CN109957602A - 一种nad类似物偏好型氧化还原酶的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体的筛选方法。该方法中以亚磷酸敏感微生物为宿主，构建同时表达NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶和NAD类似物供给功能蛋白的平台菌株；利用编码氧化还原酶突变体过表达系统的DNA样品转化平台菌株细胞，并将转化子在含有亚磷酸的环境中培养，在氧化还原酶突变体能再生NAD类似物的条件下，亚磷酸驱动亚磷酸脱氢酶突变体还原NAD类似物的同时被氧化成磷酸，菌株得以生长，所得生长正常的转化子过表达的氧化还原酶即具备偏好NAD类似物的特性。利用该方法将氧化还原酶突变体对辅因子偏好性和催化效率与细胞生长相偶联，用于高通量筛选表达NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体菌株。

Description

一种NAD类似物偏好型氧化还原酶的筛选方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，旨在提供一种NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)类似物偏好型氧化还原酶的筛选方法，其基本原理是利用NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶耦合氧化还原酶将培养环境中亚磷酸转化为磷酸，从而使亚磷酸敏感微生物宿主细胞得以正常生长，并通过进一步分离鉴定得到NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)及其还原态NAD(P)H是生命过程中重要的辅酶，在细胞的能量代谢，信号传递，生长凋亡等生命过程中起到重要的作用(Ying,W.,et al.Antioxidants&Redox Signaling.2008,10,179)。由于NAD(P)参与胞内的多种氧化还原反应，并且NAD(P)+/NAD(P)H比例决定细胞内糖酵解，三羧酸循环等代谢途径，进而影响细胞生长代谢及代谢物的积累，现阶段通常采用辅因子工程对目标代谢途径进行调控。如，促进NAD(P)再生，增加NAD(P)H的合成，降低NAD(P)H的消耗等。但是，由于NAD(P)是一种通用的辅酶，调控胞内NAD(P)水平或不同氧化还原态往往会对细胞生理及代谢等产生全局性影响，很难实现在辅酶水平对特定的氧化还原途径进行调控。
利用NAD类似物为辅酶，构建依赖于NAD类似物的生物正交氧化还原体系，通过NAD类似物调控氧化还原途径，而不影响其他利用NAD(P)的代谢途径，同样，其他代谢途径中的NAD(P)也不会影响到生物正交代谢途径，实现特异性调控目标代谢网络，并对生物催化和合成生物学具有重要意义。目前已经报道的具有较好生物相容性的NAD类似物有：烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)，烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸(NTD)，烟酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)，烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸(NGD)(Ji,D.,et al.Journal of the American ChemicalSociety.2011,133,20857；赵宗保，王磊，刘武军，一种NAD类似物的还原方法，申请号：201410117146.6)。同时也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如苹果酸酶(ME，GenbankP26616)L310R/Q401C突变体、NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、亚磷酸脱氢酶psPDH(Genbank 069054)L151V/D213Q突变体和rPDH(Genbank AEQ29500)I151R或I151R/E213C突变体。利用不同的NAD类似物偏好型氧化还原酶，可以建立依赖于NAD类似物的生物正交氧化还原体系，用于控制细胞内代谢过程。因此，筛选NAD类似物偏好型氧化还原酶成为构建基于NAD类似物的氧化还原代谢途径和工程菌株的限制性因素。
目前，依赖于NAD类似物的氧化还原酶或NAD类似物合成酶主要通过突变筛选得到。筛选方法主要依赖于酶偶联显色法，将粗酶液与已有的能够识别目标NAD类似物的氧化还原酶进行偶联显色，从而实现对突变文库的筛选(Ji,D.,et al.Journal of theAmerican Chemical Society.2011,133,20857；赵宗保，王雪颖，刘玉雪，酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法，申请号：201510940681.4)。这种筛选方法过程繁琐，筛选周期长，很难实现快速的高通量筛选，而有效的高通量筛选方法如流式细胞仪和微流控技术均尚不能应用于NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体的筛选，因此筛选方法成为筛选NAD类似物偏好型氧化还原酶的主要限制性因素。
利用与细胞生长相偶联的筛选方法可以避免上述缺点。亚磷酸敏感型微生物在含有亚磷酸的环境中不能正常生长，这类微生物对亚磷酸的敏感性表现为以下两种情况：不能以亚磷酸为唯一磷源，或在磷限制条件下亚磷酸抑制依赖于磷酸的代谢途径，从而抑制微生物的生长。以亚磷酸敏感型为宿主，构建同时表达NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶和NAD类似物供给功能蛋白的平台菌株，转化表达氧化还原酶突变体过表达系统的DNA文库到平台菌株，在含有亚磷酸的环境中培养转化子，在氧化还原酶突变体偏好NAD类似物的转化子中，亚磷酸驱动亚磷酸脱氢酶突变体还原NAD类似物的同时被氧化成磷酸，从而起到解除抑制的作用得以使菌株正常生长。利用该方法可以将氧化还原酶识别NAD类似物的能力与细胞生长相偶联，从而实现NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体的快速高通量筛选。
