CN104946706A - 一种nad类似物的还原方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种NAD类似物的还原方法及其应用。该方法中还原剂为亚磷酸化合物，催化剂为可利用亚磷酸化合物的亚磷酸脱氢酶，亚磷酸脱氢酶氧化亚磷酸化合物的同时，将NAD类似物转化为其还原态。该方法可用于生产还原态NAD类似物或氘代的还原态NAD类似物，也可为消耗还原态NAD类似物的酶促反应提供还原力，还原态的NAD类似物可作为辅酶应用于苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D–乳酸脱氢酶DLDH-V152R、酿酒酵母醇脱氢酶等酶催化的还原反应，有利于NAD类似物的广泛应用。该NAD类似物还原方法可在温和的条件下，再生还原态NAD类似物用于苹果酸或乳酸的制备；也可作为一种氧化还原力调控微生物体内苹果酸或乳酸的代谢强度。

Description

一种NAD类似物的还原方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）类似物的酶催化还原方法及其应用，具体地说，是以亚磷酸化合物为还原剂，在酶催化下将NAD类似物转化为其还原态，并可被其他酶用做辅酶应用于还原反应。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和其还原态NADH是生命过程中的重要辅酶，参与生命体中的氧化还原代谢及其他一系列重要生物化学过程。这些辅酶可用于生产手性化学品及制备同位素标记物。由于很多氧化还原酶都利用NADH或NADPH作为辅酶，任何改变NAD浓度及其氧化还原状态的操作都会对细胞产生全局性影响，很难在辅酶水平对生物体系中特定的氧化还原酶进行控制。由于NADH可被代谢网络中多种途径消耗，影响了目标途径对还原力的利用效率。使用NAD类似物传递还原力时，由于类似物只被突变型氧化还原酶识别，从而可在辅酶水平对目标氧化还原过程进行调控，对生物催化和合成生物学研究具有重要意义（Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redoxsystems depending on nicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133:20857）。

目前已经报道了几种具有较好生物相容性的NAD类似物。如，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)、烟酰胺5-氟胞嘧啶二核苷酸(NFCD)、烟酰胺5-氯胞嘧啶二核苷酸(NClCD)、烟酰胺5-溴胞嘧啶二核苷酸(NBrCD)和烟酰胺5-甲基胞嘧啶二核苷酸(NMeCD)（Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systemsdepending on nicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133:20857;Ji DB,et al.Synthesis of NAD analogs to develop bioorthogonal redoxsystem.Sci China Chem,2013,56:296）。同时，也报道了一些可识别NAD类似物酶，如来自粪肠球菌Enterococcus faecalis的NADH氧化酶(NOX，GenbankS45681)、D–乳酸脱氢酶(DLDH，Genbank CAA47255)V152R突变体、苹果酸酶(ME，Genbank P26616)L310R/Q401C突变体、苹果酸脱氢酶(MDH，GenbankCAA68326)L6R突变体。

利用NAD类似物及识别它们的酶，可以构建更经济有效的生物催化体系（纪德彬等,利用人工氧还酶体系催化L–苹果酸氧化脱羧反应.催化学报,2012,33:530）。如，过表达ME-L310R/Q401C和NOX的大肠杆菌基因工程菌的细胞裂解液，在NFCD存在下，可以高效、选择性将苹果酸转化为丙酮酸；而在NAD存在下，丙酮酸被内源的乳酸脱氢酶进一步还原为乳酸。可见，通过选择合适的NAD类似物及识别它们的酶，可利用粗酶液进行反应达到纯酶催化的效果，实现在辅酶水平控制复杂生物催化转化体系。可以预计，该方法也可能应用于胞内代谢反应，为生物催化提供一种全新策略。

和使用其他氧化还原辅酶一样，NAD类似物也必需再生循环。辅酶再生方式主要有酶法、电化学方法、化学法和光化学法。其中酶法具有选择性高、可以与合成酶兼容及高转换数等优点。目前再生还原态辅酶NADH常采用葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶或亚磷酸脱氢酶。其中亚磷酸脱氢酶可利用亚磷酸化合物，催化氧化亚磷酸化合物生成磷酸化合物，同时还原NAD为NADH，根据pH7.0时NAD/NADH(–0.32V)和亚磷酸/磷酸(–0.65V)的氧化还原电位，psPDH氧化亚磷酸还原NAD的平衡常数高达10¹¹，反应过程几乎不可逆，有利于辅酶再生（McLachlan MJ,et al.Further improvement of phosphitedehydrogenase thermostability by saturation mutagenesis.Biotechnol Bioeng,2008,99:268）。虽然NAD类似物再生循环对生物催化和合成生物学等领域具有重要意义，但目前尚没有文献报道如何改造和选择合适的酶，以高效还原NAD类似物。

