CN106884029A - 酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法 - Google Patents

酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法及其应用。利用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体为催化剂，催化烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸耦合反应，制备烟酰胺胞嘧啶二核苷酸。在微生物细胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的编码基因，工程菌利用内源代谢物合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，并且胞内烟酰胺胞嘧啶二核苷酸可作为辅酶，选择性介导氧化还原反应，提高目标代谢产物产量。在一个典型实例中，苹果酸产量提高了30％。

Description

酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(nicotinamide cytosine dinucleotide，NCD)的方法及其应用，在微生物细胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的编码基因，工程菌利用内源代谢物合成NCD，并且胞内NCD可作为辅酶，选择性介导氧化还原反应，提高目标代谢产物产量。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其还原态(NADH)在细胞繁殖，生长，分化，凋亡等生命活动中都起着非常重要的作用(W.Ying,et al.Antioxidants&RedoxSignaling.2008,10,179)。此外，NAD(H)还是许多重要氧化还原酶的辅酶，起传递氢和电子的作用。
由于生物体内NAD(H)同时参与多种反应，因此在大部分目标产物的生物代谢网络中，都会存在一步或多步利用NAD(H)的反应。现阶段通常采用辅因子工程对目标代谢网络进行调控。常见的策略有，1)改变胞内辅酶合成，降解，回补代谢和不同辅酶分子相互转化的能力，2)改变氧化还原酶的辅酶偏好性，3)在细胞内表达可再生辅酶的酶，如葡萄糖脱氢酶等，并在培养环境中额外添加相应酶的底物。但是，由于NAD(H)是一种通用的辅酶，胞内NAD(H)水平及不同氧化态的扰动往往会对细胞生理及代谢等产生难以预测的全局性影响。因此，为了实现特异性调控目标代谢网络，亟需一种方法使目标代谢网络从复杂代谢网络中独立出来，即需要重新设计出一个生物正交系统(K.Shokat,et al.Drug DiscoveryToday.2002,7,872)。
在依赖于NAD类似物的生物正交系统中，NAD(H)类似物可以在该正交代谢途径中传递，而不影响其他利用NAD(H)的代谢途径，同样，其他代谢途径中的NAD(H)也不会影响到生物正交代谢途径。因此，仅靠调控NAD(H)类似物的含量就可以对生物正交系统进行特异性的代谢调控，从而达到提高目标途径产量的目的。
由于依赖于NAD(H)的氧化还原酶与其辅酶的主要结合作用发生在腺嘌呤结合域，吡啶环部分主要起传递电子的作用，因此，为了保证NAD类似物的氧化还原性能，只能对NAD的腺嘌呤环部分进行改造。
目前，大多数NAD类似物均采用化学法合成。但是，化学法合成NAD类似物通常面临步骤繁琐，化学性质不稳定，分离，纯化较困难，且成本较高，不能直接应用于生物体等问题。因此，有人采用酶促方法合成NAD类似物(H.迪费尔，D.海因德尔，C.迈尔，R.施姆克，CARBA-NAD的酶促合成，申请号：201080033434.1)。其借助野生型烟酰胺核糖激酶(RNK)和烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT)进行NAD类似物的酶促反应合成。其中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nicotinamide/nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase，NMNAT)根据物种来源不同，分别可由基因nadD，nadM，nadR表达，蛋白产物为NadD，NadR，NadM，其可将烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)或烟酸单核苷酸(nicotinic acid mononucleotide，NaMN)和腺苷三磷酸(ATP)进行缩合反应合成NAD或NaAD，是NAD生物合成途径中的关键酶。虽然在体外反应条件下，野生NMNAT也可表现出很低的合成少数NAD类似物的活性(M.Emanuelli,et al.Protein Expression andPurification.2003,27,357)，但不足以用于制备或进行胞内直接合成NAD类似物。
烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(nicotinamide cytosine dinucleotide，NCD)是一种NAD类似物，可作为辅酶介导氧化还原反应。通过构建依赖NCD的氧化还原酶，可以建立生物正交的氧化还原体系，用于控制细胞内代谢过程(D.Ji,et al.Journal of the AmericanChemical Society.2011,133,20857)。虽然通过化学方法可以合成NCD，但NCD和NAD一样，不能自由透过细胞膜，成为胞内应用NCD的瓶颈。因此，需要建立一种酶促合成NCD的方法，以利用细胞内源代谢物直接在胞内合成NCD。
发明内容
针对化学法合成NCD步骤繁琐，分离纯化困难，NCD难以进入细胞等缺点，并且目前尚未发现可高效催化合成NCD的酶，本发明的目的是提供一种酶促合成NCD的方法，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，以烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸为底物，催化合成NCD，并且通过在胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，实现直接在胞内合成NCD，应用于选择性调控代谢过程和提高目标代谢产物产量。
