CN111218485A - 一种生产ω-1-羟基脂肪酸的方法 - Google Patents

一种生产ω-1-羟基脂肪酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产ω‑1‑羟基脂肪酸的方法。以NADH类似物依赖型的细胞色素P450为生物催化剂，以NADH类似物为辅因子，催化底物脂肪酸次末端C‑H羟基化，生成ω‑1‑羟基脂肪酸。NADH类似物依赖型的细胞色素P450可用于与再生NADH类似物的再生酶及对应再生底物偶联催化下，利用NAD类似物为辅因子，生成ω‑1‑羟基脂肪酸。该NADH类似物依赖型细胞色素P450酶可用于构建生物正交的不依赖天然辅因子NADPH的合成羟化脂肪酸的代谢途径，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。

Description

一种生产ω-1-羟基脂肪酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及利用辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)类似物依赖型细胞色素P450生产ω-1-羟基脂肪酸，具体地说，是经基因工程改造的P450 BM3，以NAD(H)类似物为辅因子，催化脂肪酸羟基化，并应用到构建生物正交的脂肪酸羟基化代谢途径，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。
背景技术
ω-羟基脂肪酸是在精细化工领域具有广泛应用的脂肪族衍生物，可用于生产可降解聚合材料、表面活性剂、化妆品成分及食品添加剂等，目前主要以蓖麻油、大豆油等油料作物为原料进行脂肪酸化学羟化，但存在选择性低、合成路线复杂等突出问题，尤其是国内外迄今尚未实现C12-C18羟基脂肪酸的商业化生产(翁佩芳，吴祖芳.中国粮油学报，2008，23：203-206)。而细胞色素P450单加氧酶可选择性催化脂肪酸羟基化生成-羟基脂肪酸，具有反应条件温和、原料可再生、反应选择性高等特点(Kang，M.K.，and Nielsen，J.JInd Microbiol Biotechnol，2017，44：613-622.)。
细胞色素P450酶是一类功能多样的硫醇盐-亚铁血红素酶蛋白，可选择性活化C-H键、N-H键、S-H键等，从而催化20余种不同类型的反应，实现对大量不同结构底物的选择性羟化、环氧化、脱烷基等修饰性反应，被誉为自然界的“万能催化剂”。P450 BM3是来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的脂肪酸羟化酶，是目前文献报道催化效率最高的P450酶，催化效率高达17000min-1，包括含有血红素的P450结构域和P450还原酶结构域的融合的双功能自给自足型P450酶。野生型P450 BM3利用NADPH和O2催化脂肪酸次末端亚甲基羟基化生成ω-1(or 2 or 3)-羟基脂肪酸，而P450 BM3 F87A脂肪酸羟基化产物只有ω-1-羟基脂肪酸(Christopher J.C.Whitehouse，et al.P450 BM3(CYP102A1)：connectingthe dots.Chem Soc Rev，2012，41，1218-1260)。但其生物转化体系仍存依赖还原型辅酶和宿主底物供给能力弱等问题，严重制约其工业化应用。
烟酰胺类辅因子(NAD(P))及其还原态NAD(P)H是生命过程中的重要辅酶，参与生命体中一系列重要生物化学过程，任何改变NAD浓度及其氧化还原状态的操作都会对细胞产生全局性影响。而利用NAD类似物和只能识别其的突变型氧化还原酶，可实现在辅酶水平对目标氧化还原过程进行调控，对生物催化和合成生物学研究具有重要意义(Ji DB，etal.Creation of bioorthogonal redox systems depending on nicotinamideflucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc，2011，133，20857 20862 Wang L，etal.Synthetic cofactor-linked metabolic circuits for selective energytransfer.ACS Catal，2017，7，1977 1983)。本研究组报道了几种具有良好生物相容性的NAD类似物(Ji DB，et al.Creation of bioorthogonal redox systems depending onnicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc，2011，133，20857 20862 JiDB，et al.Synthesis of NAD analogs to develop bioorthogonal redox system.SciChina Chem，2013，56，296-300)。同时，也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如来自粪肠球菌Enterococcus faecalis的NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、D-乳酸脱氢酶(DLDH，Gnebank CAA47255)V152R突变体、苹果酸酶(ME，Genbank P26616)L310R/Q401C突变体、苹果酸脱氢酶(MDH，Genbank CAA68326)L6R突变体。目前，已经实现利用NAD类似物进行胞内代谢反应的调控，通过向胞内转运NCD，DLDH-V152R可利用NCD将丙酮酸还原为乳酸，实现了特异性的生物催化调控(Wang L，et al.Synthetic cofactor-linked metaboliccircuits for selective energy transfer.ACS Catal，2017，7，1977 1983)。
因此构建NADH类似物依赖型的细胞色素P450酶，对实现P450脂肪酸脱羧酶/羟化酶的能量消耗与内源NADPH供给解耦联具有重要意义。