发明内容

本发明涉及一种辅酶NAD类似物的酶催化还原方法，具体来说，是以亚磷酸化合物为还原剂，以可利用亚磷酸化合物的酶为催化剂，将NAD类似物转化为相应的还原态。这些NAD类似物还原态可作为其他氧化还原酶的辅酶，用于还原反应。因此，本发明的方法可应用在生物催化和生物转化领域，具有重要价值。

本发明涉及的NAD类似物包括NCD、NFCD、NClCD、NBrCD、NMeCD、烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸(NGD)、烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸(NTD)和烟酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)，它们具有如下的化学结构：

本发明涉及的NAD类似物参照文献方法（Ji DB,et al.Synthesis of NADanalogs to develop bioorthogonal redox system.Sci China Chem,2013,56:296）制备。

本发明使用的亚磷酸脱氢酶为具有以亚磷酸化合物为还原剂，催化还原NAD类似物为相应还原态的活性蛋白质。这些酶可以是野生的，如来源于Pseudomonas stutzeri WM88的亚磷酸脱氢酶psPDH(Genbank O69054)、来源于Ralstonia sp.strain4506的亚磷酸脱氢酶rsPDH(Genbank AEQ29500)。也可以是经过突变的亚磷酸脱氢酶，如rsPDH的突变体rsPDH-I151R、rsPDH-I151R/E213C、rsPDH-I151R/I218F以及psPDH的突变体psPDH-L151V/D213Q。这些酶的表达和纯化参照在大肠杆菌中表达其他氧化还原酶的文献方法进行（Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systems dependingon nicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133:20857）。

本发明涉及的NAD类似物和NAD一样含有烟酰胺单核苷酸单元，该单元的还原态为1,4-二氢烟酰胺单核苷酸。因此，NAD类似物还原态产物在340nm附近的紫外光谱区有较强吸收，摩尔消光系数ε₃₄₀约为6220M^-1·cm^-1（Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systems depending on nicotinamideflucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133:20857）。本发明利用该性质分析NAD类似物还原过程。用液相色谱定量NAD类似物及其还原态产物的条件为：液相色谱仪为Agilent1100，分析柱为Zorbax150mm×3.0mm C–18(3.5μm)，流动相为5mM硫酸四丁铵，流速为0.5mL/min。每个样品检测20min。检测波长为260nm（辅因子及其还原态在260nm有较强的光吸收)和340nm（还原态辅酶在340nm有较强的光吸收）。

本发明使用的亚磷酸化合物为亚磷酸、亚磷酸盐、氘代亚磷酸、氘代亚磷酸盐中的一种或两种以上的组合。

本发明制备的NAD类似物还原态产物，可被其他酶用做辅酶，应用于还原反应。因此，本发明可视为一种再生循环NAD类似物还原态的技术。通过本发明的技术，将亚磷酸化合物的还原力转移并贮存在于NAD类似物还原态，以便于对其他底物进行选择性还原。

本发明的优点和有益效果：以亚磷酸化合物作为还原剂价格低廉，其氧化产物磷酸化合物生物相容性好；酶催化还原条件温和，反应效率高，反应几乎不可逆；产物选择性高，应用于胞内体系时可将亚磷酸化合物的还原力选择性传递到目标代谢反应；由于细胞无内源的亚磷酸化合物代谢途径，而只能摄取培养基中的亚磷酸化合物，便于控制反应过程。此外，通过使用氘代亚磷酸或氘代亚磷酸盐，可获得氘代NAD类似物还原态，用于制备高纯度氘取代生物催化产物。

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

对比例1:无酶条件下亚磷酸与NAD类似物的反应

NAD类似物（NCD、NFCD、NBrCD、NClCD、NMeCD、NGD、NTD和NUD）参照文献方法（Ji DB,et al.Synthesis of NAD analogs to develop bioorthogonalredox system.Sci China Chem,2013,56:296）制备。NAD类似物用水制成浓度为20mM的溶液，备用。

将1mM的NAD类似物和4mM的亚磷酸溶解在1mL浓度为50mM，pH7.5的3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液中混匀，30℃反应2h，取20μL分析。