一方面，本发明提供了一种酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)的方法，以烟酰胺单核苷酸(NMN)和胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)为底物，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸。
在一些实施方式中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的一种或二种以上，其中，SEQ ID NO:1是来源于大肠杆菌的NadD的氨基酸序列，SEQ ID NO:2是来源于大肠杆菌的NadR的氨基酸序列，SEQ ID NO:3是来源于土拉热弗朗西丝氏菌的NadM的氨基酸序列。
烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为上述氨基酸序列中的1个以上氨基酸进行突变获得的突变体，突变位点为下述序列中氨基酸位点中的一种或二种以上：
一种在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的突变位点为：22位突变为S，L，A或G中的一种，26位突变为M，V，F或R中的一种，45位突变为W，Y或L中的一种，82位突变为K，E，L或T中的一种，84位突变为K，W，E，A，L，V，M，T或P中的一种，85位突变为R，M，Q，Y，L，S，W，G或A中的一种，86位突变为R，F，D，K，S或W中的一种，105位突变为M或L中的一种，107位突变为F，V，R，L，S，A，W或P中的一种，118位突变为D，H，T，P，G，N，A或R中的一种，132位突变为I，A，V，P，F，G，L，R或Q中的一种，174位突变为I，A，R，P，L，G，V，K，D或M中的一种，175位突变为T，M，K，S，N，M，W，E或G中的一种，176位突变为M，G，S，A，P，T，R或K中的一种，179位突变为R，K，V，S，N，R，G，T或N中的一种，132，133位插入突变为三个氨基酸a，b，c，其中a为L，V，F，P，E，R，G或A中的一种，b为Q，P，A，N，L，E，S，C或H中的一种，c为R，L，V，G，M，F，A或T中的一种，174，175，176位缺失突变为两个氨基酸d，e，其中d为A，S，T或P中的一种，e为S，P，G或A中的一种，或177，178，179位缺失突变为两个氨基酸f，g，其中f为A，E，L，P，R或S中的一种，g为P，I，K，V，S，N，R，G或T中的一种，产生的一种或两种以上突变的新蛋白质；
或，一种在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的突变位点为：83位突变为R，K，V或M中的一种，87位突变为Q，G或L中的一种，148位突变为N，Q，H或S中的一种，154位突变为H，Y或F中的一种，177位突变为F，V，R，L，S，A，W或P中的一种，178位突变为I，A，V，P，F，G，L，R或Q中的一种，179位突变为F，V，R，L，S，G，A，W或P中的一种，206位突变为F，L，V，Y或S中的一种，207位突变为Q，H，E，Q或D中的一种，198，199，200位缺失突变为两个氨基酸a，b，其中a为A，G，L，S或T中的一种，b为Y，P，T，F，N或Q中的一种，或202，203，204位缺失突变为两个氨基酸c，d，其中c为L，M，F，L或V中的一种，d为A，E，D，N，V或I中的一种，产生的一种或两种以上突变的新蛋白质；
或，一种在SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的突变位点为：20位突变为R，K，V，T，M或L中的一种，21位突变为M，S，K，T，L，F，G，W，Q或R中的一种，23位突变为R，T，L或Q中的一种，24位突变为N，W，K，S，F，R，G，V，T，D，P，E或A中的一种，109位突变为N，Q，F，Y，C，T或S中的一种，110位突变为R，L，N或Q中的一种，112位突变为R，Q，E，F或Y中的一种，130位突变为P，G，A或S中的一种，131位突变为A，G，R，F，S，L，E，V，C，W，I或P中的一种，132位突变为R，W，V，A，S或G中的一种，133位突变为V，T，Q，L或E中的一种，134位突变为P，E，A或G中的一种，135位突变为T，G，S，K或R中的一种，或136位突变为I，L或V中的一种，产生的一种或两种以上突变的新蛋白质。
本发明获得可以合成NCD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的操作步骤如下：
1.选择来源于已知物种的NMNAT为模板进行定向进化。
提取该物种全基因组DNA，PCR扩增得到该物种表达NMNAT的基因序列，或全基因合成该基因序列。
2.构建表达NMNAT的工程菌。
将表达NMNAT的基因克隆至原核蛋白表达载体中，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)或DH10b，将获得的阳性克隆进行测序，测序结果正确的克隆即为野生型NMNAT表达工程菌。
3.数据库下载或模拟该物种的NMNAT的晶体结构。
若该NMNAT晶体结构已经解析，且晶体结构中包含ATP或NAD，则直接在PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)进行下载并分析；若该NMNAT的晶体结构未解析或已经解析但晶体结构中不含ATP或NAD，则在NCBI网站上进行blast(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，寻找已解析的含有ATP或NAD且同源性在30％以上的晶体结构为模板，采用Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)进行模拟。
4.设计突变策略。
经过晶体结构分析，选取权利要求1所述的氨基酸，用简并碱基NNK(其中N＝腺嘌呤，鸟嘌呤或胞嘧啶或胸腺嘧啶；K＝鸟嘌呤或胸腺嘧啶)替换目标突变位点的密码子，设计突变引物，构建饱和突变载体。
