CN109837321B - 一种nad类似物的还原方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NAD类似物的还原方法及其应用。该方法中还原剂为甲酸化合物，催化剂为可利用甲酸化合物的甲酸脱氢酶，甲酸脱氢酶氧化甲酸化合物的同时，将NAD类似物转化为其还原态。该方法可用于生产还原态NAD类似物或氘代的还原态类似物，也可为消耗还原态NAD类似物的酶促反应提供还原力，还原态的NAD类似物可作为辅酶应用于苹果酸酶ME‑L310R/Q401C、D‑乳酸脱氢酶DLDH‑V152R、酿酒酵母醇脱氢酶等酶催化的还原反应，有利于NAD类似物的广泛应用。该NAD类似物还原方法可在温和条件下，再生还原态NAD类似物用于苹果酸或乳酸的制备；也可作为一种氧化还原力调控微生物体内苹果酸或乳酸的代谢强度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种NAD类似物的还原方法，具体地说，是以甲酸化合物为还原剂，在酶催化下将NAD类似物转化为其还原态，并可被其他酶用做辅酶应用于还原反应。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及其还原态NADH是生命过程中的重要辅酶，参与生命体中的氧化还原代谢及其他一系列重要生物化学过程。这些辅酶可用于生产手性化学品及制备同位素标记物。由于很多氧化还原酶都利用NADH或NADPH作为辅酶，任何改变NAD浓度及其氧化还原状态的操作都会对细胞产生全局性影响，很难在辅酶水平对生物体系中特定的氧化还原酶进行控制。由于NADH可被代谢网络中多种途径消耗，影响了目标途径对还原力的利用效率。使用NAD类似物传递还原力时，由于类似物只能被突变型氧化还原酶识别，从而在辅酶水平对目标氧化还原过程进行调控，对生物催化和合成生物学研究具有重要意义(Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systems depending onnicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862；WangL,et al.Synthetic cofactor-linked metabolic circuits for selective energytransfer.ACS Catal,2017,7,1977-1983)。
目前已经报道了几种具有良好生物相容性的NAD类似物。如，烟酰胺胞嘧啶二核苷酸(NCD)、烟酰胺5-氟胞嘧啶二核苷酸(NFCD)、烟酰胺5-氯胞嘧啶二核苷酸(NClCD)、烟酰胺5-溴胞嘧啶二核苷酸(NBrCD)和烟酰胺5-甲基胞嘧啶二核苷酸(NMeCD)(Ji DB,etal.Creation of bioorthogonal redox systems depending on nicotinamideflucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862；Ji DB,etal.Synthesis of NAD analogs to develop bioorthogonal redox system.Sci ChinaChem,2013,56,296-300)。同时，也报道了一些可识别NAD类似物的酶，如来自粪肠球菌Enterococcus faecalis的NADH氧化酶(NOX，Genbank S45681)、D-乳酸脱氢酶(DLDH，Gnebank CAA47255)V152R突变体、苹果酸酶(ME，Genbank P26616)L310R/Q401C突变体、苹果酸脱氢酶(MDH，Genbank CAA68326)L6R突变体。
利用NAD类似物及识别它们的酶，可以构建更经济有效的生物催化体系(纪德彬等,利用人工氧化酶体系催化L-苹果酸氧化脱羧反应.催化学报,2012,33,530-535)。如，过表达ME-L310R/Q401C和NOX的大肠杆菌基因工程菌的细胞裂解液，在NFCD存在下，可以高效、选择性将苹果酸转化为丙酮酸；而在NAD存在下，丙酮酸被内源的乳酸脱氢酶进一步还原为乳酸。可见，通过选择合适的NAD类似物及识别它们的酶，可利用粗酶液进行反应达到纯酶催化的效果，实现在辅酶水平控制复杂生物催化转化体系。目前，已经实现利用NAD类似物进行胞内代谢反应的调控，通过向胞内转运NCD，DLDH-V152R可利用NCD将丙酮酸还原为乳酸，实现了特异性的生物催化调控(Wang L,et al.Synthetic cofactor-linkedmetabolic circuits for selective energy transfer.ACS Catal,2017,7,1977-1983)。
和使用其他氧化还原辅酶一样，NAD类似物也必需再生循环。辅酶再生方式主要有酶法、电化学法、化学法和光化学法。其中酶法具有选择性高、可以与合成酶兼容及高转换数等优点。目前再生还原态辅酶NADH常采用葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶或亚磷酸脱氢酶。其中甲酸脱氢酶可利用甲酸化合物，催化氧化甲酸化合物生成二氧化碳，同时还原NAD为NADH。该反应在正常条件下不可逆，反应产率高达99％-100％。而且，由于甲酸化合物比较廉价，且生成的二氧化碳易于从反应体系分离而利于产物纯化，利用甲酸脱氢酶来再生NADH具有明显的优势(Tishkov VI,et al.Protein engineering of formatedehydrogenase.Biomol Eng,2006,23,89–110)。虽然NAD类似物再生循环对生物催化和合成生物学等领域具有重要意义，但是目前通过改造酶的结构来高效还原NAD类似物的文献很少，尚没有文献报道如何改造甲酸脱氢酶来高效还原NAD类似物。已报道的NAD类似物还原方法(王磊等,一种NAD类似物的还原方法.CN 104946706 A)利用亚磷酸脱氢酶，以亚磷酸为底物，将NAD类似物还原成NADH，同时生成副产物磷酸。与亚磷酸脱氢酶催化亚磷酸化合物生成产物磷酸化合物相比，甲酸脱氢酶催化甲酸化合物的反应中，生成的二氧化碳易于从反应体系中分离而使反应进行更加完全。此外，由于产物二氧化碳的惰性，不会对酶反应产生抑制或促进作用，也不会干扰甲酸脱氢酶的催化活性及其偶联的其他催化反应，同时也不影响偶联反应中其他物质的分离纯化，因此具有明显的优势(Jiang W,etal.Identification of catalysis,substrate,and coenzyme binding sites andimprovement catalytic efficiency of formate dehydrogenase from Candidaboidinii.Appl Microbiol Biotechnol,2016,100,8425-8437)。