用HPLC检测NAD类似物底物及其还原态产物。液相色谱仪为Agilent1100，分析柱为Zorbax150mm×3.0mm C–18(3.5μm)，流动相为5mM硫酸四丁铵，流速为0.5mL/min。每个样品检测20min。检测波长为260nm（类似物及其还原态在260nm有较强吸收）和340nm（类似物还原态在340nm有较强吸收）。

分析发现，所有反应的样品在340nm没有特征峰，在260nm仅检测到与NAD类似物保留时间相同的特征峰。说明无酶条件下亚磷酸不能直接还原NAD类似物。

对比例2:酶失活条件下亚磷酸与NAD类似物的反应

将来源于Ralstonia sp.strain4506的亚磷酸脱氢酶rsPDH(GenbankAEQ29500)在70℃水浴加热20min，备用。按文献方法（Hirota R,et al.Isolationand characterization of a soluble and thermostable phosphite dehydrogenasefrom Ralstonia sp.strain4506.J Biosci Bioeng,2012,113:445），以NAD为底物，检测表明样品失去了催化还原NAD为NADH的活性。

将NAD类似物NCD、NFCD、NBrCD、NClCD、NMeCD、NGD、NTD和NUD，逐一按下述方法进行反应：将1mM的NAD类似物、4mM亚磷酸和40μg灭活的亚磷酸脱氢酶rsPDH溶解在1mL浓度50mM，pH7.5的3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液中混匀，30℃反应2h，取20μL分析。

按对比例1的方法分析发现，所有反应的样品在340nm没有特征峰，在260nm仅检测到与NAD类似物保留时间相同的特征峰。说明加热灭活的酶不能催化亚磷酸还原NAD类似物。

实施例1：以亚磷酸为还原剂，亚磷酸脱氢酶催化还原NAD类似物

将NAD类似物NCD、NFCD、NBrCD、NClCD、NMeCD、NGD、NTD和NUD，与亚磷酸脱氢酶psPDH、psPDH-L151V/D213Q、rsPDH、rsPDH-I151R、rsPDH-I151R/E213C和rsPDH-I151R/I218F，逐一进行NAD类似物-亚磷酸脱氢酶组合，按下述方法进行反应：将1mM的NAD类似物、4mM的亚磷酸和40μg亚磷酸脱氢酶溶解在1mL浓度50mM，pH7.5的3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液中混匀，30℃反应20min，取20μL分析。

按对比例1的方法分析发现，所有反应的样品在340nm均出现了特征吸收峰，但不同组合得到的吸收峰强度有明显差别，说明亚磷酸脱氢酶可以催化亚磷酸还原NAD类似物。由于NAD类似物还原态产物的摩尔消光系数ε₃₄₀为6220M^-1·cm^-1，与NADH相同，用NADH标准品绘制标准曲线，得到定量结果（表1）。可见，psPDH的催化活性整体较低，其他几种亚磷酸脱氢酶均具有较好的活性。可依据不同的NAD类似物，选择合适的亚磷酸脱氢酶。

实施例1的结果表明，亚磷酸脱氢酶可以有效催化亚磷酸还原本发明涉及的NAD类似物，制备相应的还原态产物。综合实施例1、对比例1和对比例2的结果说明，以亚磷酸为还原剂，还原NAD类似物，活性亚磷酸脱氢酶起到了不可替代的作用。

表1.亚磷酸脱氢酶催化亚磷酸还原NAD类似物的实验结果

实施例2：还原态NAD类似物的制备

将实施例1的反应体系放大，可用于制备还原态NAD类似物。以NUDH为例，说明制备过程。将20mM的NUD、25mM的亚磷酸钠和5mg亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R溶解在10mL浓度为50mM，pH为7.5的3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液中混匀，30℃反应120min。反应结束后直接冷冻干燥，浓缩至总体积约4mL，用甲酸型阴离子交换树脂柱分离，在紫外波长340nm跟踪收集产物，冷冻干燥，得白色粉末11.6mg，产率约90%。

将上述白色粉末样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M+H)⁺为643.1026，与NUDH的理论分子量（C₂₀H₂₉N₄O₁₆P₂ ⁺，643.1054）一致，表明得到了还原态产物NUD。

实施例3：以亚磷酸钠为还原剂，亚磷酸脱氢酶催化还原NAD类似物

将0.1mM的NBrCD、0.4mM的亚磷酸钠和4μg亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R溶解在1mL浓度为50mM，pH8.0的3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液中混匀，40℃反应10min，取20μL分析。