5.构建突变文库。
采用RF克隆的方法，参见文献(F.van den Ent,et al.Journal of Biochemicaland Biophysical Methods.2006,67,67)。第一步PCR过程中，模板为野生型NMNAT表达载体，引物为含有简并碱基NNK的突变引物，得到的PCR产物进行回收之后作为第二步RF克隆的大引物；第二步PCR过程中，模板仍为野生型NMNAT表达载体，PCR得到的产物用DpnI限制酶进行消化，并转入大肠杆菌感受态细胞中，得到的转化子即为由可表达NMNAT突变体的工程菌组成的饱和突变文库。
6.构建突变文库筛选方法。
利用已有的能够识别目标NAD类似物的氧化还原酶进行突变文库筛选，采用酶偶联显色法。筛选显色原理见附图1。
酶偶联显色过程中，NMNAT的突变文库将底物CTP和NMN进行缩合反应，合成NAD类似物NCD。本领域的熟练技术人员可以采用文献(D.Ji,et al.Journal of the AmericanChemical Society.2011,133,20857)类似的方法，获得能够使NCD还原为NCDH的氧化还原酶作为指示酶，生成NCDH；吩嗪硫酸甲酯(PMS)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)的在NCDH的作用下被还原为肉眼可见的黑紫色不溶物。
7.筛选突变文库。
挑取突变体文库单菌落接种于96深孔板LB液体培养基中，进行菌株培养及突变蛋白的诱导表达；收集菌体细胞进行破碎，离心，上清即为含有可溶的突变蛋白粗酶液。酶偶联显色筛选的反应体系的pH为5.0～11.0，反应液中含有NMN，CTP，金属离子，指示氧化还原酶及其共底物，PMS，NBT和粗酶液上清。
反应液显蓝色的孔对应的突变菌即为疑似目标突变菌，将疑似目标突变菌进行第二次复筛验证，验证正确的菌即为目标突变菌。目标突变菌提取质，测序分析，确定突变体蛋白携带的氨基酸突变。
8.纯酶活性验证。
将目标突变菌进行放大培养并诱导表达，得到的培养液离心收集菌体并裂解，离心收集裂解液上清，根据目标突变体的特点进行分离纯化，收集得到的纯酶液验证活性。
验证纯酶活性的反应条件如下：缓冲溶液pH 5.0～11.0，NMN 0.05～10mM，0.02～10mM CTP，0.05～10mM的金属离子，0.01～1mg/mL的纯酶液，25～40℃反应2～4h，终止反应除去蛋白，选择合适的方法分离纯化得到NAD类似物。
纯化得到的类似物进行NMR检测，谱图正确后即可认为对应的突变体为可以合成NCD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体。
在一些实施方式中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由相应的脱氧核糖核酸(DNA)序列编码。
在另一些实施方式中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，其相应的编码DNA序列，克隆在一种蛋白质表达载体中，用于可控表达。
另一方面，本发明提供一种酶促合成NCD方法的应用。
在一些实施方式中，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由携带相应突变体的表达载体的微生物细胞产生，纯化相应突变体，并用于体外酶促反应合成NCD，反应条件为：pH 5.0-9.0，温度25℃-55℃，时间0.2-30h；烟酰胺单核苷酸，胞嘧啶核苷三磷酸，烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体三者的用量摩尔比例为1:0.02-50:0.00002-0.1。
在一些实施方式中，在微生物细胞中表达所述的突变体蛋白，同时表达以NCD为辅酶的一种或两种以上蛋白，构建可被选择性调控的代谢体系，用于提高目标代谢产物产量。
在一些实施方式中，在大肠杆菌工程菌中表达所述的突变体蛋白，同时表达以烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为辅酶的来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸苹果酸酶突变体ME*和来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸亚磷酸脱氢酶突变体PDH*，并在亚磷酸存在下培养工程菌细胞，提高苹果酸产量。
关于表示方法的说明
ME*表示：来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸苹果酸酶突变体(D.Ji,et al.Journal of the American Chemical Society.2011,133,20857)。
PDH*表示：来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸亚磷酸脱氢酶突变体(王磊.基于烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的代谢电路研究[博士学位论文].北京：中国科学院大学，2014)。
在提高苹果酸产量的实施方式中，选择的宿主为E.coli XZ654(X.Zhang,etal.Applied and Environmental Microbiology.2011,77,427)。在宿主中同时过表达能够合成NCD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体，依赖NCD(H)为辅酶的来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸的亚磷酸脱氢酶突变体PDH*(将亚磷酸氧化为磷酸的同时将NCD还原为NCDH)和来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸的苹果酸酶突变体ME*(以NCDH为还原力催化丙酮酸生成苹果酸)，构建NCD的胞内合成，还原与再生正交系统。将亚磷酸氧化为磷酸的同时将NCD还原为NCDH，在不干扰胞内其他以NAD(H)为辅因子的生命过程的情况下，以NCDH为还原力催化丙酮酸生成苹果酸，实现还原力的特异性分配和苹果酸的积累。
