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)（天根生化科技（北京）有限公司，产品货号：CB105-02），经PCR和酶切鉴定后将含有D-乳酸脱氢酶基因的阳性克隆质粒命名为pET28a-744，可用其进行D-乳酸脱氢酶的表达。
2、D-乳酸脱氢酶的原核表达及纯化
（1）D-乳酸脱氢酶的原核表达
将步骤1获得的含有D-乳酸脱氢酶基因的原核表达载体pET28a-744转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，挑选阳性单克隆在37℃下摇菌至OD600为0.6后，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，23℃下摇床培养5小时后离心收集菌体，反复冻融后重悬于超声缓冲液（含20mM Tris盐酸缓冲液，500mM NaCl，10mM咪唑，以上浓度均为在溶液中的终浓度，pH7.9）中，超声破碎细胞，分别收集上清及沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析。
结果如图1所示，从图中可以看出携带目的基因的原核表达载体pET28a-744在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得大量表达，表达的重组蛋白的单亚基分子量为37kDa，与预期结果相符。
（2）D-乳酸脱氢酶的纯化
因为pET-28a载体的Hind III酶切位点后，终止密码子前有His-tag标签（6个组氨酸）的编码序列，所以可通过His-tag标签进行对步骤（1）表达的蛋白进行纯化。具体如下：
将步骤（1）获得的经过SDS-PAGE的原核表达产物进行亲和层析纯化。将超声后的上清过填充有Ni-NTA凝胶的层析柱，含有His-tag标签的蛋白将结合到Ni-NTA凝胶上，然后用清洗缓冲液（20mM Tris盐酸缓冲液，500mM NaCl，60mM咪唑，以上浓度均为在溶液中的终浓度，pH7.9）洗涤非特异性结合的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液（20mM Tris盐酸缓冲液，500mM NaCl，300mM咪唑，以上浓度均为在溶液中的终浓度，pH7.9）将目的蛋白洗脱，即得到纯化后的目的蛋白。然后使用分子筛凝胶柱更换缓冲液为100mM磷酸盐缓冲液（pH7.0），获得最终纯化后目的蛋白。
对最终纯化后目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果如图1泳道4所示，目的条带单一，大小为37kDa，表明所得目的蛋白较纯。
实施例2、实施例1所得目的蛋白的酶学特性鉴定
用下述反应鉴定实施例1所得目的蛋白的酶学特性：
（苯基）丙酮酸+NAD(P)H+H+→D-（苯基）乳酸+NAD(P)+
以20mM丙酮酸或20mM苯基丙酮酸为底物，以0.2mM的NADH或0.2mMNADPH为辅酶，与15μg D-乳酸脱氢酶一同添加到100mM的磷酸盐缓冲液（pH5.5）中混匀（上述各物质的浓度均为在100mM的磷酸盐缓冲液中的终浓度），30℃反应1个小时。反应结束后检测反应液中D-乳酸和L-乳酸，或D-苯基乳酸和L-苯基乳酸的含量。
结果表明：实施例1所得目的蛋白既可以NADH为辅酶，也能利用NADPH为辅酶，具体的：
以NADH为辅酶，催化丙酮酸生成乳酸（在30℃、pH 5.5条件下，以20mM的丙酮酸为底物，0.2mM的NADH为辅酶），结果只生成D-乳酸，检测不到L-乳酸的生成。
以NADPH为辅酶，催化丙酮酸生成乳酸（在30℃、pH5.5条件下，以20mM的丙酮酸为底物，0.2mM的NADPH为辅酶），结果只生成D-乳酸，检测不到L-乳酸的生成。
以NADH为辅酶，催化苯基丙酮酸生成乳酸（在30℃、pH5.5条件下，以5mM的苯基丙酮酸为底物，0.2mM的NADH为辅酶），结果只生成D-苯基乳酸，检测不到L-苯基乳酸的生成。
上述结果表明实施例1所得目的蛋白确实为D-乳酸脱氢酶。
其中，实施例1所得D-乳酸脱氢酶的最适反应pH值和最适反应温度是通过如下两试验确定的：
试验一、D-乳酸脱氢酶的最适反应pH值确定
酶活的测定方法是在340nm紫外波长下测定NADH的变化，一个单位酶活定义为每分钟氧化1μmol的NADH所需的酶量。在30℃条件下，以20mM的丙酮酸为底物，以0.2mM的NADH为辅酶，测定了所述D-乳酸脱氢酶从pH 4.5到8.5的范围内，酶活性的变化情况。缓冲体系：100mM的磷酸盐缓冲体系（pH4.5到8.5）。
结果如图2所示，表明该酶的最适反应pH值为5.5。（图2中酶相对活力是测定不同pH值条件下酶的活力，依据在pH 5.5的最高值为100%，其他pH时的酶活力数值相应折算得到酶相对活力）
试验二、D-乳酸脱氢酶的最适反应温度确定
酶活的测定方法是在340nm紫外波长下测定NADH的变化，一个单位酶活定义为每分钟氧化1μmol的NADH所需的酶量。D-乳酸脱氢酶最适反应温度的测定条件如下：20mM的丙酮酸为底物，0.2mM的NADH为辅酶，100mM的磷酸盐缓冲液（pH5.5）体系；分别测定了从25℃到45℃的酶活力。