按对比例1的方法分析发现，样品在340nm出现了特征吸收峰。生成的NBrCDH浓度达到73μM，即产率达到73%。

综合实施例1和实施例3的结果表明，亚磷酸脱氢酶催化还原NAD类似物的反应中，采用亚磷钠或亚磷酸为还原剂，均可使NAD类似物还原。

实施例4：以氘代亚磷酸为还原剂，亚磷酸脱氢酶催化还原NAD类似物

根据文献方法（Woodyer R,et al.Mechanistic investigation of a highly activephosphite dehydrogenase mutant and its application for NADPH regeneration.FEBS J,2005,272:3816），将亚磷酸溶解在D₂O中，冷冻干燥，重复4次获得氘代亚磷酸，备用。

将1mM的NCD、4mM氘代亚磷酸和40μg亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C溶解在1mL浓度50mM，pH5.0的3-(N-吗啉基)丙磺酸缓冲液中混匀，10℃反应120min，取20μL分析。

按对比例1的方法分析发现，样品在340nm出现了特征吸收峰。产物NCDH浓度达到0.91mM，即产率为91%。

将样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M-H)^-为641.1118，与NCD²H的理论分子量（C₂₀H₂₇ ²HN₅O₁₅P₂ ^-，641.1125）一致，表明得到了氘代NCD还原态产物。

实施例4的结果表明，亚磷酸脱氢酶可用氘代亚磷酸为还原剂，催化还原NAD类似物生成相应的氘代还原态产物。

实施例5：亚磷酸脱氢酶、苹果酸酶ME-L310R/Q401C和NAD类似物体系催化丙酮酸还原羧化制备苹果酸

参照文献（Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systems dependingon nicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133:20857）方法纯化苹果酸酶ME-L310R/Q401C，备用。ME-L310R/Q401C偏好类似物NCDH而对NADH活性低，需要以NCDH为辅因子。

苹果酸酶ME-L310R/Q401C可催化的反应为：丙酮酸+CO₂+NCDH→苹果酸+NCD。亚磷酸脱氢酶催化的反应为：亚磷酸+NCD→磷酸+NCDH。将两反应合并，净反应为：亚磷酸+丙酮酸+CO₂→苹果酸+磷酸。因此，亚磷酸脱氢酶和苹果酸酶构成的体系可实现以亚磷酸为还原剂，还原羧化丙酮酸生成苹果酸。该体系中，NAD类似物被循环再生，而且达到了固定CO₂的效果，具有一定的应用潜力。其中具有代表性的实验过程如下：

采用50mM，pH5.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液体系，100μL的反应体系组成为：4.0mM亚磷酸、50mM丙酮酸、0.01mM NCD、1.0mM MnCl₂、10mM碳酸氢钠、0.05mg/mL rsPDH-I151R/E213C和0.06mg/mLME-L310R/Q401C。10℃反应120min，加900μL乙腈甲醇水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1）终止反应。

利用美国戴安公司ICS-2500离子色谱系统在ED50脉冲电化学检测模式下分析测定反应溶液中苹果酸，丙酮酸和亚磷酸的含量。使用IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱(200mm×4mm)，IonPac AG11-HC阴离子交换保护柱(50mm×4mm)。分析条件：流动相为24mM NaOH，流速1mL/min，柱温：30℃，进样量25μL。检测结果表明，反应液含0.1mM亚磷酸、46.1mM丙酮酸和3.6mM苹果酸。

在进行上述反应时，设置了另外4组对照实验体系，分别缺少亚磷酸、NCD、rsPDH-I151R/E213C或ME-L310R/Q401C中的一种，分析发现这些反应没有产生苹果酸。根据反应的化学计量关系可知，NCD再生循环利用360次。

在进行上述反应时，还设置了1组实验，用氘代亚磷酸替代亚磷酸，其他成分和条件相同，分析发现反应液丙酮酸浓度降低为46.3mM同时产生3.5mM苹果酸，说明该体系可用氘代亚磷酸为还原剂，达到与亚磷酸为还原剂相当的效率。

实施例6：亚磷酸脱氢酶、D–乳酸脱氢酶DLDH-V152R和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸

参照文献（Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systems dependingon nicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133:20857）方法纯化D–乳酸脱氢酶DLDH-V152R，备用。D–乳酸脱氢酶DLDH-V152R偏好NAD类似物，需要以还原型类似物为辅因子。