在一些优选实施方式中，突变体蛋白的具体氨基酸序列为SEQ ID NO:4，SEQ IDNO:5，SEQ ID NO:6中的一种或二种以上。其中，SEQ ID NO:4是来源于大肠杆菌的NadD的突变体的氨基酸序列，与野生型NadD相比，其118位酪氨酸突变为天冬氨酸，132位半胱氨酸突变为异亮氨酸，175位脯氨酸突变为色氨酸，176位色氨酸突变为丝氨酸的序列；SEQ ID NO:5是来源大肠杆菌的NadR的突变体的氨基酸序列，与野生型NadR相比，其198位天冬氨酸，199位脯氨酸，200位赖氨酸缺失突变为亮氨酸和异亮氨酸；SEQ ID NO:6是来源于土拉热弗朗西丝氏菌的NadM的突变体的氨基酸序列，与野生型NadM相比，其第110位组氨酸突变为精氨酸，第131位天冬氨酸突变为谷氨酸。
附图说明
图1 NMNAT突变文库的筛选原理。其中，CTP是ATP的类似物，NCD是目标NAD类似物，NMNAT*是烟酰胺核苷酸腺苷转移酶突变体，氧化还原酶作为指示酶在共底物存在的条件下将NAD类似物NCD还原成具有还原性质的NCDH，吩嗪硫酸甲酯(PMS)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)的在NCDH的作用下被还原为肉眼可见的黑紫色不溶物。
图2胞内原位合成NCD并用于提高苹果酸产量的代谢通路。宿主细胞为WXY01，该菌株敲除了ldhA，ackA，adhE，pflB，mgsA，poxB，frdBC，sfcA，maeB等丙酮酸，苹果酸消耗途径，避免了底物竞争和产物消耗对检测的影响；又过表达了可以合成NCD的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体NadD5G4，特异性依赖NCDH为还原力的苹果酸酶突变体ME*，可以使NCDH再生的亚磷酸脱氢酶突变体PDH*。其中，NadD5G4是来源于大肠杆菌的NadD的突变体，与野生型NadD相比，其118位酪氨酸突变为天冬氨酸，132位半胱氨酸突变为异亮氨酸，175位脯氨酸突变为色氨酸，176位色氨酸突变为丝氨酸的序列；ME*是来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸苹果酸酶突变体；PDH*是来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸亚磷酸脱氢酶突变体。
具体实施方式
以下实施例可以进一步阐明本发明，通过参考以下的实施例将更容易理解本发明。这些实施例仅用于示例性说明，而不用于限制本发明。
本发明中，获得能够合成NAD类似物NCD的突变体的操作步骤见发明内容。
表达载体构建均采用RF克隆方法。第一步PCR扩增得到含有与目标载体同源臂片段的目标基因，第二步PCR以其为大引物，将其克隆至目标载体上。得到的产物用DpnI限制酶进行消化，并转入宿主感受态细胞中，得到的转化子即为可表达NMNAT突变体的突变文库。
文库中各突变体表达菌分别以xxx进行编号，其中，xxx为数字和字母的组合，命名方式：菌株名称加载体名称；突变体表达载体命名方式：在野生型表达载体名称后加“-xxx”；突变体蛋白命名方式：野生型蛋白名称加右上标xxx命名。如：来源于大肠杆菌的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶NadD的表达载体pET-NadD转入宿主BL21(DE3)中，得到的表达菌命名为BL21(DE3)(pET-NadD)；NadD的突变体表达菌中有一个编号为5G4，其表达菌命名为BL21(DE3)(pET-NadD-5G4)，突变体表达载体命名为pET-NadD-5G4，突变体蛋白命名为NadD5G4。
突变体蛋白质的诱导表达条件为：挑目标单菌落在37℃200rpm过夜活化，转接于新的培养基中，加入IPTG 0.01～1mM，在15℃～37℃200rpm诱导表达目标蛋白。
参考文献(J.Wang,et al.Protein Expression and Purification.2007,53,97)方法，进行蛋白质的诱导，表达，纯化。
蛋白质的浓度测定采用伯乐公司蛋白质浓度测定试剂盒用Bradford法进行测定。
胞内辅因子浓度测定采用辅因子循环策略(S.Kern,et al.Methods inMolecular Biology.2014,1149,311)。
测定NMNAT及其突变酶利用ATP合成NAD的活性时采用文献(E.Balducci,etal.Analytical Biochemistry.1995,228,64)中的酶偶联方法。
测定NMNAT及其突变酶利用CTP合成NCD的活性时，反应体系中加入：20～1000mM的缓冲溶液pH 5.0～11.0，0.05～10mM的NMN，0.02～10mM的CTP，0.05～10mM的金属离子，0.01～1mg/mL的突变纯酶液，5～10mM的L-苹果酸，50U/mL的苹果酸酶突变体ME*纯酶液，在25℃恒温条件下用分光光度计测340nm处吸光度变化。其中，ME*是来源于大肠杆菌K12，第310位亮氨酸突变为赖氨酸的苹果酸酶突变体。工程菌BL21(DE3)(pET24b-ME*)诱导表达及ME*纯化方法同文献(D.Ji,et al.Journal of the American Chemical Society.2011,133,20857)。
PDH*是来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸亚磷酸脱氢酶突变体(王磊.基于烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的代谢电路研究[博士学位论文].北京：中国科学院大学，2014)。
酶活力单位定义：在测定条件下每分钟催化产生1nmol产物所需的酶量，即1U＝1nmol/min。NADH和NCDH的摩尔消光系数按6220M-1cm-1计。比酶活用公式1进行计算。其中，Vt为反应液总体积，Vs为加入酶体积，C为酶浓度。
公式1
其中，Vt为反应液总体积，Vs为加入酶体积，C为酶浓度。
酶反应合成产物的分离纯化采用文献(D.Ji,et al.Journal of the AmericanChemical Society.2011,133,20857)的方法。