发明内容
本发明的目的是构建一种基于NAD类似物的氧化还原代谢途径和工程菌株的NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体的筛选体系，该筛选体系中以亚磷酸敏感微生物为宿主，构建同时表达NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶和NAD类似物供给功能蛋白的平台菌株。在平台菌株中表达氧化还原酶突变体文库，以亚磷酸为筛选压力，将菌株的生长与氧化还原酶突变体再生NAD类似物的活性相偶联，实现对NAD类似物氧化还原酶突变体的快速筛选。现有NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体的筛选方法过程繁琐，周期长，不能实现突变文库的快速高通量筛选。因此，本发明的方法可应用在辅因子工程和合成生物学等领域，具有重要价值。
本发明中涉及的NAD类似物为NCD、NTD、NUD、和NGD，化学结构如下：
本发明中选择的亚磷酸敏感微生物为在一定浓度亚磷酸存在条件下无法正常生长的微生物，包括原核微生物如基因敲除的大肠杆菌(Jiang,W.H.,et al.Journal ofBacteriology.1995,177,6411；Yang,K.,et al.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America.2004,101,7919)和真核微生物如酿酒酵母(McDonald,A.E.,et al.Canadian Journal of Microbiology.2001,47,969)，衣藻(Loera-Quezada,M.M.,et al.Plant Science.2015,231,124)。
本发明构建的平台菌株中表达的NAD类似物供给功能蛋白为NAD类似物转运蛋白或具有NAD类似物合成能力的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体。NAD类似物转运蛋白是来源于衣原体的NTT4(Haferkamp,I，et al.Nature.2004,432,622)或来源于拟南芥Arabidopsis thaliana的NDT2(Accession No.NC_003070)。烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶NMNAT的突变体包括来源于Francisella tularensis的NadM突变体NadM-H110R/N132Y/F136K、NadM-K112Y/Y133E、来源于大肠杆菌E.coli的NadD突变体NadD-P22G/Y84A/C132P、NadD-L26F/T85G/T174R来源于E.coli的NadR突变体NadR-L83R/I206P和NadR-A87L/S207E。
本发明构建的平台菌株中表达NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶是来源于Ralstonia sp.Strain 4506的rPDH(Genbank AEQ29500)或来源于Pseudomonas stutzeriWM88的psPDH(Genbank 069054)，包括具有不同辅因子偏好性的突变体，如rPDH突变体rPDH-I151R、rPDH-I151R/P176D、rPDH-I151R/M207A和rPDH-I151R/P176Q/M207G，psPDH突变体psPDH-L151R和psPDH-L151R/D213E。
本发明中表达亚磷酸脱氢酶、NAD类似物转运蛋白或烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的基因构建在同一表达载体上，通过RF克隆的方法，将两个基因构建到载体上。在大肠杆菌中的载体为pUC或pK载体(王磊.基于烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的代谢电路研究[博士学位论文].北京：中国科学院大学，2014)，酿酒酵母中所用的表达载体为pESC载体，衣藻的转化载体为pSP108或p105。得到的RF克隆产物经过DpnⅠ消化、转化并菌落PCR鉴定正确后提质粒送测序，测序正确的即为目标载体。其中大肠杆菌表达载体上表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的基因和编码rPDH突变蛋白的基因均由异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子控制，表达转运蛋白的基因由gapA P1启动子控制。酿酒酵母表达载体上表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的基因和编码rPDH突变蛋白的基因分别由半乳糖诱导的GAL1和GAL10启动子控制表达。衣藻中表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的基因和编码rPDH突变蛋白的基因分别由组成型内源启动子RBCS2和Hsp70A-RBCS2融合启动子控制表达。
本发明拟筛选的氧化还原酶为可催化转化还原型辅酶NAD(P)H，生成氧化型辅酶NAD(P)的酶，包括但不局限于NAD(P)H依赖型催化底物还原的酶，如羰基还原酶、还原羧化酶、烯还原酶、氰基还原酶、过氧化物还原酶、氧化还原蛋白还原酶、双加氧酶还原酶，以及NAD(P)H依赖型催化底物氧化的酶，如细胞色素P450氧化还原酶、环氧化酶、Bayer-Villinger氧化酶。