乳酸脱氢酶催化的反应为：丙酮酸+NFCDH→D–乳酸+NFCD。亚磷酸脱氢酶催化的反应为：亚磷酸+NFCD→磷酸+NFCDH。将两反应合并，总反应为：亚磷酸+丙酮酸→D–乳酸+磷酸。因此，亚磷酸脱氢酶和D–乳酸脱氢酶构成的体系可实现以亚磷酸为还原剂，还原丙酮酸生成D–乳酸。该体系中，NAD类似物被循环再生，具有一定的应用潜力。其中具有代表性的实验过程如下：

采用50mM，pH8.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液体系，100μL的反应体系组成为：4.0mM亚磷酸、4.0mM丙酮酸、0.1mM NFCD、0.05mg/mLrsPDH-I151R和0.06mg/mL DLDH-V152R。40℃反应10min，加900μL乙腈甲醇水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1）终止反应。

参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含0.5mM亚磷酸、3.3mM D–乳酸、丙酮酸浓度0.6mM。

实验结果表明，该体系利用亚磷酸为还原剂，近定量地将丙酮酸还原为乳酸，取得了很高原料利用的效率。根据反应的化学计量关系可知，NFCD再生循环利用33次。

实施例7：醇脱氢酶利用还原态NAD类似物催化醛还原反应

参照实施例2的方法制备还原态类似物NTDH，备用。

采用20mM，pH7.5的磷酸钠盐缓冲液体系，500μL反应体系组成为：3.0mM乙醛、2.0mM NTDH、0.1mg/mL来源于酿酒酵母醇脱氢酶（购自Sigma公司，货号：A3263）。30℃反应，用分光光度计在紫外波长340nm处跟踪反应。反应30min后，体系中NTDH降低为0.8mM。同时，体系中产生了1.1mM乙醇。

在没有添加酿酒酵母醇脱氢酶的对照实验体中，反应30min后NTDH浓度未见明显变化。实施例7的结果说明还原态NAD类似物可被氧化还原酶用作辅酶，催化还原反应。

实施例8：亚磷酸脱氢酶介导的胞内还原NAD类似物及其应用

可以将所识别NAD类似物的亚磷酸脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主细胞中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的亚磷酸化合物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。因此，应用亚磷酸脱氢酶介导的胞内还原NAD类似物的技术，可将胞外还原力选择性传递到胞内目标氧化还原反应。下面以改造大肠杆菌Escherichia coli XZ654（Zhang X,et al.L–Malate production by metabolicallyengineered Escherichia coli.Appl Environ Microbiol,2011,77:427），构建生产苹果酸的工程菌株为例予以说明。

NAD转运蛋白AtNDT2（Accession No.NC_003070）具有较宽泛的底物谱（Palmieri FB, et al. Molecular identification and functional characterization ofArabidopsis thaliana mitochondrial and chloroplastic NAD+ carrier proteins. J BiolChem, 2009, 284: 31249），可以转运NCD。将表达转运蛋白AtNDT2的基因由gapAP1启动子（Charpentier B, et al. The Escherichia coli gapa gene is transcribed bythe vegetative RNA-polymerase holoenzyme E-sigma70 and by the heat-shockRNA-polymerase E-sigma³².J Bacteriol, 1994, 176(3): 830）控制表达。将编码rsPDH-I151R/E213C的基因和编码ME-L310R/Q401C的基因，由异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒上获得工程质粒。

将上述工程质粒导入E. coli XZ654获得工程菌株E. coli WL005。在LB培养基中诱导工程菌E.coli WL005表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100 μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃的200rpm摇床中培养48h至菌体密度OD_600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。

用pH 7.5的MOPS培养基（Hirota R., et al. "Isolation and characterization of asoluble and thermostable phosphite dehydrogenase from Ralstonia sp. strain4506." J. Biosci. Bioeng. 2012,113(4): 445）洗涤重悬菌体，将菌体密度OD_600nm调整到9。上述工程菌悬液中加入10 mM碳酸氢钠、10 mM丙酮酸、5 mM亚磷酸、0.1 mM的NCD，分别在16℃、30℃、42℃的200 rpm摇床中厌氧反应4h，取100 μL加900 μL乙腈甲醇水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1）终止反应。