粗酶液反应结束后产物NCD的定性与定量采用文献(L.Sorci,et al.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America.2009,106,3083)中HPLC的方法。
发酵培养基中的最小矿物盐培养基采用文献(T.Causey,et al.Proceeding ofthe National Academy of Sciences of the United Stated of America.2003,100,825)中配方。
对比实施例1野生NadD催化合成NCD
参考文献(R.Mehl,et al.Journal of Bacteriology.2000,182,4372)构建来源于大肠杆菌的野生型烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶NadD的表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得工程菌BL21(DE3)(pET-NadD)。参考文献(R.Mehl,et al.Journal ofBacteriology.2000,182,4372)诱导表达并纯化NadD，即SEQ ID NO:1对应的蛋白。采用上述与苹果酸酶突变体ME*偶联的方法测定其利用CTP合成NCD的反应活性。反应条件：150μL反应体系中含HEPES 50mM，CTP 100μM，NMN 4mM，MgCl210mM，MnCl25mM，NadD 6mg，L-苹果酸10mM，苹果酸酶突变体ME*纯酶7.5U，pH 7.5，在25℃恒温条件下用分光光度计测340nm处吸光度变化。测得野生NadD合成NCD的活性为0.03U/mg。
实施例1 NadD 5G4催化合成NCD
1.构建突变文库
采用RF克隆(F.van den Ent,et al.Journal of Biochemical and BiophysicalMethods.2006,67,67)的方法构建突变文库。第一步，模板为野生型NadD表达载体(见对比实施例1)，引物将待突变氨基酸位点碱基替换为简并碱基NNK，回收PCR产物；第二步，模板同第一步，引物为第一步中回收的PCR产物，得到的产物用DpnI限制酶进行消化，并转入BL21(DE3)感受态细胞中，得到的转化子即为可表达NadD突变体的突变文库，各突变体表达菌分别命名为BL21(DE3)(pET-NadD-xxx)，表达蛋白产物命名为NadDxxx。其中，xxx为数字和字母的组合，每个突变菌株对应一个编号，下同。
2.突变文库筛选
挑取突变文库单菌落接种于96深孔板LB液体培养基中，在30℃，200rpm培养72h，诱导表达突变体。在3500rpm条件下离心15min收集菌体，加入细胞裂解剂(50mM HPEPS，1％Triton，1mg/mL溶菌酶，pH 7.5)，在37℃，200rpm破碎1h，3500rpm离心获得粗酶液上清。采用酶偶联显色方法进行合成NCD的活性筛选。60μL反应条件为：HEPES 50mM，CTP 2mM，NMN4mM，MgCl210mM，MnCl25mM，L-苹果酸10mM，苹果酸酶突变体ME*7.5U，PES 0.4mM，NBT 1mM，pH7.5，加入粗酶液10μL，30℃反应1.5h，观察颜色变化，显蓝色的孔所对应的菌株即为疑似可以合成NCD的突变菌株。复筛采用放大培养，在5mL LB液体培养基中诱导表达突变体，筛选方法同上，能重复显蓝色的突变菌株即为目标突变菌株。
选其中显色较快的突变菌命名为BL21(DE3)(pET-NadD-5G4)并进行测序，其表达蛋白产物NadD5G4的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，与野生型NadD相比，其118位酪氨酸突变为天冬氨酸，132位半胱氨酸突变为异亮氨酸，175位脯氨酸突变为色氨酸，176位色氨酸突变为丝氨酸。
3.NadD 5G4催化合成NCD
突变菌BL21(DE3)(pET-NadD-5G4)的培养，诱导表达及NadD5G4的纯化过程同对比实施例1。从9g湿菌体中纯化得到纯酶NadD5G443mg/mL，共4mL。测定其利用CTP合成NCD的比酶活方法同对比实施例1。测得其合成NCD的活性为16.27U/mg，比野生型NadD提高了542倍。
可见，本发明得到的突变体纯酶NadD5G4催化合成NCD的活性显著高于相应野生型蛋白的活性。另外，文献(M.Emanuelli.Protein Expression and Purification.2003,27,357)表达纯化了一种酿酒酵母来源的野生NMNAT-2，其合成NCD的活性为0.02U/mg，也远低于本发明的突变体蛋白。因此，本发明得到的突变体蛋白，催化合成NCD的性能显著优于野生型蛋白，为制备NCD和在细胞内合成NCD提供了新的生物催化剂。
实施例2 NadD5G4纯酶制备NCD
10mL NadD5G4纯酶反应制备NCD的体系中含有Tris 100mM，CTP 2mM，NMN 4mM，MgCl210mM，MnCl25mM，纯酶NadD5G410mg，pH 8.0，在37℃，200rpm反应1h，然后用超滤离心管，在5000g，4℃条件下离心15min除去蛋白，参考文献方法(D.Ji,et al.Journal of theAmerican Chemical Society.2011,133,20857)，分离纯化得NCD 7.8mg，产率61％。
产物核磁共振数据:1H NMR(D2O,400MHz):δ9.30(s,1H),9.14(d,J＝6.1Hz,1H),8.83(d,J＝7.9Hz,1H),8.16(m,1H),7.74(d,J＝7.6Hz,1H),6.04(d,J＝5.3Hz,1H),5.92(d,J＝7.4Hz,1H),5.77(d,J＝4.0Hz,1H),4.46(m,1H),4.41(m,1H),4.33(m,1H),4.28–4.25(m,1H),4.17–4.09(m,5H),4.02–4.00(m,1H).13C NMR(D2O,100MHz):δ165.5,165.2,156.4,146.0,142.5,141.7,139.9,133.9,128.6,99.9,89.4,87.0,82.5,77.6,74.1,70.7,69.2,64.9,64.7.31P NMR(D2O,162MHz):δ–11.1,–11.3.