其中，NAD(P)H依赖型催化底物还原的酶，如E.coli来源的苹果酸酶(ME，GenbankP26616)、Lactobacillus helveticus来源的D-乳酸脱氢酶(DLDH，Genbank CAA47255)、Pseudomonas putida来源的β-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR，Genbank CP000712)、Pseudomonas putida来源的过氧氢化脂肪酸还原酶(HFAR，NCBI NC_002947.4)、E.coli来源的铁-硫蛋白还原酶(FPR，NCBI NC_000913.3)、Pseudomonas putida来源的甲苯-2,3-双加氧酶还原酶(TDOR，Genbank J04996.1)、Vibrio cholerae来源的7-氰基-7-碳鸟嘌呤还原酶(QueF，NCBI NC_002505.1)。ME是联系糖酵解途径和三羧酸循环的关键酶，能固定CO2与丙酮酸反应产生苹果酸，同时消耗NAD(P)H。DLDH以丙酮酸为底物，氧化NADH同时生成终产物D-乳酸。HMGR是通过甲羟戊酸途径合成异戊二烯焦磷酸过程中的限速酶，以NADPH为辅酶还原β-羟甲基戊二酰辅酶A。HFAR依赖于NADPH还原过氧氢化脂肪酸生成羟化脂肪酸，从而保护细胞免受脂质过氧化。FPR在细菌中可依赖于NADPH还原铁氧化还原蛋白和核黄素氧还蛋白。TDOR依赖于NADH，与铁氧还蛋白复合物催化底物甲苯进行双加氧反应。QueF依赖于NADPH，将底物7-氰基-7-碳鸟嘌呤的氰基还原为氨基，最终生成7-氨甲基-7-碳鸟嘌呤。
NAD(P)H依赖型催化底物氧化的酶，如Bacillus megaterium来源的细胞色素P450单加氧酶(P450BM3，GenBank J04832.1)、Thermocrispum municipale DSM44069来源的环己烷酮单加氧酶(CHMO，NCBI WP_028849141.1)、Pseudomonas putida来源的苯乙烯单加氧酶(StyAB，GenBank:ABX24519.1)。P450BM3依赖于NADPH和FAD，催化脂肪酸发生羟基化反应。CHMO依赖于NADPH和FAD，以环己烷酮为底物氧化生成脂。StyAB依赖于NADH和FAD，催化底物苯乙烯、吲哚或茚的单加氧反应，生成苯乙烯氧化物、靛蓝或茚氧化物。
本发明所述氧化还原酶突变体表达系统，为携带氧化还原酶突变体编码基因的表达载体或表达盒中的一种或两种，其在宿主细胞中存在能使细胞产生相应的氧化还原酶突变体蛋白。采用文献中的方法构建不同氧化还原酶突变体表达系统(赵宗保，王雪颖，刘玉雪，酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法，申请号：201510940681.4)，在表达偏好NAD类似物的亚磷酸脱氢酶突变体以及含有NAD类似物的工程菌中，转化氧化还原酶的突变载体文库，转化子在筛选平板上或将转化子接到液体培养基中进行筛选，通过挑选生长状况良好的克隆，获得偏好NAD类似物的氧化还原酶突变体。
本发明中使用的亚磷酸化合物为亚磷酸盐的混合物，为亚磷酸钠或亚磷酸钾盐，浓度为1.0mM-500mM，按浓度需要添加到固体培养基或液体培养基中制备筛选培养基。
本发明中所得NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体，应用于构建基于NAD类似物的氧化还原代谢途径和工程菌株。
本技术发明，具有很好的通用性和适应性。采用本发明，可快速测试氧化还原酶对NAD类似物的偏好性，免除逐一纯化酶的繁琐操作，节约时间和经济陈本。更重要的是，可构建氧化还原酶突变体表达文库，进而筛选得到NAD类似物偏好的氧化还原酶突变体，为代谢工程、合成生物学和先进微生物细胞工厂构建提供新的功能元件。
附图说明
图1NAD类似物偏好型氧化还原酶的筛选原理。其中烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)是NAD的一种类似物，NMNAT*是烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，rPDH*是依赖于NCD的亚磷酸脱氢酶突变体。在体系中，亚磷酸对细胞生长产生抑制作用，在胞内由NMNAT*合成的NCD在亚磷酸的驱动下由rPDH*还原，当氧化还原酶能够氧化NCDH时，依赖于NCD的氧化还原体系能够进行，推动rPDH*氧化亚磷酸的反应，从而降低环境中亚磷酸浓度同时产生磷酸，促进细胞的生长。根据细胞生长状况，可筛选能够偏好NAD类似物的的氧化还原酶突变体。
图2工程菌YX01和对照菌YX001在不同浓度亚磷酸钾条件下的生长状况。工程菌YX01携带NCD偏好型的苹果酸酶突变体、亚磷酸脱氢酶突变体和能够胞内合成NCD的烟酰胺腺苷转移酶突变体的表达基因，工程菌YX001携带野生型苹果酸酶、NCD偏好型亚磷酸脱氢酶突变体和能够胞内合成NCD的烟酰胺腺苷转移酶突变体的表达基因。图为工程菌YX01和对照菌YX001分别在含有30mM或80mM亚磷酸钾的MOPS培养基中的生长曲线。
具体实施方式
以下实施例可以进一步阐明本发明，通过参考以下的实施例将更容易理解本发明。这些实施例仅用于示例性说明，但不局限于本发明的内容。
本发明中，使用的NAD类似物参照文献方法(D.Ji,et al.Journal of theAmerican Chemical Society.2011,133,20857)制备。
本发明中，大肠杆菌转化的方法参照《分子克隆指南》中电转化的方法，酿酒酵母转化的方法参照文献(Gietz,R.D.,et al.Nature Protocols.2007,2,31)中醋酸锂转化方法。衣藻的转化方法参照文献(王双辉,等.四川大学学报.2016,53,695)中玻璃珠法转化。
对比实施例1：大肠杆菌中验证NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体筛选体系
在同时表达NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶和NAD类似物供给功能蛋白的平台菌株中，转化表达氧化还原酶突变体的文库，当氧化还原酶偏好NAD类似物时胞内能够形成依赖NAD类似物的生物正交体系。在含有亚磷酸的培养环境中，亚磷酸对微生物的生长产生抑制作用，依赖于NAD类似物的生物正交体系在NAD类似物的驱动下促进亚磷酸脱氢酶突变体氧化亚磷酸产生磷酸，从而解除亚磷酸对微生物生长的抑制作用，将菌株的生长与氧化还原酶突变对NAD类似物的活性相偶联，实现对氧化还原酶突变体的筛选。以NCD和E.coli来源的苹果酸酶ME为例，说明大肠杆菌中NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体的筛选体系。
通过RF克隆，将编码偏好NAD类似物NCD的苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C、NCD偏好型亚磷酸脱氢酶突变体rPDH-I151R/P176Q/M207G和能够胞内合成NCD的烟酰胺腺苷转移酶突变体NadM-H110R/N132Y/F136K的三个基因克隆到pK载体上，获得目标载体pK01。同时构建表达野生型苹果酸酶ME-WT、rPDH-I151R/P176Q/M207G和NadM-H110R/N132Y/F136K的载体pK001。