发明内容
本发明属于生物技术领域，涉及利用辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)类似物依赖型细胞色素P450生产ω-1-羟基脂肪酸，具体地说，是经基因工程改造的P450 BM3，以NAD(H)类似物为辅因子，催化脂肪酸羟基化，并应用到构建生物正交的脂肪酸羟基化代谢途径，实现P450酶催化的能量消耗与内源能量代谢解偶联。因此，本发明的方法可应用在生物催化和生物转化领域，具有重要价值。
一种生产ω-1-羟基脂肪酸的方法，其特征在于：以NADH类似物依赖型的细胞色素P450酶为生物催化剂，以NADH类似物为辅因子，催化底物脂肪酸中与ω-甲基连接CH2羟基化，生成ω-1-羟基脂肪酸。
细胞色素P450酶为来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megatherium的自己自足型P450 BM3(CYP102A1)，编码基因具有SEQ ID NO：1的基因序列，其编码的蛋白质具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列；
NADH类似物依赖型细胞色素P450酶为在SEQ ID NO：2的氨基酸序列基础上的多位点突变体，突变位点包括但不限于P450 BM3-R967D/K973S(P450 BM3的第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第973位的赖氨酸K突变为丝氨酸S)、P450 BM3-R967D/K973S/Q977F(P450 BM3的第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第973位的赖氨酸K突变为丝氨酸S，第977位谷氨酰胺Q突变为苯丙氨酸F)、P450 BM3-R967D/K973S/Q1005H(P450 BM3的第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第973位的赖氨酸K突变为丝氨酸S，第1005位谷氨酰胺Q突变为组氨酸H)、P450 BM3-R967D/Q977F/W1047S(P450 BM3的第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第977位谷氨酰胺Q突变为苯丙氨酸F，第1047位的酪氨酸W突变为丝氨酸S)、P450BM3-R967D/Q1005H/W1047S(P450 BM3的第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第1005位谷氨酰胺Q突变为组氨酸H，第1047位的酪氨酸W突变为丝氨酸S)、P450 BM3-R967D/K973S/W1047S(P450 BM3的第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第973位的赖氨酸K突变为丝氨酸S，第1047位的酪氨酸W突变为丝氨酸S)、P450 BM3-R967D/K973S/Q977F/W1047S(P450 BM3的第967位的赖氨酸R突变为天冬氨酸D，第973位的赖氨酸K突变为丝氨酸S，第977位谷氨酰胺Q突变为苯丙氨酸F，第1047位的酪氨酸W突变为丝氨酸S)中的一种或两种以上。
NADH类似物为NCDH、NTDH和NUDH中的一种或两种以上，其化学结构如下：
Figure BDA0001879795720000031
NADH类似物NCDH、NTDH或NUDH是由酶法或化学法还原NCD、NTD或NUD而得，NCD、NTD和NUD的化学结构如下：
Figure BDA0001879795720000032
酶法还原NCD、NTD或NUD的再生酶为包括但不限于苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y中的一种或两种以上；
所述再生NADH类似物的氧化还原酶对应再生底物包括但不限于苹果酸化合物，亚磷酸化合物，D-乳酸化合物，甲酸化合物中的一种或两种以上；其中，苹果酸化合物为苹果酸、苹果酸盐中的一种或两种以上；D-乳酸化合物为D-乳酸、D-乳酸盐中的一种或两种以上；亚磷酸化合物为亚磷酸、亚磷酸盐中的一种或两种以上；甲酸化合物为甲酸、甲酸盐中的一种或两种以上；
所述酶法再生NADH类似物的反应体系为pH 7.5的缓冲液中，NAD类似物1mM-20mM，再生酶10U-500U，再生底物4mM-25mM，20℃-40℃下反应20min-2h。；其中，缓冲体系包括但不限于MES、Tris-HCl、磷酸盐或HEPES缓冲液中的一种或两种；
化学法还原NCD、NTD和NUD中的一种或两种以上的反应体系为水溶液，还原剂为Na2S2O4、NaBH4、NaBH(Et)3、NaBH3CN中的一种或两种以上的任意比例组合，其中NAD类似物与还原剂的比例为1∶2-4，20℃-40℃下反应20min-2h。
底物脂肪酸为C12-C18饱和脂肪酸中的一种或两种以上的任意组合。
在pH5-9的缓冲体系中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶以NADH类似物为辅因子，催化C12-C18脂肪酸次末端C-H羟基化，生成ω-羟基脂肪酸；其中，缓冲体系包括但不限于MES、Tris-HCl、磷酸盐或HEPES缓冲液中的一种或两种以上。
在pH 5-9的缓冲体系中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶，偶联再生NADH类似物的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y及对应再生底物，催化C12-C18脂肪酸次末端C-H羟基化，生成ω-羟基脂肪酸；其中，缓冲体系包括但不限于MES、Tris-HCl、磷酸盐或HEPES缓冲液中的一种或两种以上。