发明内容
本发明涉及一种辅酶NAD类似物的酶催化还原方法，具体来说，是以甲酸化合物为还原剂，以可利用甲酸化合物的酶为催化剂，将NAD类似物转化为相应的还原态。这些NAD类似物还原态可作为其他氧化还原酶的辅酶，用于还原反应。因此，本发明的方法可应用在生物催化和生物转化领域，具有重要价值。
本发明涉及一种NAD类似物的还原方法，其特征在于：以甲酸化合物为还原剂，可利用甲酸化合物的酶为催化剂，在pH 5-8的缓冲体系中，10–40℃下，反应2-120min，获得还原型NAD类似物。
所述可利用甲酸化合物的酶为具有以甲酸化合物为还原剂，催化还原NAD类似物为相应还原态的活性蛋白质。
NAD类似物包括NCD、NFCD、NClCD、NBrCD、NMeCD、烟酰胺鸟嘌呤二核苷酸(NGD)、烟酰胺胸腺嘧啶二核苷酸(NTD)和烟酰胺尿嘧啶二核苷酸(NUD)，他们具有如下的化学结构：
本发明涉及的NAD类似物参照文献方法(Ji DB,et al.Synthesis of NADanalogs to develop bioorthogonal redox system.Sci China Chem,2013,56,296-300)制备。
本发明使用的甲酸脱氢酶为具有以甲酸化合物为还原剂，催化还原NAD类似物为相应还原态的活性蛋白质。这些酶可以是野生的，如来源于Candida boidinii甲酸脱氢酶cboFDH(EMBL AJ011046.2)，来源于Pseudomonas sp.101的甲酸脱氢酶pseFDH(NCBIP33160.3)，来源于Saccharomyces cerevisiae的甲酸脱氢酶sceFDH(Gene ID 854570)。也可以是经过突变的甲酸脱氢酶，如cboFDH的突变体cboFDH-G171Y、cboFDH-I170T/A229S以及pseFDH的突变体pseFDH-H223S/L257R中的一种或者两种以上。这些酶的表达和纯化参照在大肠杆菌中表达其他氧化还原酶的文献方法进行(Ji DB,et al.Creation ofbioorthogonal redox systems depending on nicotinamide flucytosinedinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862)。
本发明涉及的NAD类似物和NAD一样含有烟酰胺单核苷酸单元，该单元的还原态为1,4-二氢烟酰胺单核苷酸。因此，NAD类似物还原态产物在340nm附近的紫外光谱区有较强吸收，摩尔消光系数ε340约为6220M-1·cm-1(Ji DB,et al.Creation of bioorthogonalredox systems depending on nicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am ChemSoc.2011,133,20857-20862)。本发明利用该性质分析NAD类似物还原过程。利用液相色谱定量NAD类似物及其还原态产物的条件为：液相色谱仪为Agilent 1100，分析柱为Zorbax150mm×3.0mm(3.5μm)，流动相为5mM硫酸四丁胺，流速为0.5mL/min。每个样品检测20min。检测波长为260nm(辅因子及其还原态在260nm有较强的光吸收)和340nm(还原态辅酶在340nm有较强的光吸收)。
甲酸化合物为甲酸、甲酸盐、氘代甲酸、氘代甲酸盐中的一种或者两种以上的组合。
制备的NAD类似物还原态产物，可被其他酶用作辅酶，应用于还原反应。所述其他酶包括但不局限于：催化丙酮酸还原为苹果酸的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、催化丙酮酸还原为乳酸的乳酸脱氢酶DLDH-V152R；催化乙醛还原为乙醇的酿酒酵母醇脱氢酶，催化二乙酰还原为羟基丁酮的羟基丁酮脱氢酶，催化D-木糖还原为木糖醇的D-木糖脱氢酶。因此，本发明可视为一种再生循环NAD类似物还原态的技术。通过本发明的技术，将甲酸化合物的还原力转移并贮存在NAD类似物还原态中，以便于对其他底物进行选择性还原。
所用缓冲体系中甲酸脱氢酶的终浓度为4μg/mL-500μg/mL、NAD类似物的终浓度为0.01mM-20mM、甲酸化合物的终浓度为0.4mM-25mM，所述的缓冲体系包括但不限于磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，HEPES缓冲液，MES缓冲液，PIPES缓冲液中的一种或两种以上。
利用所述甲酸脱氢酶还原NAD类似物，为包括但不局限于ME-L310R/Q401C，DLDH-V152R或酿酒酵母醇脱氢酶提供还原型辅酶时，采用pH 5-8的缓冲体系，反应温度10-40℃。
所述可利用甲酸化合物的酶表达在微生物的细胞内，而NAD类似物及甲酸化合物进入细胞，NAD类似物还原反应在细胞内进行。
所述表达甲酸脱氢酶并用于胞内还原NAD类似物的微生物细胞包括但不局限于原核微生物，如大肠杆菌，乳酸乳球菌等或真核微生物，如酿酒酵母或里氏木霉等。
本发明的优点和有益效果：作为还原剂的甲酸化合物价格低廉，其氧化产物二氧化碳易于从反应体系中分离；酶催化还原条件温和，反应效率高，反应在正常条件下不可逆；产物选择性高，应用于胞内体系时可将甲酸化合物的还原力选择性传递到目标代谢反应。此外，通过使用氘代甲酸或氘代甲酸盐，可获得氘代NAD类似物还原态，用于制备高纯度氘取代生物催化产物。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
对比例1：无酶条件下甲酸与NAD类似物的反应
NAD类似物(NCD、NFCD、NBrCD、NClCD、NMeCD、NGD、NTD和NUD)参照文献方法(Ji DB,et al.Synthesis of NAD analogs to develop bioorthogonal redox system.SciChina Chem,2013,56,296-300)制备。NAD类似物用水制成浓度为20mM的溶液，备用。
