CN105586323B - 一种d-乳酸脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

一种d-乳酸脱氢酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种D‑乳酸脱氢酶突变体及其应用。本发明提供了一种蛋白，是如下1)或2)：1)序列A所示的蛋白质；2)将序列A所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列A衍生的蛋白质；所述序列A为将序列2第307位Met突变为Leu得到的序列。本发明的实验证明，本发明选择了来自Sporolactobacillus inulinus的D‑LDH744进行突变获得D‑乳酸脱氢酶突变体M307L；该突变体具有高的D‑乳酸脱氢酶活性，且比未突变的D‑乳酸脱氢酶相比，提高D‑LDH以PPA(盐酸苯丙醇胺)为底物时的酶活。

Description

一种D-乳酸脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物工程制备领域，尤其涉及一种D-乳酸脱氢酶突变体及其应用，具体涉及一种D-乳酸脱氢酶的改造及利用休止细胞法高效转化苯丙酮酸合成D-苯乳酸的方法。
背景技术
苯乳酸是一种小分子化合物，其第二个碳原子是手性碳，因此有两种对映异构体即D-苯乳酸和L-苯乳酸。苯乳酸被证明能抑制培养基、牛奶和奶酪中的李斯特菌，还能抑制一些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，如大肠杆菌。苯乳酸被认为是乳酸菌(Lactobacillus)产生的第三代可用于食品体系中的新型抑菌物质，普遍认为D-苯乳酸在抑菌中发挥主要作用。另外，苯乳酸被用于畜牧业，取代抗生素的饲料添加剂，还是丹参素的一种衍生物，用于扩张冠状动脉。
苯乳酸的合成方法有化学合成法和生物合成法，由于化学合成法技术复杂，反应条件苛刻，对环境污染较严重，而且副产物多，所以近几年逐渐将方向转移至生物合成法上。生物合成法中的微生物发酵法利用许多种乳酸菌合成苯乳酸，虽然有原料成本低，工艺简单，操作方便等优点，但是副产物多的缺点导致后期的分离纯化较复杂。而休止细胞反应不仅底物专一性强，转化率高，不易染菌，而且副产物少，分离纯化较简单，在工业化的实现上有广阔的前景。
NADH依赖的D-乳酸脱氢酶(D-LDH，EC1.1.1.27)可以催化苯丙酮酸(PPA)生成D-苯乳酸(D-PLA)，但是相比较于丙酮酸，天然的D-LDH对于PPA表现出较少的底物特异性，但是底物特异性可以通过酶的修饰来提高。Tokuda(2003)根据来自L.pentosus的D-LDH蛋白三维结构，将距离底物PPA分子C3端较近的氨基酸Tyr52替换成了Leu，这个突变体D-LDH(Y52L)比野生型D-LDH表现出了对PPA更高的底物特异性和催化效率。Ishikura(2005)也证明将Tyr52替换成小的疏水氨基酸可以提高L.pentosus对PPA的亲和力和催化效率。Zheng(2013)将来自L.bulgaricus ATCC11842的D-LDH的氨基酸Tyr52和Phe299组合突变成Y52L/F299Y突变体，对PPA的酶活是野生型的83.9倍。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术生物合成法中的微生物发酵法利用许多种乳酸菌合成苯乳酸副产物多的缺点导致后期的分离纯化较复杂的不足，提供一种改造后的D-乳酸脱氢酶高效转化苯丙酮酸合成D-苯乳酸的方法。
本发明提供了一种D-乳酸脱氢酶突变体。
本发明提供的蛋白，为D-乳酸脱氢酶突变体，是如下1)或2)：
1)序列A所示的蛋白质；
2)将序列A所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列A衍生的蛋白质；
所述序列A为将序列表中序列2第307位Met突变为Leu得到的序列。
编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。
上述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：