将以上两个表达三种蛋白的目标载体pK01和pK001分别转化到E.coli BW14329获得工程菌株E.coli YX01和对照菌株YX001。参照文献(Frederick,C.,et al.Journal ofBacteriology.1974,119,736)中的配方配制MOPS培养基。挑工程菌YX01和对照菌YX001的单菌落，分别接种于50mL离心管中的5mL LB液体培养基(含卡那霉素50ng/μL和IPTG0.1mM)中，37℃200rpm培养16h，用紫外分光光度计测量菌液的OD600，分别离心收集菌体，用MOPS液体培养基洗涤并重悬菌体，将重悬菌分别接种到含有30mM或80mM亚磷酸钾的MOPS培养基中，接种后初始OD600约为0.15，于30℃200rpm条件下培养，全自动生长曲线测定仪分析工程菌YX01和对照菌YX001在不同浓度亚磷酸钾条件下的生长状况。
结果如图2，在含有亚磷酸的MOPS培养基中，同时表达ME-L310R/Q401C、rPDH-I151R/P176Q/M207G和NadM-H110R/N132Y/F136K三种蛋白的工程菌株YX01生长速率明显大于表达野生型苹果酸酶的对照菌YX001的生长速率。
对比实施例2：酿酒酵母中验证NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体筛选体系
以NCD和E.coli来源的苹果酸酶ME为例，说明以酿酒酵母为宿主NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体的筛选体系。
参照对比实施例1的方法，通过RF克隆，将编码偏好NAD类似物NCD的ME-L310R/Q401C、rPDH-I151R和NadM-H110R/N132Y/F136K的三个基因克隆到同一pESC-His载体上，获得目标载体。同时构建表达rPDH-I151R和NadM-H110R/N132Y/F136K的载体。
将表达三种蛋白的目标载体转化到S.cerevisiae BY4741获得工程菌株S.cerevisiae YX02，表达两种蛋白的载体转化到BY4741获得对照菌株YX002。配制SD合成培养基，培养基组成为20g/L半乳糖，5g/L(NH4)2SO4，0.64g/L K2SO4，0.94g/L Na2SO4，1.5g/L MgSO4.7H2O，按筛选需要添加氨基酸，包括100mg/L亮氨酸、20mg/L甲硫氨酸和20mg/L尿嘧啶，同时添加1mM的亚磷酸钠或磷酸钠。挑工程菌和对照菌的单菌落，分别接种于50mL离心管中的5mL含1mM磷酸钠的SD液体培养基中，30℃200rpm培养24h，用紫外分光光度计测量菌液的OD600，分别离心收集菌体，用无磷SD液体培养基洗涤并重悬菌体。将重悬的菌液分别接种到50mL含不同浓度亚磷酸钠的SD液体培养基中，控制接种后初始OD600为0.2。30℃200rpm条件下培养，分别在0h、12h、24h和36h测量菌液的OD600，对比工程菌YX02和对照菌YX002在不同浓度亚磷酸钠条件下的生长状况。
仅以亚磷酸钠为磷源的培养基中，工程菌YX02生长明显优于对照菌YX002。
表1.工程菌在含有亚磷酸钾MOPS培养基中生长实验结果
对比实施例3：衣藻中验证NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体筛选体系。
以NCD和E.coli来源的苹果酸酶ME为例，说明以衣藻为宿主NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体的筛选体系。
参照对比实施例1的方法，通过RF克隆，将编码偏好NAD类似物NCD的苹果酸酶突变体ME-L310R/Q401C、rPDH-I151R/P176Q/M207G和NadD-P22G/Y84A/C132P的三个基因克隆到同一pSP108载体上，获得目标载体。同时构建携带编码rPDH-I151R/P176Q/M207G和NadD-P22G/Y84A/C132P的两个基因的载体。
参照文献(王双辉,等.四川大学学报.2016,53,695)中方法配制TAP(tris-acetate-phosphate)培养基，与之不同的是添加的磷为20mM的磷酸钾或亚磷酸钾。运用玻璃珠法将表达三种蛋白的目标载体转化到莱茵衣藻细胞壁缺陷型菌株CC-400，TAP筛选平板(含20mM磷酸钾和20mg/L抗生素Zeocin)上获得工程藻株CC-400YX03，表达两种蛋白的载体转化到CC-400获得对照藻株。挑选基因型正确的工程藻株和对照藻株的单克隆，接种于50mL离心管的5mL TAP液体培养基(含1mM磷酸钾和20mg/L抗生素Zeocin)中，30℃110rpm光照培养3天，测量藻液OD750，离心收集藻体，用TA液体培养基(无磷源)洗涤并重悬藻体，将重悬藻液分别接种到50mL含20mM亚磷酸钾的TAP液体培养基或含20mM磷酸钾的TAP液体培养基中，控制接种后初始OD750为0.02。28℃110rpm光照培养6天，培养结束后分别测量培养液的OD750。
表达三种蛋白的工程藻株YX03在含有磷酸钾的TAP培养基和亚磷酸钾的TAP培养基中，菌液的终OD750为0.63和0.58；不表达偏好NCD的苹果酸酶的对照藻株在含有磷酸钾的TAP培养基和亚磷酸钾的TAP培养基中，菌液的终OD750为0.65和0.23。
实施例1：在大肠杆菌中筛选NCD偏好型羰基还原酶突变体的应用
在亚磷酸的培养环境中，同时表达NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶和NAD类似物供给功能蛋白的平台菌株不能正常生长。在平台菌株中，转化表达氧化还原酶的突变载体文库，转化子在含有亚磷酸化合物的筛选平板上进行筛选，通过挑选生长状况良好的克隆，获得NAD类似物偏好型的氧化还原酶突变体。以来源于Lactobacillus helveticus的D-乳酸脱氢酶DLDH为例，说明利用该筛选体系在大肠杆菌中筛选NCD偏好型的羰基还原酶突变体。
通过RF克隆，构建表达NAD类似物转运蛋白NTT4和rPDH-I151R/P176Q/M207G的pUC载体，NTT4和rPDH-I151R/P176Q/M207G表达基因分别由表达基因由gapA P1和lac启动子控制表达。将目标载体转化到E.coli BW25141获得平台菌株E.coli YX04。