将1mM的NAD类似物底物和4mM的甲酸溶解在1mL浓度为50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中，混匀，30℃反应2h，取20μL分析。
用HPLC检测NAD类似物底物及其还原态产物。液相色谱仪为Agilent1100，分析柱为Zorbax 150mm×3.0mm(3.5μm)，流动相为5mM硫酸四丁胺，流速为0.5mL/min。每个样品检测20min。检测波长为260nm(辅因子及其还原态在260nm有较强吸收)和340nm(还原态辅酶在340nm有较强的光吸收)。
分析发现，所有反应的样品在340nm没有特征峰，在260nm仅检测到与NAD类似物保留时间相同的特征峰。说明在无酶条件下甲酸不能直接还原NAD类似物。
对比例2：酶失活条件下甲酸与NAD类似物的反应
将来源于Candida boidinii甲酸脱氢酶cboFDH(EMBL AJ011046.2)在80℃水浴加热20min，备用。按文献方法(Alekseeva1 AA,et al.The role of Ala198in thestability and coenzyme specificity of bacterial formate dehydrogenases.ACTANATURAE,2015,7,60-69)，以NAD为底物，检测表明样品失去了催化还原NAD为NADH的活性。
将NAD类似物NCD、NFCD、NBrCD、NClCD、NMeCD、NGD、NTD和NUD，逐一按照下述方法进行反应：将1mM的NAD类似物、4mM甲酸和40μg灭活的甲酸脱氢酶cboFDH溶解在1mL浓度50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液中混匀，30℃反应2h，取20μL分析。
按对比例1的方法分析发现，所有反应的样品在340nm没有特征峰，在260nm仅检测到与NAD类似物保留时间相同的特征峰。说明加热灭活的酶不能催化甲酸还原NAD类似物。
实施例1：以甲酸为还原剂，甲酸脱氢酶催化还原NAD类似物
将NAD类似物NCD、NFCD、NBrCD、NClCD、NMeCD、NGD、NTD和NUD，与甲酸脱氢酶cboFDH、cboFDH-G171Y、cboFDH-I170T/A229S、pseFDH及pseFDH-H223S/L257R，逐一进行NAD类似物-甲酸脱氢酶组合，按下述方法进行反应：将1mM的NAD类似物、4mM的甲酸和40μg的甲酸脱氢酶溶解在1mL浓度50mM，pH 7.5的HEPES缓冲液中混匀，30℃反应20min，取20μL分析。
按对比例1的分析方法分析发现，所用样品在340nm均出现了特征吸收峰，但不同组合得到的吸收峰强度有明显差别，说明甲酸脱氢酶可以催化甲酸还原NAD类似物。由于NAD类似物还原态产物的摩尔消光系数ε340约为6220M-1·cm-1，与NADH相同，用NADH标准品绘制曲线，得到定量结果(表1)。可见，cboFDH的催化活性整体较低，其他几种甲酸脱氢酶具有较好的活性。可依据不同的NAD类似物，选择合适的甲酸脱氢酶。
实施例1的结果表明，甲酸脱氢酶可以有效催化甲酸还原本发明涉及的NAD类似物，制备相应的还原态产物。综合实施例1、对比例1和对比例2的结果说明，以甲酸为还原剂，还原NAD类似物，活性甲酸脱氢酶起到了不可替代的作用。
表1甲酸脱氢酶催化甲酸还原NAD类似物的实验结果
实施例2：还原态NAD类似物的制备
将实施例1的反应体系放大，可用于制备还原态NAD类似物。以NUDH为例，说明制备过程。将20mM的NUD、25mM的甲酸钠和5mg的甲酸脱氢酶cboFDH-G171Y溶解在10mL浓度为50mM，pH为5.7的磷酸钠缓冲液中混匀，30℃反应80min。反应结束后直接冷冻干燥，浓缩至总体积约为4mL，用甲酸型阴离子交换树脂柱分离，在紫外波长340nm跟踪收集产物，冷冻干燥，得白色粉末11.6mg，产率约90％。
将上述白色粉末样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M+H)+为643.1026，与NUDH的理论分子量(C20H29N4O16P2 +，643.1054)一致，表明得到了还原态产物NUDH。
按照实施例2的方法用相同用量的NUD、亚磷酸钠和亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R生产NAD类似物，得到了还原态的NUDH，产率约89％。说明甲酸脱氢酶cboFDH-G171Y与亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R均能催化相应的底物生产NAD类似物，且产率接近。
实施例3：以甲酸钠为还原剂，甲酸脱氢酶催化还原NAD类似物
将0.1mM的NBrCD、0.4mM的甲酸钠和4μg甲酸脱氢酶cboFDH-G171Y溶解在1mL浓度为50mM，pH 8.0的PIPES缓冲液中混匀，40℃反应3min，取20μL分析。
按对比例1的方法分析发现，样品在340nm出现了特征吸收峰。生成的NBrCDH浓度达到78μM，即产率达到78％。
综合实施例1和实施例3的结果表明，甲酸脱氢酶催化还原NAD类似物的反应中，采用甲酸钠或者甲酸为还原剂，均可使NAD类似物还原。
按照实施例3的方法用相同用量的NBrCD、亚磷酸钠和亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R生产NAD类似物，生成的NBrCDH浓度达到73μM，即产率达到73％。说明甲酸脱氢酶cboFDH-G171Y与亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R均能催化相应的底物生产NAD类似物，甲酸脱氢酶cboFDH-G171Y催化的反应产率高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R。
实施例4：以氘代甲酸为还原剂，甲酸脱氢酶催化还原NAD类似物
根据文献方法(Woodyer R,etal.Mechanistic investigation of a highlyactive phosphite dehydrogenase mutant and its application for NADPHregeration.FEBS J,2005,272,3816-3827)，将甲酸溶解在D2O中，冷冻干燥，重复4次获得氘代甲酸，备用。