实施例3 NadD5G4粗酶液制备NCD
将NadD5G4的表达工程菌BL21(DE3)(pET-NadD-5G4)划线培养，挑取单菌落接种于5mL LB(含卡那霉素50ng/μL)液体培养基中，在37℃，200rpm过夜活化，将其全部接种于50mL新鲜LB(含卡那霉素50ng/μL和IPTG 1mM)中，在30℃，200rpm培养24h。离心收集菌体，加入5mL细胞裂解液(50mM HPEPS pH 7.5，1％Triton X-100，1mg/mL溶菌酶)，在37℃，200rpm下裂解1h。离心(12000g)处理10min，收集上清，得到NadD5G4粗酶液。
300μL粗酶液反应体系中含有：Tris 100mM，CTP100μM，NMN 4mM，MgCl210mM，MnCl25mM，NadD5G4粗酶液50μL，pH 8.0，在37℃，200rpm反应2h。加入150μL冰预冷的1.2M的HClO4，混匀后冰浴10min中止反应；在4℃，离心力为12000g下处理1min，取300μL上清加入80μL冰预冷的0.8M的K2CO3溶液，混匀后冰浴10min进行中和；在4℃，离心力为12000g下处理1min，取上清300μL用0.22μm滤膜过滤后进行HPLC分析。定量分析显示反应结束时，反应液中含NCD 0.17mM。
实施例4 NadD5G4胞内合成NCD
同NadD5G4粗酶液合成NCD时工程菌的培养方法，经过划线复苏，过夜活化及诱导表达之后，取菌液稀释至OD600为1.0，取1mL菌液离心(12000g)处理2min，收集菌体；加入500μL50mM pH 7.2的磷酸盐缓冲液进行重悬，离心(12000g)处理2min，收集菌体；NCD提取时加入150μL 0.2M的HCl，55℃加热10min，于0℃中降温5min；加入150μL 0.1M的NaOH溶液中和，离心(12000g)处理5min，上清即为胞内NCD提取液。
胞内NCD含量的测量采用酶循环法。100μL的反应体系中含有：50mM HEPES，10mMMgCl2，5mM MnCl2，50U/mL的苹果酸酶突变体ME*纯酶液，10mM L-苹果酸，0.4mM PES，1mMMTT和15μL NCD提取液，pH 7.5。测得工程菌BL21(DE3)(pET-NadD-5G4)胞内NCD含量为18.1μM。
实施例5 NadD5G4调控苹果酸发酵产量
构建苹果酸发酵工程菌需要将能够合成NCD的NadD5G4，依赖NCD(H)为辅酶的来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸的亚磷酸脱氢酶突变体PDH*(将亚磷酸氧化为磷酸的同时将NCD还原为NCDH)和来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸的苹果酸酶突变体ME*(以NCDH为还原力催化丙酮酸生成苹果酸)，共表达于宿主E.coli XZ654(X.Zhang,et al.Applied and Environmental Microbiology.2011,77,427)中。三酶共表达载体以pK载体(王磊.基于烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的代谢电路研究[博士学位论文].北京：中国科学院大学，2014)为模板。采用三步RF克隆的方法。所用到的引物和模板如下表1和表2所示。得到的RF克隆产物经过转化并菌落PCR鉴定正确后提质粒送测序，测序正确的即为目标载体，命名为pK-ME*-NadD5G4-PDH*。
表1构建共表达载体所用的引物表
表2两步RF克隆所用引物，模板简表
RF1引物 RF1模板 RF2模板 目标载体
ME-F/R pK
pK-ME-F/R
pK-NadD-F/R pET-NadD-5G4
将pK-ME*-NadD5G4-PDH*电转入E.coli XZ654感受态细胞中，得到的阳性克隆经验证正确后，即为本实施例的工程菌，命名为WXY01，其苹果酸积累途径如附图2所示。
WXY01发酵产生苹果酸的种子培养基为LB液体培养基，发酵培养基为最小矿物盐培养基添加10％葡萄糖，100mM KHCO3，0.15％乙酸钠，100mM亚磷酸和0.4mM IPTG。过夜活化的种子培养液以1:50的接种率接种于1.5L发酵培养基中，在30℃，200rpm培养72h。
发酵结束后取发酵液1mL加入9mL甲醇乙腈终止液终止反应。采用文献方法(X.Zhang,et al.Applied and Environmental Microbiology.2011,77,427)利用离子色谱分析，发现发酵液苹果酸含量为44g/L，而相同条件下培养E.coli XZ654，发酵液苹果酸含量为34g/L。表明以葡萄糖为碳源时，工程菌WXY01的苹果酸产量提高了30％。
本实施例的结果说明，工程菌WXY01通过在胞内合成NCD，并且在PDH*作用下还原为NCDH，进而被ME*利用，推动ME*途径克服热力学屏障催化苹果酸合成，提高了苹果酸产量。因此，胞内合成NCD及其介导的氧化还原反应体系，为代谢工程提供了新技术。
对比实施例2
参考文献(N.Raffaelli,et al.Journal of Bacteriology.1999,181,5509)将来源于大肠杆菌BL21(DE3)的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶NadR的基因nadR亚克隆至pK载体上，得到野生型NadR的表达载体pK-NadR，将其电转入DH10b感受态细胞中，得到可表达NadR的工程菌，命名为DH10b(pK-NadR)。参考文献(N.Raffaelli,et al.Journal ofBacteriology.1999,181,5509)对工程菌进行诱导表达并纯化，得到纯酶NadR，即SEQ IDNO:2对应的蛋白。采用对比实施例1中相同的方法进行NCD合成酶活测定。测得野生NadR合成NCD的活性为0.02U/mg。
实施例6 NadR6E8催化合成NCD
NadR突变文库的构建方法基本同实施例1，不同之处在于，将RF克隆得到的PCR产物经DpnI消化后电转入大肠杆菌DH10b感受态细胞中，得到的转化子即为可表达NadR突变体的突变文库，各突变体表达菌分别命名为DH10b(pK-NadR-xxx)，表达蛋白产物命名为NadRxxx。其中，xxx为数字和字母的组合，每个菌株对应一个编号，下同。
突变文库的筛选和复筛方法同实施例1，不同之处在于酶偶联显色筛选体系中NMN由4mM减少至1mM。