采用文献中的方法对DLDH进行结构模拟，经过晶体结构分析，选取辅因子周围的氨基酸为目标突变位点V152、D176、I177、H206、P208、V210、N213构建DLDH突变体表达系统(赵宗保，王雪颖，刘玉雪，酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法，申请号：201510940681.4)，该突变体表达系统基于pK载体，包括编码DLDH D176位插入突变体、V152/I177和V152/P208双位点饱和突变体以及V152/H206/V210/N213多位点大侧链氨基酸突变体等的载体。将突变体表达系统转化到平台菌株YX04中，在含5mM亚磷酸钾的M9筛选平板(含卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL、IPTG 0.2mM和NCD 0.1mM)上对转化子进行筛选，筛选平板在30℃恒温培养3天，在转化筛选过程中以DLDH野生型为对照。结果野生型在筛选平板上没有转化子长出，在V152/I177和V152/P208双位点文库中长出转化子。
挑选在筛选平板上生长出的转化子进行复筛验证。复筛验证方法如下，将挑选出的转化子分别接到3mL含5mM磷酸钾的M9培养基(含卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL、IPTG 0.2mM和NCD 0.1mM)中，用24深孔板在30℃200rpm条件下培养20h。培养结束后测量菌液的OD600，离心收集菌体，分别用无磷M9液体培养基洗涤并重悬菌体，将重悬菌液稀释到OD600为10-4。分别取2μL稀释后的菌液，点到含5mM亚磷酸钾和0.1mM NCD的M9筛选平板上，筛选平板在30℃恒温培养48h，所有菌株均能正常生长。
生长较好的菌株进行验证并提质粒测序，获得偏好NCD的DLDH-V152R/I177R突变体。
实施例2：在大肠杆菌中筛选NUD偏好型烯还原酶突变体的应用
以来源于Pseudomonas putida的β-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR为例，说明利用该筛选体系在大肠杆菌中筛选NUD偏好型的烯还原酶突变体。
通过RF克隆，构建表达能够胞内合成NUD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶NadD-L26F/T85G/T174R和NUD偏好型亚磷酸脱氢酶psPDH-L151R/D213E的pUC载体，将目标载体转化到E.coli DH10B获得平台菌株E.coli YX05。
参照实施例1的方法，构建HMGR突变体表达系统。该系统基于pK载体，包括编码HMGR G186/V328、L184/G186双位点突变体和L184/G186/V328大侧链氨基酸突变体等的载体。将突变体表达系统转化到平台菌株YX05中，在含500mM亚磷酸钾的LB筛选平板(含卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL和IPTG 0.2mM)上对转化子进行筛选，筛选平板在30℃恒温培养3天，在转化筛选过程中以HMGR野生型为对照。野生型和L184/G186双位点文库在筛选平板上没有转化子长出，G186/V328双位点突变体和L184/G186/V328大侧链氨基酸突变体文库长出转化子。
挑选在筛选平板上生长较快的转化子进行复筛验证，复筛验证方法参照实施例1，与之不同的是24孔板培养时所用的培养基为LB液体培养基(含卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL和IPTG 0.2mM)，测OD600后直接稀释并点到含500mM亚磷酸钾的LB筛选平板上，筛选平板在30℃恒温培养48h，所验证的人菌株均能正常生长。
生长较好的菌株进行验证并提质粒测序，获得偏好NUD的HMGR-G186R/V328E和HMGR-L184W/G186R/V328D突变体。
实施例3：在大肠杆菌中筛选NGD偏好型还原羧化酶突变体的应用
以来源于E.coli的苹果酸酶ME为例，说明利用该筛选体系在大肠杆菌中筛选NGD偏好型的还原羧化酶突变体。
通过RF克隆，构建表达NAD类似物转运蛋白AtNDT2和NGD偏好型亚磷酸脱氢酶rPDH-I151R/M207A的pUC载体，将目标载体转化到E.coli BW25113获得平台菌株E.coliYX06。
参照实施例1的方法，构建ME突变体表达系统。该系统基于pK载体，包括编码MEI151、L310、Q401单位点突变体、I151/L310及I151/Q401双位点突变体和I151/L310/Q401三位点突变体等的载体。将突变体表达系统转化到平台菌株YX06中，在含400mM亚磷酸钾和0.1mM NGD的MOPS筛选平板(含卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL和IPTG 0.2mM)上对转化子进行筛选，筛选平板在30℃恒温培养3天，在转化筛选过程中以ME野生型为对照。野生型、I151和L310单位点文库、双位点文库以及三位点文库在筛选平板上均没有转化子长出，Q401单位点文库中长出转化子。
挑选在筛选平板上生长的转化子进行复筛验证。复筛验证方法如下，将挑选出的转化子分别接到100μL含400mM亚磷酸钾和0.1mM NGD的MOPS培养基(含卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL和IPTG 0.2mM)中，用Bioscreen全自动生长曲线分析仪在30℃条件下振荡培养，并分析不同转化子的生长曲线，3株菌在24h之内达到稳定期，将该3株菌进行验证并提质粒测序，获得偏好NGD的ME-Q401D和ME-Q401E突变体。
实施例4：在酿酒酵母中筛选NCD偏好型氨基酸脱氢酶突变体的应用
以来源于Mycobacterium tuberculosis的丙氨酸脱氢酶AlaDH为例，说明利用该筛选体系在酿酒酵母中筛选NCD偏好型的氨基酸脱氢酶突变体。
通过RF克隆，构建表达NCD偏好型突变蛋白rPDH-I151R/P176Q/M207G和NadM-H110R/N132Y/F136K在酿酒酵母中的pESC-His表达载体，将目标载体转化到S.cerevisiaeBY4741获得平台菌株S.cerevisiae YX07。