将所述NADH类似物依赖型的细胞色素P450酶、与来源于衣原体的NTT4或来源于拟南芥的AtNDT2蛋白以及再生NADH类似物的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y的一种或两种以上在微生物细胞内共表达，以微生物细胞为催化剂催化脂肪酸生产ω-羟基脂肪酸；其中NAD类似物通过来源于衣原体的NTT4或来源于拟南芥的AtNDT2蛋白转运至胞内。
所述表达NADH类似物依赖型细胞色素P450酶并用于催化脂肪酸羟基化的微生物细胞包括但不局限于原核微生物中的大肠杆菌，乳酸乳球菌；真核微生物中的酿酒酵母，里氏木霉中的一种或两种以上。
本发明所使用的苹果酸酶来自大肠杆菌K12(UniProt code P26616)，D-乳酸脱氢酶来自Lactobacillus helveticus(Uniprot code P30901)，亚磷酸脱氢酶来自Ralstoniasp.strain 4506(Uniprot code G4XDR8)，甲酸脱氢酶来自Pseudomonas sp.101(Uniprotcode P33160)。本发明所用到的突变型脱氢酶是利用
Figure BDA0001879795720000041
单位点突变试剂盒引入氨基酸突变得到突变型苹果酸酶(L310R/Q401C)、突变型乳酸脱氢酶(V152R)、突变型亚磷酸脱氢酶(I151R)和突变型甲酸脱氢酶(L287R)。本发明所用的以上氧化还原酶都是按文献(Protein Expression and Purification，2007，53，97-103)方法表达纯化。
本发明的优点和有益效果：酶催化条件温和，反应效率高；产物选择性高，应用于胞内体系时可将有机或小分子的化学能还原力选择性传递到脂肪酸氧化的目标代谢反应。此外，NADH类似物依赖型的细胞色素P450酶，实现P450酶的能量消耗与内源NADPH供给解耦联。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
NAD类似物(NCD、NTD和NUD)参照文献方法(Ji DB，et al.Synthesis of NADanalogs to develop bioorthogonal redox system.Sci China Chem，2013，56，296-300)制备。NAD类似物用水制成浓度为20mM的溶液，备用。
大肠杆菌等原核生物转化的电转化方法参照《分子克隆指南》第三版，酿酒酵母等真核生物转化的方法参照文献(Gietz，R.D.，et al.Nature Protocols 2007，2，31)中醋酸锂转化方法。
酶的突变与筛选：在晶体结构分析软件Pymol中，选取来源于来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)P450 BM3晶体结构(PDB ID：4DQL)做为模板，选取氨基酸序列SEQID NO：2中与NAD辅酶AMP部分相结合的氨基酸残基，将其对应的DNA序列SEQ ID NO：1中相应的碱基用RF克隆(Wang JX，et al.J.Microbiol.Meth.2007，71，225)的方法进行迭代饱和突变，并通过RF克隆的方法，整合到pUC18载体上，将获得质粒DAN转化至宿主E.coliBL21(DE3)中，挑取单克隆接至LB培养基，加入IPTG至终浓度0.5mM，25℃下200rpm培养48h，4000rpm离心，去上清，菌体用溶菌酶裂解，细胞裂解液上清，通过与偶联再生NADH类似物的再生酶的显色反应液，进行显色并筛选。筛选方法如下，在90显色反应液(50mM pH7.5HEPES缓冲液中，噻唑蓝(MTT)0.4mM，NAD类似物20M，NADH类似物再生酶10U，再生底物1mM)中加入10L突变文库转化子裂解液上清，利用Beckman高通量筛选液体工作测定粗酶活，获得具有识别NADH类似物的突变型。
酶的表达纯化：挑取突变型工程菌，用Ni亲和层析柱按文献方法(Wang JX，etal.Protein Express.Purif.2007，53，97)进行蛋白质的过表达纯化，备用。蛋白含量测定以牛血清白蛋白ABS为标准蛋白，采用Bradford法测定。
再生底物以及相应产物的检测：利用美国Thermo公司ICS-5000+离子色谱系统在ED50脉冲电化学检测模式下分析测定反应溶液中苹果酸，乳酸，甲酸或亚磷酸等再生底物和对应产物的含量。使用IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱(200mm×4mm)，IonPac AG11-HC阴离子交换保护柱(50mm×4mm)。分析条件：流动相为24mM NaOH，流速1mL/min，柱温：30℃，进样量25L。NAD及NADH类似物采用液相色谱仪Agilent 1100分析，分析柱为Zorbax150mm×3.0mm C18(3.5m)，流动相为5mM硫酸四丁铵，流速为0.5mL/min。每个样品检测20min。紫外检测器波长为264nm(类似物及其还原态在260nm有较强吸收)和340nm(类似物还原态在340nm有较强吸收)。C12-C18脂肪酸和羟基化产物经硅烷化，采用天美GC-7890F气相色谱分析，分析柱为极性柱FFAP石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.4m)；柱温190℃，进样器温度250℃，检测器(FID)温度280℃；进样量0.2L；载气N2 40mL/min，H2 40.6mL/min，空气130mL/min；分流进样，柱前压0.22Mpa。通过标准品，对照标准样品进行定性，采用面积归一法确定相对含量。
实施例1：酶法还原NAD类似物NCD、NTD和NUD为还原型NADH类似物NCDH、NTDH和NUDH。
将NAD类似物NCD、NTD和NUD，分别用苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y还原，按下述方法进行反应：将1mM的NAD类似物、4mM的底物(苹果酸、D-乳酸、亚磷酸或甲酸中的一种)和10U的酶(苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y中的一种)溶解在1mL浓度50mM，pH 7.5的HEPES缓冲液中混匀，30℃反应20min，取20L分析。