参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明16℃反应液含1.8mM亚磷酸、2.8 mM 苹果酸、7.1 mM丙酮酸。30℃反应液含0.2 mM亚磷酸、4.3mM苹果酸、5.4mM丙酮酸。42℃反应液含0.5 mM亚磷酸、3.8 mM苹果酸、5.6mM丙酮酸。

在只添加亚磷酸和NCD中的一种及不添加亚磷酸和NCD的对照实验中，苹果酸浓度分别为2.2mM、1.9mM和1.9mM。

实验结果表明在全细胞催化过程中亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C通过氧化亚磷酸为ME-L310R/Q401C提供NCDH，催化丙酮酸还原羧化生成苹果酸，使苹果酸产量由1.9mM提高到4.3mM。只添加亚磷酸时苹果酸产量没有明显增加，只添加NCD时苹果酸不增加。

实施例8说明，在全细胞催化过程中胞内亚磷酸脱氢酶可以通过氧化亚磷酸提供还原态的NAD类似物，被ME-L310R/Q401C用做辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内苹果酸的代谢强度的方式。

实施例9：亚磷酸脱氢酶介导的胞内还原NAD类似物及其应用

可以将所识别NAD类似物的亚磷酸脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主细胞中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。下面以改造大肠杆菌Escherichia coli XZ654（Zhang X, et al.L–Malate production by metabolically engineered Escherichia coli. Appl EnvironMicrobiol, 2011, 77: 427），构建生产乳酸的工程菌株为例予以说明。

NAD转运蛋白NTT4（Haferkamp I,Schmitz-Esser S,Linka N,Urbany C,Collingro A,Wagner M,et al.A candidate NAD+transporter in an intracellularbacterial symbiont related to Chlamydiae.Nature.2004;432:622-5.），可以转运NGD。将表达转运蛋白NTT4的基因由gapA P1启动子控制表达。将编码rsPDH-I151R/I218F的基因和编码DLDH-V152R的基因，由异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒上获得工程质粒。

将上述工程质粒导入E.coli XZ654获得工程菌株E.coli WL006。在LB培养基中诱导工程菌E.coli WL006表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃的200rpm摇床中培养48h至菌体密度OD_600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。

用pH8.0的M9培养基洗涤重悬菌体，将菌体密度OD_600nm调整到9。上述工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM亚磷酸、0.1mM的NGD，分别在30℃的200rpm摇床中厌氧反应3h，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1）终止反应。

参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明30℃反应液含0.1mM亚磷酸、4.9mM乳酸、4.7mM丙酮酸。

在只添加亚磷酸和NGD中的一种及不添加亚磷酸和NGD的对照试验中，乳酸浓度分别为0.9mM、0.9mM和0.6mM。

实验结果表明在全细胞催化过程中亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/I218F通过氧化亚磷酸为DLDH-V152R提供NGDH，催化丙酮酸还原生成乳酸，使乳酸产量由0.6mM提高到4.9mM。只添加亚磷酸或NGD时乳酸产量没有明显增加。

实施例9说明，在全细胞催化过程中胞内亚磷酸脱氢酶可以通过氧化亚磷酸提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用做辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。

实施例10：亚磷酸脱氢酶介导的透性化细胞胞内还原NAD类似物及其应用

可以将所识别NAD类似物的亚磷酸脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在宿主细胞中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的亚磷酸化合物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。

将编码rsPDH-I151R的基因和编码DLDH-V152R的基因，由异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的lac启动子控制，将上述两种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒上获得工程质粒。

将上述工程质粒导入E.coli XZ654获得工程菌株E.coli WL007。在LB培养基中诱导工程菌E.coli WL007表达上述两种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃的200rpm摇床中培养48h至菌体密度OD_600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM,pH7.5的Tris–Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD_600nm调整到9。按文献方法使细胞透性化（Zhang,W.,K.O'Connor,D.I.C.Wang,Z.Li,"Bioreduction with Efficient Recycling of NADPH byCoupled Permeabilized Microorganisms".Appl Environ Microbiol,2009.75(3):687-694），制备方式为，取5mL的冻存细胞室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1%的甲苯，30℃转速200rpm摇床温浴30min然后再在4℃放置1h。2000g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度50mM,pH7.5的Tris–Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度50mM,pH5.0的Tris–Cl，获得透性化细胞。

上述用浓度50mM,pH5.0的Tris–Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM亚磷酸、0.1mM的NCD，在30℃的200rpm摇床中厌氧反应0.5h，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1）终止反应。

参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含2.1mM亚磷酸、2.6mM乳酸、7.1mM丙酮酸。