参照实施例1的方法，构建AlaDH突变体表达系统。该系统基于pESC-Ura载体，包括编码AlaDH I174/I199/S220/L249多位点突变体和I174/I199/P247三位点大侧链氨基酸突变体等的载体，将突变体表达系统转化到平台菌株YX06中，在以50mM亚磷酸钾为唯一磷源的SD筛选平板上对转化子进行筛选，筛选平板在25℃恒温培养6天，在转化筛选过程中以AlaDH野生型为对照。野生型和I174/I199/S220/L249多位点饱和突变体文库在筛选平板上均没有转化子长出，I174/I199/P247三位点大侧链氨基酸突变体文库中长出转化子。
挑选在筛选平板上生长出的转化子进行复筛验证，复筛验证方法参照实施例1，与之不同的是24孔板培养时所用的培养基为以50mM磷酸钾为唯一磷源的SD液体培养基(半乳糖20g/L，100mg/L亮氨酸和20mg/L甲硫氨酸)，培养结束后用无磷的SD液体培养基洗涤并重悬菌体，将2μL稀释到OD600为10-4的菌液点到以150mM亚磷酸钾为唯一磷源的SD筛选平板上，筛选平板在30℃恒温培养96h，突变菌株正常生长。将生长的菌株进行验证并提质粒测序，获得偏好NCD的AlaDH-I174R/I199R/P247E突变体。
实施例5：在衣藻中筛选NCD偏好型细胞色素P450氧化还原酶突变体的应用
以来源于Bacillus megaterium的细胞色素P450单加氧酶P450BM3为例，说明利用该筛选体系在酿酒酵母中筛选NTD偏好型的细胞色素P450氧化还原酶突变体。
将对比实施例3中构建的能够表达rPDH-I151R/P176Q/M207G和NadD-P22G/Y84A/C132P的平台藻株命名为CC-400YX08。采用RF克隆技术，在E.coli DH10B中构建P450BM3突变体表达系统。该系统基于pSP108载体，包括编码P450BM3V901/T974和T974/W1046双位点突变体、V901/R966/W1046三位点突变体和V901/R966/T974/W1046大侧链氨基酸突变体等的载体，提取突变体表达系统并转化到平台菌株YX08中，在以200mM亚磷酸钾为唯一磷源并添加10mM月桂酸的TAP筛选平板(含20mg/L抗生素Zeocin)筛选转化子，筛选平板在28℃恒温光照培养10天，在转化筛选过程中以P450BM3野生型为对照。野生型、双位点和三位点突变体文库在筛选平板上没有转化子长出，V901/R966/T974/W1046大侧链氨基酸突变体文库中长出转化子。
挑选在筛选平板上生长的转化子进行复筛验证，复筛验证方法参照实施例3，与之不同的是所用的培养基是以200mM亚磷酸钾为唯一磷源并添加10mM月桂酸的TAP液体培养基含20mg/L抗生素Zeocin)，在28℃110rpm条件下光照培养，每12h用酶标扫描仪测转化子的OD750。培养96h后，生长最快的转化子OD750达到1.7，提取其基因组并扩增突变的P450BM3基因，通过将基因克隆到pUC载体上测序，获得偏好NCD的P450BM3-V901R/R966D/T974R/W1046S突变体。
实施例6：在大肠杆菌中筛选NCD偏好型Bayer-Villinger氧化酶突变体的应用
以来源于Thermocrispum municipale DSM 44069的环己烷酮单加氧酶CHMO为例，说明利用该筛选体系在大肠杆菌中筛选NCD偏好型的Bayer-Villinger氧化酶突变体。
通过RF克隆技术，构建表达能够胞内合成NCD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体NadD-P22G/Y84A/C132P和NCD偏好型亚磷酸脱氢酶psPDH-L151R/D213E的pUC载体，将目标载体转化到E.coli BW25141获得平台菌株E.coli YX09。
参照实施例1的方法，构建CHMO突变体表达系统。该系统基于pK载体，包括编码CHMO P152/I184/T210三位点突变体和P152/I184/T210/P354大侧链氨基酸突变体等的载体，将突变体表达系统转化到平台菌株YX09中，在含80mM亚磷酸钾和10mM环己烷酮的MOPS培养基筛选平板(含卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL和IPTG 0.2mM)上对转化子进行筛选，筛选平板在30℃恒温培养3天，在转化筛选过程中以CHMO野生型为对照。野生型和四个位点的大侧链氨基酸突变体文库在筛选平板上没有转化子长出，P152/I184/T210三位点突变体文库中长出转化子。
挑选在筛选平板上生长的转化子进行复筛验证。复筛验证方法参照实施例1，与之不同的是24孔板培养时所用的培养基为含80mM亚磷酸钾的MOPS液体培养基(含卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL和IPTG 0.2mM)，测量菌液的OD600后别用无磷MOPS液体培养基洗涤、重悬并稀释菌体，取2μL稀释到OD600为10-4的菌液点到含10mM亚磷酸钾和10mM环己烷酮的MOPS培养基筛选平板上，筛选平板在30℃恒温培养48h，突变菌株均能够正常生长。将突变菌株进行验证并提质粒测序，获得偏好NCD的CHMO-P152R/I184R/T210R突变体。
实施例7：在大肠杆菌中筛选NCD偏好型氧化还原蛋白还原酶突变体的应用
以来源于E.coli的铁-硫蛋白还原酶FPR为例，说明利用该筛选体系在大肠杆菌中筛选NCD偏好型的氧化还原蛋白还原酶突变体。
参照实施例1的方法，构建FPR突变体表达系统。该系统基于pK载体，包括编码FPRT123/S182双位点突变体、S182/N223/M226三位点突变体和T123/S182/N223/M226大侧链氨基酸突变体等的载体，将突变体表达系统转化到平台菌株YX09中，在含150mM亚磷酸钾的MOPS培养基筛选平板(含卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL和IPTG 0.2mM)上对转化子进行筛选，筛选平板在30℃恒温培养3天，在转化筛选过程中以FPR野生型为对照。野生型、三位点突变体文库和四个位点的大侧链氨基酸突变体文库在筛选平板上没有转化子长出，T123/S182双位点突变体文库中长出转化子。