将1mM的NCD、4mM氘代甲酸和40μg甲酸脱氢酶cboFDH-I170T/A229S溶解在1mL浓度50mM，pH 5.0的MES缓冲液中混匀，10℃反应120min，取20μL分析。
按对比例1的分析方法分析发现，样品在340nm出现了特征吸收峰。产物NCDH浓度达到0.91mM，即产率为91％。
将样品进行高分辨质谱分析，测得精确分子量(M-H)-为641.1118，与NCD2H的理论分子量(C20H27 2HN5O15P2 -，641.1125)一致，表明得到了氘代NCD还原态产物。
实施例4的结果表明，甲酸脱氢酶可用氘代甲酸为还原剂，催化还原NAD类似物生成相应的氘代还原态产物。
按照实施例4的方法用相同用量的NCD、亚磷酸钠和亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C生产氘代NAD类似物，产物NCDH浓度达到0.88mM，即产率为88％。说明甲酸脱氢酶cboFDH-I170T/A229S与rsPDH-I151R/E213C均能催化相应的底物生产NAD类似物，甲酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C催化的反应产率高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C。
实施例5：甲酸脱氢酶、苹果酸酶ME-L310R/Q410Q和NAD类似物体系催化丙酮酸还原羧化制备苹果酸
参照文献(Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systemsdepending on nicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862)方法纯化苹果酸酶ME-L310R/Q410Q，备用。ME-L310R/Q410Q偏好类似物NCDH而对NADH活性低，需要以NCDH为辅因子。
苹果酸酶ME-L310R/Q410Q可催化的反应为：丙酮酸+CO2+NCDH→苹果酸+NCD。甲酸脱氢酶催化的反应为：甲酸+NCD→CO2+NCDH。将两反应合并，净反应为：甲酸+丙酮酸→苹果酸。因此甲酸脱氢酶和苹果酸酶构成的体系可以实现以甲酸为还原剂，还原羧化丙酮酸生成苹果酸。该体系中，NAD类似物被再生循环，而且反应没有任何副产物，具有一定的潜力。其中具有代表性的实验过程如下：
采用50mM，pH 5.0的Tris-HCl缓冲体系，100μL的反应体系组成为：4.0mM甲酸、50mM丙酮酸、0.01mM NCD、1.0mM MnCl2、10mM碳酸氢钠、0.05mg/mL cboFDH-I170T/A229S和0.06mg/mL ME-L310R/Q410C。10℃反应120min，加900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。
利用美国戴安公司ICS-2500离子色谱系统在ED50脉冲电化学检测模式下分析测定反应溶液中苹果酸，丙酮酸和甲酸的含量。使用IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱(200mm×4mm)，IonPac AG11-HC阴离子交换保护住(50mm×4mm)。分析条件：流动相为24mMNaOH，流速1mL/min，柱温：30℃，进样量25μL。检测结果表明，反应液含0.1mM甲酸、46.1mM丙酮酸和3.6mM苹果酸。
在进行上述反应时，设置了另外4组对照实验体系，分别缺少甲酸、NCD、cboFDH-I170T/A229S或ME-L310R/Q410C中的一种，分析发现这些反应没有产生苹果酸。根据反应的化学计量关系可知，NCD再生循环利用360次。
在进行上述反应时，还设置了1组实验，用氘代甲酸代替甲酸，其他成分和条件相同，分析发现反应液丙酮酸浓度降低为46.3mM同时产生3.5mM苹果酸，说明该体系可用氘代甲酸为还原剂，达到甲酸为还原剂相当的效率。
按照实施例5的方法，用亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C、苹果酸酶ME-L310R/Q410C和NAD类似物体系催化丙酮酸还原羧化制备苹果酸。用相同的反应体系和分析方法，检测结果表明，反应液含有0.2mM甲酸、47.1mM丙酮酸和2.6mM苹果酸。说明甲酸脱氢酶、苹果酸酶ME-L310R/Q410Q和NAD类似物体系催化丙酮酸还原羧化制备苹果酸要高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C、苹果酸酶ME-L310R/Q410Q和NAD类似物体系的催化活性。
实施例6：甲酸脱氢酶、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸
参照文献(Ji DB,et al.Creation of bioorthogonal redox systemsdepending on nicotinamide flucytosine dinucleotide.J Am Chem Soc,2011,133,20857-20862)方法纯化D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R，备用。D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R偏好NAD类似物，需要以还原型类似物为辅因子。
乳酸脱氢酶催化的反应为：丙酮酸+NFCDH→D-乳酸+NFCD。甲酸脱氢酶催化的反应为：甲酸+NFCD→CO2+NFCDH。将两反应合并，总反应为：甲酸+丙酮酸→D-乳酸+CO2。因此，甲酸脱氢酶和D-乳酸脱氢酶构成的体系可实现以甲酸为还原剂，还原丙酮酸生成D-乳酸。该体系中，NAD类似物被循环再生，具有一定的应用潜力。其中具有代表性的实验过程如下：
采用50mM，pH 8.0的MES缓冲液体系，100μL的反应体系组成为：4.0mM甲酸、4.0mM丙酮酸、0.1mM NFCD、0.05mg/mL cboFDH-G171Y和0.06mg/mL DLDH-V152R。40℃反应10min，加900μL乙腈甲醇混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含有0.5mM甲酸、3.3mM D-乳酸、0.6mM丙酮酸。