1)编码区为序列B所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
所述序列B为将序列表中序列1第919位A突变为C得到的序列。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
上述重组载体M307L为将D-乳酸脱氢酶突变体M307L的编码基因插入pET-28a载体的Hind III和BamH I位点。
上述重组菌为将上述DNA分子通过重组载体导入目的菌中表达上述蛋白质的菌。
上述蛋白在作为D-乳酸脱氢酶中的应用也是本发明保护的范围。
上述蛋白或上述DNA分子或上述重组菌在催化苯丙酮酸生成D-苯乳酸中的应用中的应用也是本发明保护的范围。
上述蛋白或上述DNA分子或上述重组菌在生产苯乳酸或提高苯乳酸中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种催化苯丙酮酸生成D-苯乳酸的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述重组菌、苯丙酮酸和葡萄糖在反应体系中反应，得到苯乳酸。
上述方法中，所述反应体系的pH值为7.5；
所述反应体系中葡萄糖的含量为5g/L。
本发明的实验证明，本发明选择了来自Sporolactobacillus inulinus的D-LDH744进行突变获得D-乳酸脱氢酶突变体M307L；该突变体具有高的D-乳酸脱氢酶活性，且比未突变的D-乳酸脱氢酶相比，提高D-LDH以PPA(盐酸苯丙醇胺)为底物时的酶活。将该突变体在大肠杆菌中表达，优化休止细胞反应催化合成D-PLA的条件，使产物PLA(苯乳酸)产量得到提高。从源头上改变生物合成法中的微生物发酵法利用许多种乳酸菌合成苯乳酸的技术现状，有助于推动和扩大苯乳酸组分的开发与利用。
附图说明
图1为SDS-PAGE检测蛋白表达。
图2为野生型与突变体酶活比较。
图3为全细胞转化最适条件优化。
图4为全细胞转化最适条件下PPA转换为PLA的产量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在本申请文本中所使用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.,138:9-37,1984)
下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例1、D-乳酸脱氢酶突变体的制备
根据模拟的含有底物PPA和NADH的DLDH744蛋白三维空间结构，分别将离PPA底物C3端很近的谷氨酰胺(Q)突变成较小的疏水氨基酸丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，101位的酪氨酸(Y)突变成苯丙氨酸(F)，298位的苯丙氨酸(F)突变成酪氨酸(Y)，307位的甲硫氨酸(M)突变成亮氨酸(L)，构建了D-乳酸脱氢酶突变体Q51V，Q51L，Q51A，Y101F，F298Y，M307L突变体。
野生型D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列为序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列1。
D-乳酸脱氢酶突变体Q51V的氨基酸序列为将序列2第51位Gln突变为Val得到的序列；D-乳酸脱氢酶突变体Q51V的编码基因的核苷酸序列为将序列1第151-152位CA突变为GT得到的序列；
D-乳酸脱氢酶突变体Q51L的氨基酸序列为将序列2第51位Gln突变为Leu得到的序列；D-乳酸脱氢酶突变体Q51L的编码基因的核苷酸序列为将序列1第152位A突变为T得到的序列；
D-乳酸脱氢酶突变体Q51A的氨基酸序列为将序列2第51位Gln突变为Ala得到的序列；D-乳酸脱氢酶突变体Q51A的编码基因的核苷酸序列为将序列1第151-153位CAG突变为GCA；
D-乳酸脱氢酶突变体Y101L的氨基酸序列为将序列2第101位Tyr突变为Leu得到的序列；D-乳酸脱氢酶突变体Y101L的编码基因的核苷酸序列为将序列1第301-303位TAT突变为CTG得到的序列；