挑选在筛选平板上生长的转化子进行复筛验证。复筛验证方法参照实施例1，与之不同的是24孔板培养时所用的培养基为含150mM亚磷酸钾的MOPS液体培养基(含卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL和IPTG 0.2mM)，测量菌液的OD600后别用无磷MOPS液体培养基洗涤、重悬并稀释菌体，取2μL稀释到OD600为10-4的菌液点到含200mM亚磷酸钾的MOPS培养基筛选平板上，筛选平板在30℃恒温培养48h，突变菌株均能够正常生长。将突变菌株进行验证并提质粒测序，获得偏好NCD的FPR-T123R/S182R突变体。
实施例8：在大肠杆菌中筛选NCD偏好型双加氧酶还原酶突变体的应用
以来源于Pseudomonas putida的甲苯-2,3-双加氧酶还原酶TDOR为例，说明利用该筛选体系在大肠杆菌中筛选NCD偏好型的双加氧酶还原酶突变体。
通过RF克隆技术，构建表达能够胞内合成NCD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体NadD-P22G/Y84A/C132P、NCD偏好型亚磷酸脱氢酶psPDH-L151R/D213E和甲苯-2,3-双加氧酶的pUC载体，将目标载体转化到E.coli BW14329获得平台菌株E.coli YX10。
参照实施例1的方法，构建TDOR突变体表达系统。该系统基于pK载体，包括编码TDOR M144/V149、M144/A174双位点突变体和M144/V149/A174三位点大侧链氨基酸突变体等的载体，将突变体表达系统转化到平台菌株YX10中，在含120mM亚磷酸钾的M9培养基筛选平板(含甲苯10mM、卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL和IPTG 0.2mM)上对转化子进行筛选，筛选平板在30℃恒温培养3天，在转化筛选过程中以TDOR野生型为对照。野生型和双位点突变体文库在筛选平板上没有转化子长出，M144/V149/A174三位点大侧链氨基酸突变体文库中长出转化子。
挑选在筛选平板上生长的转化子进行复筛验证。复筛验证方法参照实施例3，与之不同的是筛选所用培养基为含120mM亚磷酸钾和5mM甲苯的M9培养基(含甲苯10mM、卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL和IPTG 0.2mM)中，用96孔板在30℃200rpm条件下培养，全自动生长曲线分析仪分析不同转化子的生长曲线。挑选48h生长达到稳定期的突变菌株进行验证并提质粒测序，获得偏好NCD的TDOR-M144E/V149R/A174R突变体。
实施例9：在大肠杆菌中筛选NUD偏好型氰基还原酶突变体的应用
以来源于Vibrio cholerae的7-氰基-7-碳鸟嘌呤还原酶QueF为例，说明利用该筛选体系在大肠杆菌中筛选NUD偏好型的氰基还原酶突变体。
将实施例2中构建的能够胞内合成NUD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶NadD-L26F/T85G/T174R和NUD偏好型亚磷酸脱氢酶psPDH-L151R/D213E的pUC载体转化到E.coliBW14329获得平台菌株E.coli YX11。
参照实施例1的方法，构建QueF突变体表达系统。该系统基于pK载体，包括编码QueF K96/L262/G263、K96/T197/L262三位点突变体和K96/T197/L262/G263大侧链氨基酸突变体等的载体，将突变体表达系统转化到平台菌株YX11中，在含60mM亚磷酸钾的MOPS筛选平板(含卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL和IPTG 0.2mM)上对转化子进行筛选，筛选平板在30℃恒温培养3天，在转化筛选过程中以ME野生型为对照。野生型、K96/T197/L262三位点突变体和四位点大侧链氨基酸突变体文库在筛选平板上没有转化子长出，K96/L262/G263三位点突变体文库中长出转化子。
挑选在筛选平板上生长的转化子进行复筛验证。复筛验证方法参照实施例3，与之不同的是筛选所用培养基为含60mM亚磷酸钾的MOPS培养基，用96孔板在30℃200rpm条件下培养，全自动生长曲线分析仪分析不同转化子的生长曲线。挑选48h生长达到稳定期的突变菌株进行验证并提质粒测序，获得偏好NUD的QueF-K96R/L262E/G263R突变体。
实施例10：在大肠杆菌中筛选NCD偏好型环氧化酶突变体的应用
以来源于Pseudomonas putida的苯乙烯单加氧酶StyAB为例，说明利用该筛选体系在大肠杆菌中筛选NCD偏好型的环氧化酶突变体。
参照实施例1的方法，构建StyAB突变体表达系统。该系统基于pK载体，包括编码StyAB V8/A123、V8/Y146双位点突变体、V8/A123/S125三位点突变体和V8/A123/S125/Y146大侧链氨基酸突变体等的载体，将突变体表达系统转化到平台菌株YX09中，在含100mM亚磷酸钠的M9培养基筛选平板(含吲哚10mM、卡那青霉素50ng/μL、氨苄霉素100ng/μL和IPTG0.2mM)上对转化子进行筛选，筛选平板在30℃恒温培养3天，在转化筛选过程中以StyAB野生型为对照。野生型、V8/A123双位点突变体、V8/A123/S125三位点突变体和四位点大侧链氨基酸突变体文库在筛选平板上没有转化子长出，V8/Y146双位点突变体文库中长出转化子且转化子呈蓝色。
挑选在筛选平板上生长并且变蓝的转化子进行复筛验证。复筛验证方法参照实施例3，与之不同的是筛选所用培养基为含100mM亚磷酸钾和10mM苯乙烯的M9培养基，在30℃条件下用Bioscreen分析不同转化子的生长曲线。有突变菌株在48h时生长达到稳定期，对其进行验证并提质粒测序，获得偏好NCD的StyAB-V8R/Y146E突变体。
实施例11：氧化还原酶突变体在构建基于NAD类似物的氧化还原代谢途径和工程菌株方面应用
以NUD偏好型HMGR突变体和酿酒酵母为例，说明筛选到的氧化还原酶突变体在构建基于NAD类似物的氧化还原代谢途径和工程菌株方面的应用。