实验结果表明，该体系利用甲酸为还原剂，近定量地将丙酮酸还原为乳酸，取得了很高的原料利用效率。根据反应的化学计量关系可知，NFCD再生循环利用33次。
按照实施例6的方法，用亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸。用相同的反应体系和分析方法，检测结果表明，反应液含有0.6mM甲酸、3.0mM D-乳酸、0.8mM丙酮酸。说明甲酸脱氢酶、D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R和NAD类似物体系催化丙酮酸还原制备乳酸要高于亚磷酸脱氢酶D-乳酸脱氢酶DLDH-V152R和NAD类似物类似物体系的催化活性。
实施例7：醇脱氢酶利用还原态NAD类似物催化醛还原反应
参照实施例2的方法制备还原态类似物NTDH，备用。
采用20mM，pH 7.5的磷酸钠缓冲液体系，500μL反应体系组成为：3.0mM乙醛、2.0mMNTDH、0.1mg/mL来源于酿酒酵母的醇脱氢酶(购自Sigma公司，货号：A3263)。30℃反应，用分光光度计在紫外坡长340nm处跟踪反应。反应30min后，体系中NTDH降低为0.8mM。同时，体系中产生了1.1mM乙醇。
在没有添加酿酒酵母醇脱氢酶的对照实验体系中，反应30min后NTDH浓度未见明显变化。实施例7的结果说明还原态NAD类似物可被氧化还原酶用作辅酶，催化还原反应。
实施例8：甲酸脱氢酶介导的胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲酸脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲酸化合物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。因此，应用甲酸脱氢酶介导的胞内还原NAD类似物的技术，可将胞外还原力选择性传递到胞内目标氧化还原反应。下面以改造大肠杆菌Escherichia coli XZ654(Zhang X,et al.L-malate production bymetabolically engineered Escherichia coli.Appl Environ Microbiol,2011,77,427-434)，构建生产苹果酸的工程菌株为例予以说明。
NAD转运蛋白AtNDT2(Accession NO.NC_003070)具有较宽泛的底物谱(PalmieriF,et al.Molecular identification and functional characterization ofarabidopsis thaliana mitochondrial and chloroplastic NAD carrier proteins.JBiol Chem,2009,284,31249-31259)，可以转运NCD。将表达转运蛋白的AtNDT2的基因由gapAP1启动子(Charpentier B,et al.The Escherichia coli gapA gene istranscribed by polymerase holoenzyme Eσ70and by the RNA polymerase Eσ32.JBacteriol,1994,176,830-839)控制表达。将编码cboFDH-I170T/A229S的基因和编码ME-L310R/Q410C的基因，由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒获得工程质粒。
将上述工程质粒导入E.coli XZ654获得工程菌株E.coli WL005。在LB培养基中诱导工程菌株E.coli WL005表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600 nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。
用pH 7.5的MOPS培养基洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600 nm调整到9。上述工程菌悬液中加入10mM碳酸氢钠、10mM丙酮酸、5mM甲酸、0.1mM的NCD，分别在16℃、30℃、42℃的200rpm摇床中厌氧反应4h，取100μL加900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明16℃反应液含1.8mM甲酸、2.8mM苹果酸、7.1mM丙酮酸。30℃反应液含0.2mM甲酸、4.3mM苹果酸、5.4mM丙酮酸。42℃反应液含0.5mM甲酸、3.8mM苹果酸、5.6mM丙酮酸。
在只添加甲酸和NCD中的一种及不添加甲酸和NCD的对照实验中，苹果酸浓度分别为2.2mM、1.9mM和1.9mM。
实验结果表明在全细胞催化过程中，甲酸脱氢酶cboFDH-I170T/A229S通过氧化甲酸为ME-L310R/Q401C提供NCDH，催化丙酮酸还原羧化成苹果酸，使苹果酸产量由1.9mM提高到4.3mM。只添加甲酸时苹果酸产量没有明显增加，只添加NCD时苹果酸不增加。
实施例8说明，在全细胞催化过程中胞内没有甲酸脱氢酶可以通过氧化甲酸提供还原态NAD类似物，而被ME-L310R/Q401C用作辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内苹果酸的代谢强度的方式。
按照实施例8的方法，将表达rsPDH-I151R/E213C的基因和ME-L310R/Q410C的基因由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，构建相应的工程菌株，用同样的实验和分析方法检测各成分的含量。结果表明16℃反应液含1.8mM甲酸、2.8mM苹果酸、7.1mM丙酮酸。30℃反应液含0.1mM甲酸、4.2mM苹果酸、5.6mM丙酮酸。42℃反应液含0.5mM甲酸、3.8mM苹果酸、5.6mM丙酮酸。说明甲酸脱氢酶cboFDH-I170T/A229S参与的上述催化体系与亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/E213C参与的类似的催化体系比，前者催化效率在30℃时稍高，在16℃和42℃时二者效率相当。