分析发现，所有样品在340nm均出现了特征吸收峰，说明苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R和甲酸脱氢酶FDH-G171Y可以利用底物催化还原NAD类似物。由于NAD类似物还原态产物的摩尔消光系数340约为6220M-1cm-1，与NADH相同，用NADH标准品绘制曲线，得到定量结果(表1)。可见，不同的酶催化不同的类似物活性不同。可依据不同的NAD类似物，选择合适的再生酶。
表1酶法还原NADH类似物的实验结果
Figure BDA0001879795720000061
Figure BDA0001879795720000071
实施例2：还原态NAD类似物的酶法制备
将实施例1的反应体系放大，可用于制备还原态NAD类似物。以甲酸脱氢酶FDH-G171Y利用甲酸钠制备NUDH为例，说明制备过程。将20mM的NUD、25mM的甲酸钠和5mg的甲酸脱氢酶FDH-G171Y溶解在10mL浓度为50mM，pH为7.5的磷酸钠缓冲液中混匀，30℃反应2h。反应结束后直接冷冻干燥，浓缩至总体积约为4mL，用甲酸型阴离子交换树脂柱(201×4)分离，在紫外波长340nm跟踪收集产物，冷冻干燥，得白色粉末11.6mg，产率约90。将上述白色粉末样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M+H)+为643.1026，与NUDH的理论分子量(C20H29N4O16P2 +，643.1054)一致，表明得到了还原态产物NUDH。
按照实施例2的方法制备得NCDH、NTDH和NUDH。
实施例3：化学法还原NAD类似物NCD、NTD和NUD为还原型NADH类似物NCDH、NTDH和NUDH。
将NAD类似物NCD、NTD和NUD，分别用Na2S2O4、NaBH4、NaBH(Et)3、NaBH3CN还原，按下述方法进行反应：将1mM的NAD类似物、4mM的还原剂(Na2S2O4、NaBH4、NaBH(Et)3、NaBH3CN)溶解在1mL的H2O中混匀，30℃反应20min，取20L分析。
分析发现，所有样品在340nm均出现了特征吸收峰，说明Na2S2O4、NaBH4、NaBH(Et)3、NaBH3CN可以还原NAD类似物。定量方法同实施例1，结果如表2。可见化学还原剂Na2S2O4、NaBH4、NaBH(Et)3、NaBH3CN均可用于还原NAD类似物制备NADH类似物，没有底物选择性。
表2化学法还原NAD类似物的实验结果
Figure BDA0001879795720000072
Figure BDA0001879795720000081
实施例4：还原态NAD类似物的化学法制备
将实施例3的反应体系放大，可用于制备还原态NAD类似物。以Na2S2O4还原制备NCDH为例，说明制备过程。将20mM的NCD、80mM的Na2S2O4和80mM的碳酸钠溶解在10mL水中混匀，30℃反应2h。反应结束后直接冷冻干燥，浓缩至总体积约为4mL，用甲酸型阴离子交换树脂柱(201×4)分离，在紫外波长340nm跟踪收集产物，冷冻干燥，得白色粉末11.6mg，产率约90。将上述白色粉末样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M+H)+为642.1210，与NCDH的理论分子量(C20H20N5O15P2 +，642.1208)一致，表明得到了还原态产物NCDH。
按照实施例4的方法制备得NTDH和NUDH。
实施例5：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶利用NADH类似物催化月桂酸(C12:0)为ω-羟基月桂酸。
采用50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲体系，500L的反应体系组成为：0.4mM月桂酸、0.6mM NADH类似物(NCDH、NTDH或NUDH)、0.1mg/mL NADH类似物依赖型细胞色素P450酶(P450 BM3-R967D/K973S、P450 BM3-R967D/K973S/Q977F、P450 BM3-R967D/K973S/Q977F/W1047S)，底物月桂酸用DMSO助溶，DMSO用量小于反应体系的5，30℃反应1h，测定340nm吸光值确定NADH类似物消耗，发现NADH类似物均完全消耗，500L反应液中加入100L的1M HCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22m有机滤膜过滤，取150L加入50L硅烷化试剂N-甲基N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生化后经GC分析，结果如表3所示。以野生型P450 BM3以及不加酶或不加NADH类似物为对照，发现不加酶或不加NADH类似物时均没有产物ω-羟基月桂酸的产生。野生型P450 BM3为催化剂时只有微量产物ω-羟基月桂酸的生成。而NADH类似物依赖型细胞色素P450酶P450 BM3-R967D/K973S、P450 BM3-R967D/K973S/Q977F、P450 BM3-R967D/K973S/Q977F/W1047S，利用不同的NADH类似物时，月桂酸(C12:0)的转化率均较高，但不同基因工程酶利用不同NADH类似物的催化活性不同。
表3 NADH类似物依赖型细胞色素P450酶利用NADH类似物催化月桂酸的实验结果
Figure BDA0001879795720000082
Figure BDA0001879795720000091
实施例6：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶与NADH类似物再生酶偶联的体系催化肉豆蔻酸(C14:0)为ω-羟基肉豆蔻酸。