选其中显色较快的突变菌命名为DH10b(pK-NadR-6E8)并进行测序，其表达蛋白产物NadR6E8的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，与野生型NadR相比，其第198位天冬氨酸，199位脯氨酸，200位赖氨酸缺失突变为亮氨酸和异亮氨酸。
突变菌DH10b(pK-NadR-6E8)的培养，诱导表达及NadR6E8的纯化过程同对比实施例2。从6g湿菌体中纯化得到纯酶NadR6E8浓度为11mg/mL，共10mL。测定其利用CTP合成NCD的比酶活方法同对比实施例1。测得其合成NCD的活性为9.31U/mg，比野生型NadR提高了465倍。
可见，本发明得到的突变体蛋白NadR6E8催化合成NCD的活性显著高于相应野生型NadR的活性。另外，文献(M.Emanuelli,et al.Protein Expression andPurification.2003,27,357)表达纯化了一种酿酒酵母来源的野生NMNAT-2，其合成NCD的活性为0.02U/mg，也远低于本发明得到的突变体蛋白。因此，本发明得到的突变体蛋白，催化合成NCD的性能显著优于野生型蛋白。
实施例7 NadR6E8纯酶制备NCD
10mL NadR6E8纯酶反应制备NCD的体系如下：HEPES 50mM，CTP 4mM，NMN 4mM，MgCl210mM，MnCl25mM，纯酶NadR6E85mg，pH 8.6，在30℃，200rpm反应2h，然后用超滤离心管在5000g，4℃条件下离心15min除去蛋白，参考文献方法(D.Ji,et al.Journal of theAmerican Chemical Society.2011,133,20857)，分离纯化得NCD 12.3mg，产率48％。
对比实施例3野生NadM催化合成NCD
参考文献(L.Sorci,et al.Proceeding of the National Academy ofSciences.2009,106,3083)构建来源于土拉热弗朗西丝氏菌的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶NadM的表达载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得工程菌BL21(DE3)(pET-NadM)，并诱导表达，纯化得到野生型NadM，即SEQ ID NO:3对应的蛋白。采用对比实施例1中相同的方法进行NCD合成酶活测定。测得野生NadM合成NCD的活性为0.03U/mg。
实施例8 NadM5A4催化合成NCD
NadM突变文库的构建方法基本同实施例1，得到的转化子即为可表达NadM突变体的突变文库，各突变体表达菌分别命名为BL21(DE3)(pET-NadM-xxx)，表达蛋白产物命名为NadMxxx。其中，xxx为数字和字母的组合，每个菌株对应一个编号，下同。
突变文库的筛选和复筛方法同实施例1，不同之处在于突变文库的诱导条件为20℃，200rpm，96h，培养基中加入IPTG浓度为0.1mM，酶偶联显色筛选时NMN浓度由4mM减少至100μM。
选其中显色较快的突变菌命名为BL21(DE3)(pET-NadM-5A4)并进行测序，其表达蛋白产物NadM5A4的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，与野生型NadM相比，其第110位组氨酸突变为精氨酸，第131位天冬氨酸突变为谷氨酸。
突变菌BL21(DE3)(pET-NadM-5A4)的培养，诱导表达及NadM5A4的纯化过程同对比实施例3。从15g湿菌体中纯化得到纯酶NadM5A4浓度为6.47mg/mL，共15mL。测定其利用CTP合成NCD的比酶活方法同对比实施例1。测得其合成NCD的活性为12.7U/mg，比野生型NadM提高了420倍。
可见，本发明得到的突变体蛋白NadM5A4催化合成NCD的活性显著高于相应野生型蛋白的活性。另外，文献(M.Emanuelli,et al.Protein Expression andPurification.2003,27,357)表达纯化了一种酿酒酵母来源的野生NMNAT-2，其合成NCD的活性为0.02U/mg，也远低于本发明的突变体蛋白。因此，本发明得到的突变体蛋白，催化合成NCD的性能显著优于野生型蛋白，为制备NCD和在细胞内合成NCD提供了新的生物催化剂。
实施例9 NadM5A4纯酶制备NCD
10mL NadM5A4纯酶反应制备NCD的体系如下：HEPES 50mM，CTP 4mM，NMN 4mM，MgCl210mM，MnCl25mM，纯酶NadM5A410mg，pH 7.5，在25℃，200rpm反应4h，得到产物然后用超滤离心管在5000g 4℃条件下离心15min除去蛋白，参考文献方法(D.Ji,et al.Journal ofthe American Chemical Society.2011,133,20857)，分离纯化得NCD 14.7mg，产率57％。
实施例10 NadM5A4胞内合成NCD
胞内合成NCD及NCD的提取方法同实施例4，所不同的是采用工程菌BL21(DE3)(pET-NadM-5A4)，诱导条件为0.1mM IPTG，在20℃，200rpm培养96h。
胞内NCD含量的测量同实施例4。测得工程菌BL21(DE3)(pET-NadM-5A4)胞内NCD含量为2.5μM。
表3列出了本发明中其他部分NMNAT突变体的活性。
表3 NMNAT突变体合成NCD的活性
本发明利用烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体为催化剂，催化烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸耦合反应，制备烟酰胺胞嘧啶二核苷酸。在微生物细胞内表达烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体的编码基因，工程菌利用内源代谢物合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸，并且胞内烟酰胺胞嘧啶二核苷酸可作为辅酶，选择性介导氧化还原反应，提高目标代谢产物产量。在一个典型实例中，苹果酸产量提高了30％。

Claims (8)

1.一种酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸的方法，其特征在于：以烟酰胺单核苷酸和胞嘧啶核苷三磷酸为底物，以烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为催化剂，合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸；