实施例9：甲酸脱氢酶介导的胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲酸脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶和NAD类似物转运蛋白同时在宿主中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。下面以改造大肠杆菌Escherichia coli XZ654(Zhang X,et al.L-malate production by metabolicallyengineered Escherichia coli.Appl Environ Microbiol,2011,77,427-434)，构建生产乳酸的工程菌株为例予以说明。
NAD转运蛋白NTT4(Haferkamp I，et al.A candidate NAD+transporter in anintracellular bacterial symbiont related to Chlamydiae.Nature,2004,432,622-625.)可以转运NGD。将上述三种表达转运蛋白NTT4的基因由gap P1启动子控制表达。将编码pseFDH-H223S/L257R的基因和编码DLDH-V152R的基因，由异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述三种表达盒通过替换pUC18的LacZ基因克隆到同一质粒上获得工程质粒。
将上述工程质粒导入E.coli XZ654获得工程菌株E.coli WL006。在LB培养基中诱导工程菌E.coli WL006表达上述三种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃的200rpm摇床中培养48h至菌体密度OD600 nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体。
用pH 8.0的M9培养基洗涤重悬菌体，将密度OD600 nm调整到9。上述工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM甲酸、0.1mM NGD，分别在30℃的200rpm摇床中厌氧反应3h，取100μL加900μL乙腈甲醇混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统进行分析，结果表明30℃反应液含0.1mM甲酸、4.9mM乳酸、4.7mM丙酮酸。
在只添加甲酸和NGD中的一种及不添加甲酸和NGD的对照实验中，乳酸浓度分别为0.9mM、0.9mM和0.6mM。
实验结果表明在全细胞催化过程中甲酸脱氢酶pseFDH-H223S/L257R通过氧化甲酸为DLDH-V152R提供NGDH，催化丙酮酸还原成乳酸，使乳酸产量由0.6mM提高到4.9mM。只添加甲酸或NGD时乳酸产量没有明显增加。
实施例9说明，在全细胞催化过程中胞内甲酸脱氢酶可以通过氧化甲酸提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。
按照实施例9的方法，将表达rsPDH-I151R/I218F的基因和ME-L310R/Q410C的基因由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，构建相应的工程菌株，用同样的实验和分析方法检测各成分的含量。结果表明30℃反应液含0.1mM甲酸、4.8mM乳酸、4.6mM丙酮酸。说明甲酸脱氢酶pseFDH-H223S/L257R参与的上述催化体系与亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R/I218F参与的类似的催化体系效率接近。
实施例10：甲酸脱氢酶介导的透性化细胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲酸脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在宿主细胞中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲酸化合物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码cboFDH-I170T/A229S的基因和编码DLDH-V152R的基因，由异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子控制，将上述两种表达盒通过替换pUC18的lacZ基因克隆到同一质粒上获得工程质粒。
将上述工程质粒导入E.coli XZ654获得工程菌株E.coli WL007。在LB培养基中诱导工程菌E.coli WL007表达上述两种功能蛋白，培养基中添加100μg/mL氨苄青霉素、1mM的IPTG，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600 nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM，pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600 nm调整到9，按文献方法使细胞透性化(Zhang W,et al.Bioreduction with efficient recycling of NADPH bycoupled permeabilized microorganisms.Appl Environ Microbiol,2009,75,687-694)，制备方式为，取5mL的冻存细胞室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1％的甲苯，30℃、200rpm摇床温浴30min，然后再在4℃放置1h。2000g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度50mM、pH 5.0的Tris-Cl，获得透性化细胞。