采用50mM，pH 8.0的MES缓冲液体系，500L的反应体系组成为：1mM肉豆蔻酸、0.1mMNAD类似物(NCD、NTD或NUD)、4mM的再生底物亚磷酸和10U的再生酶(亚磷酸脱氢酶PDH-I151R)，0.1mg/mL NADH类似物依赖型细胞色素P450酶(P450 BM3-R967D/K973S、P450 BM3-R967D/K973S/Q977F、P450 BM3-R967D/K973S/Q977F/W1047S)，底物月桂酸用DMSO助溶，DMSO用量小于反应体系的5，37℃反应4h，500L反应液中加入100L的1M HCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22m有机滤膜过滤，取150L加入50L硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生化后经GC分析，结果如表4所示。以野生型P450 BM3以及不加再生酶或再生底物为对照，发现不加再生酶或不加再生底物时均没有产物ω-羟基肉豆蔻酸的生成。野生型P450 BM3为催化剂时只有微量产物ω-羟基肉豆蔻酸的生成。而基因工程改造酶P450 BM3-R967D/K973S/Q1005H、P450 BM3-R967D/Q977F/W1047S、P450 BM3-R967D/Q1005H/W1047S，利用不同的NADH类似物时，肉豆蔻酸的转化率均较高。
表4基因工程改造P450酶利用NADH类似物催化肉豆蔻酸的实验结果
Figure BDA0001879795720000092
实施例7：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶介导的微生物细胞催化脂肪酸(C12-C18)羟基化。
将NADH类似物依赖型细胞色素P450酶、再生NADH类似物的再生酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NADH类似物的生物催化体系。当培养基中的再生底物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。因此，应用NADH类似物依赖型细胞色素P450酶将不依赖胞内NADPH水平，可利用胞外再生底物还原力选择性传递到脂肪酸羟基化反应中去，实现P450酶的能量消耗与内源NADPH供给解耦联。
下面以大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌，构建催化脂肪酸羟基化的工程菌株为例予以说明。
NAD转运蛋白AtNDT2(Accession NO.NC_003070)具有较宽泛的底物谱(PalmieriF，et al.Molecular identification and functional characterization ofarabidopsis thaliana mitochondrial and chloroplastic NAD carrier proteins.JBiol Chem，2009，284，31249-31259)，可以转运NCD。将表达转运蛋白的AtNDT2的基因由gapAP1启动子(Charpentier B，et al.The Escherichia coli gapA gene istranscribed by polymerase holoenzyme E 70and by the RNA polymerase E32.JBacteriol，1994，176，830-839)控制表达。将编码P450 BM3-R967D/K973S/Q977F/W1047S的基因和编码D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R的基因，由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒获得工程质粒。
将上述工程质粒导入E.coli BL21(DE3)获得工程菌株E.coli LQ 01。在LB培养基中诱导工程菌株E.coli LQ 01表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100g/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。
用pH 7.5的MOPS培养基洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9。上述工程菌悬液中加入5mM脂肪酸(C12-C18)、5DMSO助溶、10mM D-乳酸钠、0.1mM的NCD，总体积1mL，在30℃，200rpm摇床中反应4h，取500L加入100L的1M HCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22m有机滤膜过滤，取150L加入50L硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生化后经GC分析，各种脂肪酸羟基化的转化率分别为：73.6(C12:0)；84.5(C14:0)；64.3(C16:0)；62.5(C18:0)。
在不添加NCD的对照实验中，脂肪酸转化率分别为：13.3(C12:0)；14.7(C14:0)；11.2(C16:0)；10.8(C18:0)。
实验结果表明在全细胞催化过程中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶P450BM3-R967D/K973S/Q977F/W1047S利用乳酸脱氢酶DLDH-V152R氧化D-乳酸钠生成的NCDH，催化脂肪酸羟基化。
实施例8：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶介导的微生物细胞催化脂肪酸(C12-C18)羟基化。
将NADH类似物依赖型细胞色素P450酶、再生NADH类似物的再生酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NADH类似物的生物催化体系。当培养基中的再生底物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。因此，应用NADH类似物依赖型细胞色素P450酶将不依赖胞内NADPH水平，可利用胞外再生底物还原力选择性传递到脂肪酸羟基化反应中去，实现P450酶的能量消耗与内源NADPH供给解耦联。