通过RF克隆，构建表达能够胞内合成NUD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶NadD-L26F/T85G/T174R和NUD偏好型亚磷酸脱氢酶psPDH-L151R/D213E的pESC-His表达载体。在文献报道的载体YJ20(Zhou,Y.,et al.Journal of the American ChemicalSociety.2012,134,3234)的基础上，用NUD偏好型HMGR-L184W/G186R/V328D或野生型HMGR替换野生型的tHMGR1，其他基因保持不变，获得载体pYX212-YX12和pYX212-YX13。将pESC-His和pYX212两个载体同时转化到BY4741中，构建工程菌株S.cerevisiae YX12和对照菌YX13。两株菌接种到含有不同浓度亚磷酸钾的SD(20g/L葡萄糖，6.7g/L YNB，100mg/L亮氨酸、20mg/L甲硫氨酸)液体培养基中，30℃200rpm条件下培养72h，根据文献方法分别提取并检测次丹参酮二烯。
表达野生型HMGR的对照菌YX14能够利用NAD(H)积累次丹参酮二烯，工程菌YX12在含有亚磷酸的条件下能够在NUD(H)的驱动下积累次丹参酮二烯，且得率能够达到对照菌YX13的75％。而在不含亚磷酸的条件下，工程菌YX13几乎不积累次丹参酮二烯。结果说明，利用NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体构建的基于NAD类似物的氧化还原代谢途径和工程菌株能够很好的应用。
表2.工程菌YX12和YX13在不同条件下次丹参酮二烯的产量

Claims (9)

1.一种NAD类似物偏好型氧化还原酶的筛选方法，其特征在于：以亚磷酸敏感微生物为宿主，构建同时表达NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶和NAD类似物供给功能蛋白的平台菌株；利用氧化还原酶突变体表达系统转化平台菌株细胞，并将转化子在含有亚磷酸的环境中培养，所得生长正常的转化子过表达的氧化还原酶即具备识别NAD类似物的特性。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述NAD类似物为烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸，烟酰胺尿嘧啶二核苷酸，或烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸中的一种或两种以上。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述亚磷酸敏感微生物为在不能代谢亚磷酸的微生物，包括原核微生物大肠杆菌，真核微生物为酿酒酵母、衣藻中的一种或两种。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述亚磷酸化合物浓度为1.0mM-500mM。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述NAD类似物供给功能蛋白为NAD类似物转运蛋白或具有NAD类似物合成能力的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体；
所述NAD类似物转运蛋白为具备将NAD类似物转运至胞内的活性蛋白，包括衣原体来源的NAD转运蛋白NTT4或拟南芥来源的NAD转运蛋白AtNDT4中的一种或两种；
所述具有NAD类似物合成能力的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，包括来源于Francisella tularensis的NadM突变体NadM-H110R/N132Y/F136K，NadM-K112Y/Y133E，来源于E.coli的NadD突变体NadD-P22G/Y84A/C132D，NadD-L26F/T85G/T174V，来源于E.coli的NadR突变体NadR-L83R/I206P或NadR-A87L/S207E中的一种或两种以上。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述NAD类似物偏好型亚磷酸脱氢酶为野生亚磷酸脱氢酶经基因工程突变得到的突变体，包括来源于Ralstonia sp.Strain 4506的亚磷酸脱氢酶rPDH突变体rPDH-I151R，rPDH-I151R/P176D，rPDH-I151R/M207A，rPDH-I151R/P176Q/M207G，来源于Pseudomonas stutzeri WM88亚磷酸脱氢酶psPDH的突变体psPDH-L151R或psPDH-L151R/D213E中的一种或两种以上。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述的氧化还原酶为可催化转化还原型辅酶NADH或NADPH，生成氧化型辅酶NAD或NADP的酶，包括但不局限于NADH或NADPH依赖型催化底物还原的酶，羰基还原酶，氧化还原蛋白还原酶，还原羧化酶，氰基或过氧化物还原酶；NADH或NADPH依赖型催化底物氧化的单加氧酶；
羰基还原酶包括但不局限于乳酸脱氢酶，β-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶；还原羧化酶为苹果酸酶；氰基还原酶为7-氰基-7-碳鸟嘌呤还原酶，过氧化物还原酶为过氧氢化脂肪酸还原酶；氧化还原蛋白还原酶包括但不局限于铁-硫蛋白还原酶，甲苯-2,3-双加氧酶还原酶；单加氧酶包括但不局限于细胞色素P450单加氧酶P450BM3，苯乙烯单加氧酶或环己烷酮单加氧酶。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述氧化还原酶突变体表达系统，为携带氧化还原酶突变体编码基因的表达载体或表达盒中的一种或两种；
氧化还原酶突变体包括但不局限于乳酸脱氢酶V152X/I177X，β-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶G186X/V328X，P450单加氧酶P450BM3V901X/R966X/T974X/W1046X，苹果酸酶Q401X，过氧氢化脂肪酸还原酶G21X/V133X，苯乙烯单加氧酶P152X/I184X/T210X，铁-硫蛋白还原酶S182X/N223X/M226X，甲苯-2,3-双加氧酶还原酶M144X/V149X，X为20种常见氨基酸的任何一种。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所得NAD类似物偏好型氧化还原酶突变体，应用于构建基于NAD类似物的氧化还原代谢途径和工程菌株。
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