上述用浓度50mM、pH 5.0的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM甲酸、0.1mM的NCD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应0.5h。取100μL样品，加入900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。
参照实施例5的方法用离子色谱系统分析，结果表明反应液含2.1mM甲酸、2.6mM乳酸和7.1mM丙酮酸。
在只添加甲酸和NCD的一种及不添加甲酸和NCD的对照实验中，乳酸浓度分别为0.6mM、0.4mM和0.3mM。
实验结果表明在全细胞催化过程中甲酸脱氢酶cboFDH-I170T/A229S通过氧化甲酸为DLDH-V152R提供NCDH，催化丙酮酸还原生成乳酸，使乳酸产量由0.3mM提高到2.6mM。只添加甲酸或NCD时苹果酸产量没有明显增加。
实施例10说明，在全细胞催化过程中胞内甲酸脱氢酶可以通过氧化甲酸提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。
按照实施例10的方法，将表达rsPDH-I151R的基因和ME-L310R/Q410C的基因由异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导的lac启动子控制，构建相应的工程菌株，用同样的实验和分析方法检测各成分的含量。结果表明30℃反应液含2.0mM甲酸、2.7mM乳酸和7.0mM丙酮酸。说明甲酸脱氢酶cboFDH-I170T/A229S参与的上述催化体系效率高于亚磷酸脱氢酶rsPDH-I151R参与的类似的催化体系。
实施例11：甲酸脱氢酶介导的透性化乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)AS1.2829细胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲酸脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在乳酸乳球菌中表达，形成一种依赖于NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲酸化合物和NAD类似物计入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码cboFDH-I170T/A229S的基因和编码DLDH-V152R的基因，由组成型表达启动子P32控制，将上述两种表达盒通过替换pMG36e的P32表达盒(GUCHTE MV,etal.Construction of a lactococcal expression vector:expression of hen eggwhite lysozyme in Lactococcus lactis subsp.Lactis.Appl Environ Microbiol,1989,55,224-228.)获得工程质粒。
将上述工程质粒导入乳酸乳球菌获得工程菌株L.lactis WL001。用pH 6.8的含有10g/L蔗糖、10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L的KH2PO4、2g/L的MgSO4和5mg/L红霉素的培养基诱导工程菌L.lactis WL001表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600 nm调整至9。参照实施例10的方法使细胞透性化，制备方式为：取5mL的冻存细胞在室温下水浴解冻，加入5mM的EDTA和体积比1％的甲苯，30℃、200rpm摇床中温浴30min，然后再在4℃放置1h。2000g离心6min去除含有EDTA和甲苯的上清，用浓度50mM、pH7.5的Tris-Cl洗两遍后重悬于5mL的浓度为50mM、pH 7.5的Tris-Cl中，获得透性化细胞。
上述用50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM甲酸。0.1mM的NCD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应1h。取100μL反应液，加入900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液中含有1.9mM甲酸、2.7mM乳酸和7.1mM丙酮酸。
在只添加甲酸和NCD的一种及不添加甲酸和NCD的对照实验中，乳酸浓度分别为0.4mM、0.4mM和0.2mM。
实施例11说明，在乳酸乳球菌全细胞催化过程中胞内甲酸脱氢酶可以通过氧化甲酸提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量与不添加甲酸和NCD的对照实验相比提高了13.5倍，因此可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸代谢强度的方式。
实施例12：甲酸脱氢酶介导的透性化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741细胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲酸脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在酿酒酵母细胞中表达，形成一种依赖于NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲酸化合物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码cboFDH-I170T/A229S的基因和编码DLDH-V152R的基因，由TEF组成型启动子、CYC1终止子控制，将上述两种表达盒整合到p416酵母游离型穿梭表达载体获得工程质粒。
将上述工程质粒导入酿酒酵母获得工程菌株S.cerevisiae WL002。用pH6.0的含有20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨的YEPD培养基诱导工程菌S.cerevisiaeWL002表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h至菌体密度OD600 nm为4.5，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度OD600 nm调整到9。参照实施例11的方法使细胞透性化，获得透性化细胞。