下面以改造大肠杆菌Escherichia coli XZ654(Zhang X，et al.L-malateproduction by metabolically engineered Escherichia coli.Appl EnvironMicrobiol，2011，77，427-434)，构建生产催化脂肪酸羟基化的工程菌株为例予以说明。
NAD转运蛋白NTT4(Haferkamp I，et al.A candidate NAD+transporter in anintracellular bacterial symbiont related to Chlamydiae.Nature，2004，432，622-625.)，可以转运NUD。将表达转运蛋白的NTT4的基因由gapAP1启动子(Charpentier B，etal.The Escherichia coli gapA gene is transcribed by polymerase holoenzyme E70and by the RNA polymerase E32.J Bacteriol，1994，176，830-839)控制表达。将编码P450 BM3-R967D/K973S/Q977F的基因和编码苹果酸酶ME-L310R/Q401C的基因，由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒获得工程质粒。
将上述工程质粒导入E.coli X 654获得工程菌株E.coli LQ 02。在LB培养基中诱导工程菌株E.coli LQ 02表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100g/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。
用pH 7.5的MOPS培养基洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9。上述工程菌悬液中加入5mM脂肪酸(C12-C18)、5DMSO助溶、10mM L-苹果酸、0.1mM的NUD，总体积1mL，在30℃，200rpm摇床中反应4h，取500L加入100L的1M HCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22m有机滤膜过滤，取150L加入50L硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生化后经GC分析，各种脂肪酸羟基化的转化率分别为：75.4％(C12:0)；86.8％(C14:0)；63.6％(C16:0)；61.1％(C18:0)。
在不添加NUD的对照实验中，脂肪酸转化率分别为：5.3(C12:0)；6.7(C14:0)；5.2(C16:0)；5.8(C18:0)。
实验结果表明在全细胞催化过程中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶P450BM3-R967D/K973S/Q977F利用苹果酸酶ME-L310R/Q401C再生的NUDH，催化脂肪酸羟基化。
实施例9：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶介导的透性化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)AS1.2829细胞催化肉豆蔻酸(C14:0)羟基化。
将NADH类似物依赖型细胞色素P450酶、再生NADH类似物的再生酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NADH类似物的生物催化体系。当培养基中的再生底物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码P450 BM3-R967D/K973S的基因和编码甲酸脱氢酶FDH-G171Y的基因，由组成型启动子P32控制，将上述两种表达盒通过替换pMG36e的P32表达盒(GUCHTE MV，etal.Construction of a lactococcal expression vector：expression of hen eggwhite lysozyme in Lactococcus lactis subsp.Lactis.Appl Environ Microbiol，1989，55，224-228.)获得工程质粒。
将上述工程质粒导入乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)AS1.2829获得工程菌株L.lactis LQ 03。在LB培养基中诱导工程菌株L.lactis LQ 03表达上述两种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。按文献方法使细胞透性化(Zhang W，etal.Bioreduction with efficient recycling of NADPH by coupled permeabilizedmicroorganisms.Appl Environ Microbiol，2009，75，687-694)，制备方式为：取5mL的冻存细胞在室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1的甲苯，30℃、200rpm摇床中温浴30min，然后再在4℃放置1h。2000×g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度为50mM、pH 7.5的Tris-Cl中，获得透性化细胞。
上述用50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入5mM肉豆蔻酸(C14:0)、5％DMSO助溶、10mM甲酸钠、0.1mM的NTD，总体积1mL，在30℃，200rpm摇床中反应4h，取500L加入100L的1M HCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22μm有机滤膜过滤，取150L加入50L硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生化后经GC分析，肉豆蔻酸(C14:0)羟基化的转化率为78.5％。