在只添加亚磷酸和NCD中的一种及不添加亚磷酸和NCD的对照实验中，乳酸浓度分别为0.6mM、0.4mM和0.3mM。

实验结果表明在全细胞催化过程中亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R通过氧化亚磷酸为DLDH-V152R提供NCDH，催化丙酮酸还原生成乳酸，使乳酸产量由0.3mM提高到2.6mM。只添加亚磷酸或NCD时苹果酸产量没有明显增加。

实施例10说明，在全细胞催化过程中胞内亚磷酸脱氢酶可以通过氧化亚磷酸提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用做辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。

实施例11：亚磷酸脱氢酶介导的透性化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)AS1.2829细胞胞内还原NAD类似物及其应用

可以将所识别NAD类似物的亚磷酸脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在乳酸乳球菌细胞中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的亚磷酸化合物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。

将编码rsPDH-I151R的基因和编码DLDH-V152R的基因，由组成型表达启动子P32控制，将上述两种表达盒通过替换pMG36e的P32表达盒（van de Guchte,M.,J.M.van der Vossen,J.Kok,G.Venema,"Construction of a lactococcalexpression vector:expression of hen egg white lysozyme in Lactococcus lactissubsp.lactis".Appl Environ Microbiol,1989.55(1):224-8.）获得工程质粒。

将上述工程质粒导入乳酸乳球菌获得工程菌株L.lactis WL001。用pH6.8的含有10g/L蔗糖、10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L的KH₂PO₄、2g/L的NaCl、0.2g/L的MgSO₄和5mg/L红霉素的培养基诱导工程菌L.lactis WL001表达上述两种功能蛋白，在25℃的200rpm摇床中培养48h至菌体密度OD_600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM,pH7.5的Tris–Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD_600nm调整到9。参照实施例10方法使细胞透性化，制备方式为，取5mL的冻存细胞室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1%的甲苯，30℃转速200rpm摇床温浴30min然后再在4℃放置1h。2000g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度50mM,pH7.5的Tris–Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度50mM,pH7.5的Tris–Cl，获得透性化细胞。

上述用浓度50mM,pH7.5的Tris–Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM亚磷酸、0.1mM的NCD，在30℃的200rpm摇床中厌氧反应1h，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1）终止反应。

参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含1.9mM亚磷酸、2.7mM乳酸、7.1mM丙酮酸。

在只添加亚磷酸和NCD中的一种及不添加亚磷酸和NCD的对照实验中，乳酸浓度分别为0.4mM、0.4mM和0.2mM。

实施例11说明，在乳酸乳球菌全细胞催化过程中胞内亚磷酸脱氢酶可以通过氧化亚磷酸提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用做辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。

实施例12：亚磷酸脱氢酶介导的透性化酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）BY4741细胞胞内还原NAD类似物及其应用

可以将所识别NAD类似物的亚磷酸脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在酿酒酵母细胞中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的亚磷酸化合物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。

将编码rsPDH-I151R的基因和编码DLDH-V152R的基因，由TEF组成型启动子,CYC1终止子控制，将上述两种表达盒整合到p416酵母游离型穿梭表达载体获得工程质粒。

将上述工程质粒导入酿酒酵母获得工程菌株S.cerevisiae WL002。用pH6.0的含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨的YEPD培养基诱导工程菌S.cerevisiae WL002表达上述两种功能蛋白，在25℃的200rpm摇床中培养48h至菌体密度OD_600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM,pH7.5的Tris–Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD_600nm调整到9。参照实施例11方法使细胞透性化，获得透性化细胞。

上述用浓度50mM,pH7.5的Tris–Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM亚磷酸、0.1mM的NCD，在30℃的200rpm摇床中厌氧反应1h，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1）终止反应。

参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含0.6mM亚磷酸、3.7mM乳酸、6.1mM丙酮酸。

在只添加亚磷酸和NCD中的一种及不添加亚磷酸和NCD的对照实验中，乳酸浓度分别为0.4mM、0.6mM和0.4mM。

实施例12说明，在酿酒酵母全细胞催化过程中胞内亚磷酸脱氢酶可以通过氧化亚磷酸提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用做辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。

实施例13：亚磷酸脱氢酶介导的里氏木霉(Trichoderma reesei)胞内还原NAD类似物及其应用

可以将所识别NAD类似物的亚磷酸脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在里氏木霉细胞中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的亚磷酸化合物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。