上述用50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM甲酸、0.1Mm NCD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应1h。取100μL加入900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含有0.6mM甲酸、3.7mM乳酸和6.1mM丙酮酸。
在只添加甲酸和NCD中的一种及不添加甲酸和NCD的对照实验中，乳酸的浓度分别为0.4mM、0.6mM和0.4mM。
实施例12说明，在酿酒酵母全细胞催化过程中胞内甲酸脱氢酶可以通过氧化甲酸提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用做辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量与不添加甲酸和NCD的对照实验相比提高了9.3倍，因此可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸的代谢强度的方式。
实施例13：甲酸脱氢酶介导的里氏木霉(Trichoderma reesei)胞内还原NAD类似物及其应用
可以将所识别NAD类似物的甲酸脱氢酶、偏好NAD类似物的氧化还原酶同时在里氏木霉细胞中表达，形成一种依赖NAD类似物的生物催化体系。当培养基中的甲酸化合物和NAD类似物进入宿主细胞后，启动该生物催化体系。
将编码cboFDH-I170T/A229S的基因和编码DLDH-V152R的基因，由启动子Pcbh1和终止子Tcbh1控制，将上述两种表达盒整合到pCAMBIA1300载体上获得工程质粒。
将上述工程质粒导入里氏木霉获得工程菌株T.reesei WL003，用pH 4.8的含有15g/L乳糖、10g/L酵母提取物、1g/L(NH4)2SO4、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的MgSO4、0.6g/L的CaCl2、0.05g/L的FeSO4·7H2O、0.0016g/L的MnSO4·H2O、0.0014g/L的ZnSO4·7H2O、0.0037g/L的CoCl2·6H2O的培养基诱导工程菌T.reesei WL003表达上述两种功能蛋白，在25℃、200rpm的摇床中培养48h，2000×g离心6min收集菌体，用浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl洗涤重悬菌体，将菌体密度调整到3g菌体干重/L。参照实施例11方法使细胞透性化，获得透性化细胞。
上述浓度50mM、pH 7.5的Tris-Cl重悬的透性化工程菌悬液中加入10mM丙酮酸、5mM甲酸、0.1mM的NCD，在30℃、200rpm的摇床中厌氧反应2h。取100μL样品，加入900μL乙腈甲醇水混合液(乙腈：甲醇：水＝4:4:1)终止反应。
参照实施例5的方法利用离子色谱系统分析，结果表明反应液含1.5mM甲酸、3.3mM乳酸、6.4mM丙酮酸。
在只添加甲酸和NCD中的一种及不添加甲酸和NCD的对照实验中，乳酸浓度分别为1.2mM、0.9mM和0.6mM。
实施例13说明，在里氏木霉全细胞催化过程中胞内甲酸脱氢酶可以通过氧化甲酸提供还原态的NAD类似物，被DLDH-V152R用作辅酶应用于还原反应，乳酸的积累量与不添加甲酸和NCD的对照实验相比提高了5.5倍，因此可作为一种通过提供氧化还原力调控微生物体内乳酸代谢强度的方式。
Claims (6)
1.一种NAD类似物的还原方法，其特征在于：以甲酸化合物为还原剂，可利用甲酸化合物的酶为催化剂，在pH5–8的缓冲体系中，10–40℃下，反应2–120min，获得还原型NAD类似物；
所述可利用甲酸化合物的酶为天然的或经过基因工程突变的酶；可利用甲酸化合物的酶为来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶cboFDH的突变体、来源于Pseudomonas sp.101的甲酸脱氢酶pseFDH、来源于Pseudomonas sp.101的甲酸脱氢酶pseFDH的突变体中的一种或两种以上，其中，甲酸脱氢酶cboFDH为EMBL AJ011046.2，甲酸脱氢酶pseFDH为NCBIP33160.3；
所述甲酸脱氢酶cboFDH的突变体为cboFDH-G171Y、cboFDH-I170T/A229S；所述甲酸脱氢酶pseFDH的突变体为pseFDH-H223S/L257R；
所述的NAD类似物为NCD、NFCD、NClCD、NBrCD、NMeCD、NGD、NTD和NUD中的一种或两种以上，它们的化学结构如下：
所述可利用甲酸化合物的酶表达在微生物的细胞内，而NAD类似物及甲酸化合物进入细胞，NAD类似物还原反应在细胞内进行。
2.按照权利要求1所述的还原方法，其特征还在于：所述甲酸化合物为甲酸、甲酸盐、氘代甲酸、氘代甲酸盐中的一种或两种以上的任意比组合。
3. 按照权利要求1所述的还原方法，其特征还在于：缓冲体系中甲酸脱氢酶的终浓度为4μg/mL-500μg/mL、NAD类似物的终浓度为0.01mM-20mM、甲酸化合物的终浓度为0.4mM -25mM，所述的缓冲体系为磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，HEPES缓冲液，MES缓冲液，PIPES缓冲液中的一种或两种以上。
4.按照权利要求1所述的还原方法，其特征还在于： NAD类似物还原得到的还原态产物，可被其他酶用作辅酶应用于还原反应，所述其他酶为下述中的一种或两种以上：催化丙酮酸还原为苹果酸的苹果酸酶ME-L310R/Q401C、催化丙酮酸还原为乳酸的乳酸脱氢酶DLDH-V152R、催化乙醛还原为乙醇的酿酒酵母醇脱氢酶。
5.按照权利要求1或4所述的还原方法，其特征还在于：还原型NAD类似物为ME-L310R/Q401C，DLDH-V152R或酿酒酵母醇脱氢酶提供还原型辅酶时，采用pH5–8的缓冲体系，反应温度10-40℃。
6. 按照权利要求1 所述的还原方法，其特征还在于：所述微生物为大肠杆菌，乳酸乳球菌、酿酒酵母或里氏木霉。
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