结果显示，该酶的最适反应温度是30℃。在30℃条件下，通过在340nm紫外波长下测定NADH的变化来定量检测该酶的酶活，实验重复三次，结果取平均值。结果显示，在此条件下酶活为6786±239U/mg蛋白（表1）。
表1在30℃、pH5.5的条件下D-乳酸脱氢酶的酶活检测结果
| 重复 | D-乳酸脱氢酶的酶活（U/mg蛋白） |
| 1 | 6595 |
| 2 | 6708 |
| 3 | 7054 |
| 平均值±标准差 | 6786±239 |
实施例3、利用D-乳酸脱氢酶生产D-苯基乳酸
将15μg实施例1获得的目的蛋白（D-乳酸脱氢酶），5mM的苯基丙酮酸（底物），2.1mM的NADH（辅酶），一同添加到100mM的磷酸盐缓冲液（pH5.5）中混匀（上述各物质的浓度均为在100mM的磷酸盐缓冲液中的终浓度），30℃反应1个小时。反应结束后检测反应液中D-苯基乳酸和L-苯基乳酸的含量。计算底物转化率和D-苯基乳酸的光学纯度。实验设3个重复，结果取平均值。
结果如表2所示，检测到反应液中含有浓度为2.1mM的D-苯基乳酸，但检测不到L-苯基乳酸的存在。
表2利用D-乳酸脱氢酶的细胞生产D-苯基乳酸3次重复实验的结果（一）
实施例4、利用D-乳酸脱氢酶生产D-苯基乳酸
将15μg实施例1获得的目的蛋白（D-乳酸脱氢酶），10mM的苯基丙酮酸（底物），10mM的NADH（辅酶），一同添加到100mM的磷酸盐缓冲液（pH5.5）中混匀（上述各物质的浓度均为在100mM的磷酸盐缓冲液中的终浓度），30℃反应1个小时。反应结束后检测反应液中D-苯基乳酸和L-苯基乳酸的含量。计算底物转化率和D-苯基乳酸的光学纯度。实验设3个重复，结果取平均值。
结果如表3所示，检测到反应液中含有浓度为5.1mM的D-苯基乳酸，但检测不到L-苯基乳酸的存在。该酶底物特异性高，工业应用前景广阔。
表3利用D-乳酸脱氢酶的细胞生产D-苯基乳酸3次重复实验的结果（二）
Claims (9)
1.蛋白质，是如下（a）或（b）：
（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有D-乳酸脱氢酶活性的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：
1）编码序列为序列表中序列2的DNA分子；
2）序列表中序列2所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有80%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。
5.权利要求1所述的蛋白在作为D-乳酸脱氢酶中的应用。
6.权利要求1所述的蛋白、或权利要求2或3所述的基因在如下（a）或（b）中的应用：
（a）催化丙酮酸生成D-乳酸；
（b）催化苯基丙酮酸生成D-苯基乳酸。
7.一种制备D-乳酸脱氢酶的方法，包括如下步骤：将权利要求4所述的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到权利要求1所述的蛋白质，即为D-乳酸脱氢酶。
8.利用权利要求1所述蛋白质生产D-苯基乳酸的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述蛋白质、苯基丙酮酸、和NADH或NADPH，在27-35℃，pH5.0-6.0的条件下反应，得到D-苯基乳酸。
9.利用权利要求1所述蛋白质生产D-乳酸的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述蛋白质、丙酮酸、和NADH或NADPH，在27-35℃，pH5.0-6.0的条件下反应，得到D-乳酸。
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| CN105586323A (zh) * | 2016-03-07 | 2016-05-18 | 中国农业大学 | 一种d-乳酸脱氢酶突变体及其应用 |
| CN105586323B (zh) * | 2016-03-07 | 2019-03-12 | 中国农业大学 | 一种d-乳酸脱氢酶突变体及其应用 |
| CN107267476A (zh) * | 2016-04-08 | 2017-10-20 | 中国科学院微生物研究所 | 一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用 |
| CN107267476B (zh) * | 2016-04-08 | 2019-08-30 | 中国科学院微生物研究所 | 一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用 |
| CN109536467A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-03-29 | 浙江卓运生物科技有限公司 | 面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法 |
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