D-乳酸脱氢酶突变体F298Y的氨基酸序列为将序列2第298位Phe突变为Tyr得到的序列；D-乳酸脱氢酶突变体F298Y的编码基因的核苷酸序列为将序列1第893-894位TC突变为AT得到的序列。
D-乳酸脱氢酶突变体M307L的氨基酸序列为将序列2第307位Met突变为Leu得到的序列；D-乳酸脱氢酶突变体M307L的编码基因的核苷酸序列为将序列1第919位A突变为C得到的序列。
上述突变体通过原核表达制备，具体如下：
1、重组载体
来源于Sporolactobacillus inulinus的D-乳酸脱氢酶的编码基因插入pET-28a载体(优宝生物，VT1207)的Hind III和BamH I位点，得到表达D-乳酸脱氢酶的重组载体744-28a，其中D-乳酸脱氢酶的氨基酸序列为序列2，D-乳酸脱氢酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
以744-28a为模板，分别用表1所示的引物进行扩增，得到相应的点突变重组质粒Q51V、Q51L、Q51A、Y101L、F298Y、M307L，各自点突变重组质粒表达不同的D-乳酸脱氢酶突变体。
点突变重组质粒Q51V为将D-乳酸脱氢酶突变体Q51V的编码基因插入pET-28a载体的Hind III和BamH I位点；D-乳酸脱氢酶突变体Q51V的氨基酸序列为将序列2第51位Gln突变为Val得到的序列；D-乳酸脱氢酶突变体Q51V的编码基因的核苷酸序列为将序列1第151-152位CA突变为GT得到的序列；
点突变重组质粒Q51L为将D-乳酸脱氢酶突变体Q51L的编码基因插入pET-28a载体的Hind III和BamH I位点；D-乳酸脱氢酶突变体Q51L的氨基酸序列为将序列2第51位Gln突变为Leu得到的序列；D-乳酸脱氢酶突变体Q51L的编码基因的核苷酸序列为将序列1第152位A突变为T得到的序列；
点突变重组质粒Q51A为将D-乳酸脱氢酶突变体Q51A的编码基因插入pET-28a载体的Hind III和BamH I位点；D-乳酸脱氢酶突变体Q51A的氨基酸序列为将序列2第51位Gln突变为Ala得到的序列；D-乳酸脱氢酶突变体Q51A的编码基因的核苷酸序列为将序列1第151-153位CAG突变为GCA；
点突变重组质粒Y101L为将D-乳酸脱氢酶突变体Y101L的编码基因插入pET-28a载体的Hind III和BamH I位点；D-乳酸脱氢酶突变体Y101L的氨基酸序列为将序列2第101位Tyr突变为Leu得到的序列；D-乳酸脱氢酶突变体Y101L的编码基因的核苷酸序列为将序列1第301-303位TAT突变为CTG得到的序列；
点突变重组质粒F298Y为将D-乳酸脱氢酶突变体F298Y的编码基因插入pET-28a载体的Hind III和BamH I位点；D-乳酸脱氢酶突变体F298Y的氨基酸序列为将序列2第298位Phe突变为Tyr得到的序列；D-乳酸脱氢酶突变体F298Y的编码基因的核苷酸序列为将序列1第893-894位TC突变为AT得到的序列。
点突变重组质粒M307L为将D-乳酸脱氢酶突变体M307L的编码基因插入pET-28a载体的Hind III和BamH I位点；D-乳酸脱氢酶突变体M307L的氨基酸序列为将序列2第307位Met突变为Leu得到的序列；D-乳酸脱氢酶突变体M307L的编码基因的核苷酸序列为将序列1第919位A突变为C得到的序列。
2、重组载体
将744-28a重组载体和上述各点突变重组质粒Q51V、Q51L、Q51A、Y101L、F298Y、M307L分别转入大肠杆菌JM109(DE3)中，得到重组菌JM109(DE3)/744-28a、JM109(DE3)/Q51V、JM109(DE3)/Q51L、JM109(DE3)/Q51A、JM109(DE3)/Y101L、JM109(DE3)/F298Y、JM109(DE3)/M307L。