在不添加NTD的对照实验中，肉豆蔻酸(C14:0)转化率为10.3％。
实验结果表明在乳酸乳球菌全细胞催化过程中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶P450 BM3-R967D/K973S利用甲酸脱氢酶FDH-G171Y再生的NTDH，催化脂肪酸羟基化。
实施例10：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶介导的透性化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741催化软脂酸(C16:0)羟基化。
将NADH类似物依赖型细胞色素P450酶、再生NADH类似物的再生酶和NAD类似物转运蛋白同时在酿酒酵母细胞中表达，形成一种依赖NADH类似物的生物催化体系。当培养基中的再生底物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码P450 BM3-R967D/K973S/W1047S的基因和编码甲酸脱氢酶FDH-G171Y的基因，由TEF组成型启动子、CYC1终止子控制，将上述两种表达盒整合到p416酵母游离型穿梭表达载体获得工程质粒。
将上述工程质粒导入酿酒酵母获得工程菌株S.cerevisiae LQ 04。用pH 6.0的含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨的YEPD培养基诱导工程菌S.cerevisiaeLQ 04表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600nm调整到9。参照实施例9方法使细胞透性化，获得透性化细胞，制备方式为：取5mL的冻存细胞在室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1的甲苯，30℃、200rpm摇床中温浴30min，然后再在4℃放置1h。2000g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度为50mM、pH 7.5的Tris-Cl中，获得透性化细胞。
上述用50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入5mM软脂酸(C16:0)、5％DMSO助溶、10mM甲酸钠、0.1mM的NCD，总体积1mL，在30℃，200rpm摇床中反应4h，取500L加入100L的1M HCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22μm有机滤膜过滤，取150L加入50L硅烷化试剂N-甲基N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生化后经GC分析，软脂酸(C16:0)羟基化的转化率为64.3％。
在不添加NCD的对照实验中，软脂酸(C16:0)转化率为13.6。
实验结果表明在酿酒酵母全细胞催化过程中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶P450 BM3-R967D/K973S/W1047S利用甲酸脱氢酶FDH-G171Y再生的NCDH，催化脂肪酸羟基化。
实施例11：NADH类似物依赖型细胞色素P450酶介导的透性化里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞催化硬脂酸(C18:0)羟基化。
将NADH类似物依赖型细胞色素P450酶、再生NADH类似物的再生酶和NAD类似物转运蛋白同时在里氏木霉细胞中表达，形成一种依赖NADH类似物的生物催化体系。当培养基中的再生底物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码P450 BM3-R967D/K973S/Q1005H的基因和编码甲酸脱氢酶FDH-G171Y的基因，由启动子Pcbhl和终止子Tcbh1控制，将上述两种表达盒整合到pCAMBIA1300载体上获得工程质粒。
将上述工程质粒导入里氏木霉获得工程菌株T.reesei LQ 05。用pH 4.8的含有15g/L乳糖、10g/L酵母提取物、1g/L(NH4)2SO4、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的MgSO4、0.6g/L的CaCl2、0.05g/L的
Figure BDA0001879795720000142
0.0016g/L的
Figure BDA0001879795720000143
0.0014g/L的
Figure BDA0001879795720000144
0.0037g/L的
Figure BDA0001879795720000145
的培养基诱导工程菌T.reesei LQ 05表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度调整到3g菌体干重/L。参照实施例9方法使细胞透性化，获得透性化细胞。
上述用50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入5mM硬脂酸(C18:0)、5％DMSO助溶、10mM甲酸钠、0.1mM的NTD，总体积1mL，在30℃，200rpm摇床中反应4h，取500L加入100L的1M HCl和1mL的甲基叔丁基醚(MTBE)，200rpm震荡1h后，有机相用0.22μm有机滤膜过滤，取150L加入50L硅烷化试剂N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)衍生化后经GC分析，硬脂酸(C18:0)羟基化的转化率为50.6％。
在不添加NTD的对照实验中，硬脂酸(C18:0)转化率为5.4％