所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3中的一种或二种以上，
所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体为上述氨基酸序列中的1个以上氨基酸进行突变获得的突变体，突变位点为下述序列中氨基酸位点中的一种或二种以上：
一种在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的突变位点为：22位突变为S，L，A或G中的一种，26位突变为M，V，F或R中的一种，45位突变为W，Y或L中的一种，82位突变为K，E，L或T中的一种，84位突变为K，W，E，A，L，V，M，T或P中的一种，85位突变为R，M，Q，Y，L，S，W，G或A中的一种，86位突变为R，F，D，K，S或W中的一种，105位突变为M或L中的一种，107位突变为F，V，R，L，S，A，W或P中的一种，118位突变为D，H，T，P，G，N，A或R中的一种，132位突变为I，A，V，P，F，G，L，R或Q中的一种，174位突变为I，A，R，P，L，G，V，K，D或M中的一种，175位突变为T，M，K，S，N，M，W，E或G中的一种，176位突变为M，G，S，A，P，T，R或K中的一种，179位突变为R，K，V，S，N，R，G，T或N中的一种，132，133位插入突变为三个氨基酸a，b，c，其中a为L，V，F，P，E，R，G或A中的一种，b为Q，P，A，N，L，E，S，C或H中的一种，c为R，L，V，G，M，F，A或T中的一种，174，175，176位缺失突变为两个氨基酸d，e，其中d为A，S，T或P中的一种，e为S，P，G或A中的一种，或177，178，179位缺失突变为两个氨基酸f，g，其中f为A，E，L，P，R或S中的一种，g为P，I，K，V，S，N，R，G或T中的一种，产生的一种或两种以上突变的新蛋白质；
或，一种在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的突变位点为：83位突变为R，K，V或M中的一种，87位突变为Q，G或L中的一种，148位突变为N，Q，H或S中的一种，154位突变为H，Y或F中的一种，177位突变为F，V，R，L，S，A，W或P中的一种，178位突变为I，A，V，P，F，G，L，R或Q中的一种，179位突变为F，V，R，L，S，G，A，W或P中的一种，206位突变为F，L，V，Y或S中的一种，207位突变为Q，H，E，Q或D中的一种，198，199，200位缺失突变为两个氨基酸a，b，其中a为A，G，L，S或T中的一种，b为Y，P，T，F，N或Q中的一种，或202，203，204位缺失突变为两个氨基酸c，d，其中c为L，M，F，L或V中的一种，d为A，E，D，N，V或I中的一种，产生的一种或两种以上突变的新蛋白质；
或，一种在SEQ ID NO:3的氨基酸序列中的突变位点为：20位突变为R，K，V，T，M或L中的一种，21位突变为M，S，K，T，L，F，G，W，Q或R中的一种，23位突变为R，T，L或Q中的一种，24位突变为N，W，K，S，F，R，G，V，T，D，P，E或A中的一种，109位突变为N，Q，F，Y，C，T或S中的一种，110位突变为R，L，N或Q中的一种，112位突变为R，Q，E，F或Y中的一种，130位突变为P，G，A或S中的一种，131位突变为A，G，R，F，S，L，E，V，C，W，I或P中的一种，132位突变为R，W，V，A，S或G中的一种，133位突变为V，T，Q，L或E中的一种，134位突变为P，E，A或G中的一种，135位突变为T，G，S，K或R中的一种，或136位突变为I，L或V中的一种，产生的一种或两种以上突变的新蛋白质。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由相应的DNA序列编码。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征还在于：所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，其相应的编码DNA序列，克隆在一种蛋白质表达载体中，用于可控表达。
4.按照权利要求1所述酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸方法，其特征还在于：所述的烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的突变体，由携带相应突变体的表达载体的微生物细胞产生，纯化相应突变体，并用于体外酶促反应合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸。
5.按照权利要求1或4所述酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸方法，其特征还在于：反应条件为：pH 5.0-9.0，温度25℃-55℃，时间0.2-30h；烟酰胺单核苷酸，胞嘧啶核苷三磷，酸烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶突变体三者用量摩尔比例为1:0.02-50:0.00002-0.1。
6.按照权利要求4所述酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸方法，其特征在于：在微生物细胞中表达权利要求1所述的突变体蛋白，同时表达以烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为辅酶的一种或两种以上蛋白，构建可被选择性调控的代谢体系，用于提高目标代谢产物产量。
7.按照权利要求4或5所述酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸方法，其特征在于：在大肠杆菌工程菌中表达权利要求1所述的突变体蛋白，同时表达以烟酰胺胞嘧啶二核苷酸为辅酶的来源于大肠杆菌K12的第310位亮氨酸突变为赖氨酸的苹果酸酶突变体和来源于施氏假单胞菌WM88的第151位异亮氨酸突变为精氨酸的亚磷酸脱氢酶突变体，并在亚磷酸存在下培养工程菌细胞，提高苹果酸产量。
8.按照权利要求1所述酶促合成烟酰胺胞嘧啶二核苷酸方法，其特征在于：突变体蛋白的具体氨基酸序列为SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6中的一种或二种以上。
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