重组菌JM109(DE3)/744-28a、JM109(DE3)/Q51V、JM109(DE3)/Q51L、JM109(DE3)/Q51A、JM109(DE3)/Y101L、JM109(DE3)/F298Y、JM109(DE3)/M307L分别以1％接种量接种到LB液体培养基中(含40mg/L卡那霉素)，37℃、200r/min振荡培养。当OD600达到0.6时，加入终浓度1mM IPTG，16度诱导过夜。收集菌体，磷酸盐缓冲液重悬，超声破碎细胞，12000×g离心10min，上清过镍柱，用80mM咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，然后用300mM咪唑缓冲液将目的蛋白洗脱下来(选取镍柱的柱高为10cm，直径为1.5cm，流速控制在1ml/min)，脱盐纯化即得到D-乳酸脱氢酶、D-乳酸脱氢酶突变体Q51V、Q51L、Q51A、Y101L、F298Y、M307L。
将上述D-乳酸脱氢酶突变体Q51V、Q51L、Q51A、Y101L、F298Y、M307LSDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，M：蛋白Marker；1-7：DLDH744，Q51V，Q51L，Q51A，Y101F，F298Y，M307L；蛋白的条带大小与预期的37kDa大约一致，可知均表达纯化成功。
表1、定点突变引物序列
标注：下划线表示突变的碱基
实施例2、D-乳酸脱氢酶突变体的酶活测定
D-乳酸脱氢酶突变体酶活测定鉴于辅酶NADH在340nm处有最大吸收峰，通过NADH340nm吸光值的减小速度来定义酶活，具体如下：
苯丙酮酸溶液：用苯丙酮酸和100mmol/L磷酸盐缓冲液(配方：称79g NaCl,2gKCl,2.4g KH2PO4和1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。保存于4℃冰箱中即可。)混匀，得到的溶液，且苯丙酮酸的浓度为200mM；
NADH溶液：用NADH和100mmol/L磷酸盐缓冲液混匀，得到的溶液，且NADH的浓度为NADH。
200μl的反应体系：10μL苯丙酮酸溶液和10μL NADH溶液及适当的酶液(即实施例1制备的D-乳酸脱氢酶及其各个突变体。)。在30℃下反应。根据辅酶NADH在波长340nm时吸光度值的减小速度定义1U酶活单位为：每分钟催化降解1.0μmol辅酶NADH所需要酶量，比活力定义为：每毫克酶蛋白所含的酶活单位数(U/mg)。
以未突变为参照物，计算相对比酶活＝(D-乳酸脱氢酶突变体酶活/野生型D-乳酸脱氢酶酶活)*100％。具体结果见图2，
D-乳酸脱氢酶突变体Q51V的相对比酶活37.2％；
D-乳酸脱氢酶突变体Q51L的相对比酶活107.9％；
D-乳酸脱氢酶突变体Q51A的相对比酶活139.8％；
D-乳酸脱氢酶突变体Y101F的相对比酶活142.4％；
D-乳酸脱氢酶突变体F298Y的相对比酶活48.1％；
D-乳酸脱氢酶突变体M307L的相对比酶活154.3％。
可以看出，D-乳酸脱氢酶突变体Q51A、Y101F、M307L的酶活均比野生型D-乳酸脱氢酶的高，其中Q51A，Y101F，M307L对酶活的提高较为显著，M307L突变体的酶活是野生型D-乳酸脱氢酶的154％；但是D-乳酸脱氢酶突变体Q51V和F298Y却导致酶活的减小和丧失。
因此，D-乳酸脱氢酶突变体M307L为最佳的D-乳酸脱氢酶。
实施例3、D-乳酸脱氢酶突变体M307L全细胞转化反应优化
培养重组菌JM109(DE3)/M307L至指数期，以1％接种量转接到新鲜LB液体培养基，培养基含浓度为40mg/L的卡那霉素，培养至OD600nm达到0.6左右，加入终浓度1mM的IPTG，在16℃下诱导培养16h。4℃，5000r/min离心15min收集菌体，用pH 7.0，50mM的磷酸盐缓冲液洗涤菌体三次，并重悬于不同pH(5.5～8.5)的磷酸盐缓冲液(配方：称79g NaCl,2g KCl,2.4g KH2PO4和1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至5.5～8.5，最后加蒸馏水定容至1L。)中，得到pH值5.5菌体悬液、pH值6菌体悬液、pH值6.5菌体悬液、pH值7菌体悬液、pH值7.5菌体悬液、pH值8菌体悬液、pH值8.5菌体悬液。
1、pH值条件摸索