实验结果表明在里氏木霉全细胞催化过程中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶P450 BM3-R967D/K973S/Q1005H利用甲酸脱氢酶FDH-G171Y再生的NTDH，催化脂肪酸羟基化。
Figure BDA0001879795720000141
Figure BDA0001879795720000151
Figure BDA0001879795720000161
Figure BDA0001879795720000171

Claims (10)

1.一种生产ω-1-羟基脂肪酸的方法，其特征在于：以NADH类似物依赖型的细胞色素P450酶为生物催化剂，以NADH类似物为辅因子，催化底物脂肪酸中与ω-甲基连接CH2羟基化，生成ω-1-羟基脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征还在于：细胞色素P450酶为来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megatherium的自己自足型P450BM3(CYP102A1)，编码基因具有SEQ ID NO：1的基因序列，其编码的蛋白质具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
NADH类似物依赖型细胞色素P450酶为在SEQ ID NO：2的氨基酸序列基础上的多位点突变体，突变位点包括但不限于P450BM3-R967D/K973S、P450BM3-R967D/K973S/Q977F、P450BM3-R967D/K973S/Q1005H、P450BM3-R967D/Q977F/W1047S、P450BM3-R967D/Q1005H/W1047S、P450BM3-R967D/K973S/W1047S、P450BM3-R967D/K973S/Q977F/W1047S中的一种或两种以上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：NADH类似物为NCDH、NTDH和NUDH中的一种或两种以上，其化学结构如下：
Figure FDA0001879795710000011
Figure FDA0001879795710000021
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：NADH类似物NCDH、NTDH或NUDH是由酶法或化学法还原NCD、NTD或NUD而得，NCD、NTD和NUD的化学结构如下：
Figure FDA0001879795710000022
5.按照权利要求4所述的方法，其特征还在于：酶法还原NCD、NTD或NUD的再生酶为包括但不限于苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y中的一种或两种以上；
所述再生NADH类似物的氧化还原酶对应再生底物包括但不限于苹果酸化合物，亚磷酸化合物，D-乳酸化合物，甲酸化合物中的一种或两种以上；其中，苹果酸化合物为苹果酸、苹果酸盐中的一种或两种以上；D-乳酸化合物为D-乳酸、D-乳酸盐中的一种或两种以上；亚磷酸化合物为亚磷酸、亚磷酸盐中的一种或两种以上；甲酸化合物为甲酸、甲酸盐中的一种或两种以上；
所述酶法再生NADH类似物的反应体系为pH 7.5的缓冲液中，NAD类似物1mM-20mM，再生酶10U-500U，再生底物4mM-25mM，20℃-40℃下反应20min-2h。其中，缓冲体系包括但不限于MES、Tris-HCl、磷酸盐或HEPES缓冲液中的一种或两种；
化学法还原NCD、NTD和NUD中的一种或两种以上的反应体系为水溶液，还原剂为Na2S2O4、NaBH4、NaBH(Et)3、NaBH3CN中的一种或两种以上的任意比例组合，其中NAD类似物与还原剂的比例为1：2-4，20℃-40℃下反应20min-2h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：底物脂肪酸为C12-C18饱和脂肪酸中的一种或两种以上的任意组合。
7.根据权利要求1所述的生产ω-1-羟基脂肪酸的方法，其特征在于：在pH 5-9的缓冲体系中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶以NADH类似物为辅因子，催化C12-C18脂肪酸次末端C-H羟基化，生成ω-羟基脂肪酸；其中，缓冲体系包括但不限于MES、Tris-HCl、磷酸盐或HEPES缓冲液中的一种或两种以上。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在pH 5-9的缓冲体系中，NADH类似物依赖型细胞色素P450酶，偶联再生NADH类似物的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y及对应再生底物，催化C12-C18脂肪酸次末端C-H羟基化，生成ω-羟基脂肪酸；其中，缓冲体系包括但不限于MES、Tris-HCl、磷酸盐或HEPES 缓冲液中的一种或两种以上。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述NADH类似物依赖型的细胞色素P450酶、与来源于衣原体的NTT4或来源于拟南芥的AtNDT2蛋白以及再生NADH类似物的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R、亚磷酸脱氢酶PDH-I151R或甲酸脱氢酶FDH-G171Y的一种或两种以上在微生物细胞内共表达，以微生物细胞为催化剂催化脂肪酸生产ω-羟基脂肪酸；其中NAD类似物通过来源于衣原体的NTT4或来源于拟南芥的AtNDT2蛋白转运至胞内。
10.按照权利要求9所述的方法，其特征还在于：所述表达NADH类似物依赖型细胞色素P450酶并用于催化脂肪酸羟基化的微生物细胞包括但不局限于原核微生物中的大肠杆菌，乳酸乳球菌；真核微生物中的酿酒酵母，里氏木霉中的一种或两种以上。
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