将编码rsPDH-I151R的基因和编码DLDH-V152R的基因，由启动子Pcbh1和终止子Tcbh1控制，将上述两种表达盒整合到pCAMBIA1300载体上获得工程质粒。

将上述工程质粒导入里氏木霉获得工程菌株T.reesei WL003，用pH4.8的含有15g/L乳糖、10g/L酵母提取物、1g/L的(NH₄)₂SO₄、3g/L的KH₂PO₄、0.5g/L的Mg SO₄、0.6g/L的CaC1₂、0.005g/L的FeSO₄·7H₂O、0.0016g/L的MnSO₄·H₂O、0.0014g/L的ZnSO₄·7H₂O、0.0037g/L的CoCl₂·6H₂O的培养基诱导工程菌T.reeseiWL003表达上述两种功能蛋白，在25℃的200rpm摇床中培养48h，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM,pH7.5的Tris–Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度调整到3g菌体干重/L。参照实施例11方法使细胞透性化，获得透性化细胞。

上述用浓度50mM,pH7.5的Tris–Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM亚磷酸、0.1mM的NCD，在30℃的200rpm摇床中厌氧反应2h，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液（乙腈：甲醇：水=4:4:1）终止反应。

参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含1.5mM亚磷酸、3.3mM乳酸、6.4mM丙酮酸。

在只添加亚磷酸和NCD中的一种及不添加亚磷酸和NCD的对照实验中，乳酸浓度分别为1.2mM、0.9mM和0.6mM。

实施例13说明，在里氏木霉全细胞催化过程中胞内亚磷酸脱氢酶可以通过氧化亚磷酸提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用做辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。

Claims (10)

1.一种NAD类似物的还原方法，其特征在于：还原剂为亚磷酸化合物，催化剂为可利用亚磷酸化合物的酶。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所还原的NAD类似物为NCD、NFCD、NClCD、NBrCD、NMeCD、NGD、NTD和NUD中的一种或两种以上，它们的化学结构如下：

3.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述可利用亚磷酸化合物的酶为具有以亚磷酸化合物为还原剂，催化还原NAD类似物为相应还原态的活性蛋白质。

4.按照权利要求1或3所述的方法，其特征还在于：所述可利用亚磷酸化合物的酶为天然的或经过基因工程突变的酶；

可利用亚磷酸化合物的酶为亚磷酸脱氢酶psPDH、psPDH-L151V/D213Q、rsPDH、rsPDH-I151R、rsPDH-I151R/E213C和rsPDH-I151R/I218F中的一种或两种以上。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述亚磷酸化合物为亚磷酸、亚磷酸盐、氘代亚磷酸、氘代亚磷酸盐中的一种或两种以上的任意比组合。

6.按照权利要求4或5所述NAD类似物的还原方法，其特征还在于：利用所述亚磷酸脱氢酶还原NAD类似物，采用pH5–8的缓冲液体系，反应温度10–40℃，得到还原态NAD类似物；

缓冲液体系中亚磷酸脱氢酶的浓度4μg/mL-500μg/mL、NAD类似物的浓度0.01mM-20mM、亚磷酸化合物的浓度0.4mM-25mM。

7.按照权利要求1所述NAD类似物的还原方法，其特征还在于：所述NAD类似物还原得到的还原态产物，被其他酶用做辅酶应用于还原反应，所述其他酶包括但不局限于：催化丙酮酸还原为苹果酸的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、催化丙酮酸还原为乳酸的乳酸脱氢酶DLDH-V152R；催化乙醛还原为乙醇的酿酒酵母醇脱氢酶。

8.按照权利要求1或7所述NAD类似物的还原方法，其特征还在于：利用所述亚磷酸脱氢酶还原NAD类似物，为包括但不局限于ME-L310R/Q401C、DLDH-V152R、或酿酒酵母醇脱氢酶提供还原型辅酶时，采用pH5–8的缓冲液体系、反应温度10–40℃。

9.按照权利要求1所述NAD类似物的还原方法，其特征还在于：所述可利用亚磷酸化合物的酶表达在微生物的细胞内，而NAD类似物及亚磷酸化合物进入细胞，NAD类似物还原反应在细胞内进行。

10.按照权利要求1或9所述NAD类似物的还原方法，其特征还在于：所述表达亚磷酸脱氢酶并用于胞内还原NAD类似物的微生物包括但不局限于原核微生物，如大肠杆菌、或乳酸乳球菌或真核微生物，如酿酒酵母、或里氏木霉。