将不同pH值的菌体悬液(OD600＝60)、60mM PPA和10g/L葡萄糖混匀得到全细胞转化体系，30℃条件下静置反应1.5h。
上述不同pH值的菌体悬液为pH值5.5菌体悬液、pH值6菌体悬液、pH值6.5菌体悬液、pH值7菌体悬液、pH值7.5菌体悬液、pH值8菌体悬液或pH值8.5菌体悬液。
HPLC定量检测PPA，PLA，葡萄糖:PPA和PLA的测定方法：将样品12,000r/min离心20min，上清液用流动相稀释至合适浓度后用0.22μm滤膜过滤至液相小瓶以备检测。采用Agilent 1200液相分析系统，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱(250×4.6mm，5μm)。流动相为1mM H2SO4-乙腈(v/v，85∶15)，流速0.7mL/min，柱温30℃，进样量10μL，紫外检测器检测，检测波长210nm。葡萄糖使用SBA-40D生物传感分析仪定量检测。
结果如图3a所示，可以看出，在pH7.5条件下，PLA的产量最高。
2、葡萄糖浓度摸索
将pH7.5的菌体悬液(OD600＝60)、60mM PPA和不同浓度的葡萄糖(0g/L-10g/L)混匀得到全细胞转化体系，30℃条件下静置反应1.5h，期间定时取样测定底物和产物浓度。
HPLC定量检测PPA，PLA，葡萄糖:PPA和PLA的测定方法：将样品12,000r/min离心20min，上清液用流动相稀释至合适浓度后用0.22μm滤膜过滤至液相小瓶以备检测。采用Agilent 1200液相分析系统，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱(250×4.6mm，5μm)。流动相为1mM H2SO4-乙腈(v/v，85∶15)，流速0.7mL/min，柱温30℃，进样量10μL，紫外检测器检测，检测波长210nm。葡萄糖使用SBA-40D生物传感分析仪定量检测。
30℃条件下静置反应1.5h结果如图3b所示，发现葡萄糖的添加明显提高了PLA的产量，且在5g/L葡萄糖浓度下PLA产量最高，继续添加反而导致产量下降。
因此最适反应条件为pH7.5+5g/L葡萄糖。
3、转化率
采用最适的反应条件进行试验：
pH7.5的菌体悬液(OD600＝60)、60mM PPA和5g/L的葡萄糖混匀得到全细胞转化体系，30℃条件下静置反应。
期间定时取样测定底物和产物浓度结果如图4所示，可以看出，在最适反应条件下，全细胞催化合成苯乳酸，60mM PPA在2h时即完全消耗，转化成了56mM PLA，5g/L葡萄糖也几乎消耗完全。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种蛋白，是序列A所示的蛋白质；
所述序列A为将序列表中序列2第307位Met突变为Leu得到的序列。
2.编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是编码区为序列B所示的DNA分子；
所述序列B为将序列表中序列1第919位A突变为C得到的序列。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将权利要求2或3所述DNA分子通过重组载体导入目的菌中表达权利要求1所述蛋白质的菌。
6.权利要求1所述蛋白在作为D-乳酸脱氢酶中的应用。
7.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4或5所述重组菌在催化苯丙酮酸生成D-苯乳酸中的应用。
8.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4或5所述重组菌在生产苯乳酸或提高苯乳酸产量中的应用。
9.一种催化苯丙酮酸生成D-苯乳酸的方法，包括如下步骤：将权利要求4或5所述重组菌、苯丙酮酸和葡萄糖在反应体系中反应，得到苯乳酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述反应体系的pH值为7.5；
所述反应体系中葡萄糖的含量为5g/L。
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